一株腸道分離的噬菌體對(duì)臨床金黃色葡萄球菌裂解作用的評(píng)價(jià)*

李玉憶 高玉錄

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇省昆山市 215300

金黃色葡萄球菌是臨床常見(jiàn)的重要病原菌之一,尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。MRSA感染具有難治療和高死亡率的特點(diǎn),已經(jīng)給全球醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。由于它對(duì)最常用抗生素的耐藥性,MRSA感染患者的治療選擇非常有限[2]。近幾十年來(lái)還出現(xiàn)了MRSA對(duì)萬(wàn)古霉素以及相對(duì)較新的藥物如利奈唑胺和達(dá)托霉素的抗性[3],使得治療非常棘手。目前,噬菌體療法是一種治療MRSA極具前景的抗生素替代方案,正以其高效力和高特異性,重新得到人們的關(guān)注。而噬菌體治療的成功取決于所分離的噬菌體特性及其與宿主的適應(yīng)性。本研究旨在評(píng)估分離源自病人腸道的噬菌體在治療金黃色葡萄球菌感染中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)條件 本研究采用的1～60號(hào)菌為從本院臨床標(biāo)本中分離并保存的金黃色葡萄球菌菌株,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300為微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控保存的菌株。所有細(xì)菌都在血平板上37℃生長(zhǎng)。

1.2 噬菌體分離 收集本院金黃色葡萄球菌感染的病人的新鮮糞便5g,加入100ml普通液體培養(yǎng)基內(nèi),于37℃溫箱孵育過(guò)夜。次日70℃加熱30min后離心15min,上清液通過(guò)0.22μm的膜過(guò)濾器(Millipore)滅菌。將10ml樣品與指數(shù)期宿主細(xì)胞(金黃色葡萄球菌ATCC43300)加入10ml胰蛋白酶大豆肉湯(TSB,Sigma)中,在37℃、140r/min條件下孵育過(guò)夜。次日將混合液4℃離心15min,上清液通過(guò)0.22μm膜過(guò)濾器滅菌。將1ml過(guò)濾后的有效樣品上清液與宿主細(xì)胞和5ml軟瓊脂(Oxoid)充分混合,然后將其覆蓋在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上(TSA,Sigma),在37℃孵育過(guò)夜。當(dāng)觀察到清晰的嗜菌斑后,取單個(gè)斑塊加入3ml含宿主菌株的TSB中于37℃、140r/min下孵育過(guò)夜。重復(fù)雙瓊脂層法直到只存在單一的嗜菌斑。分離后的噬菌體于SM緩沖液(Phygene)中4℃保存。

1.3 細(xì)菌鑒定和抗菌藥物敏感性分析 采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏儀VITEK2 Compact(生物梅里埃)依照設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Cinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.4 噬菌體宿主范圍分析 將0.1ml的過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物(OD600=0.1)加入5ml的軟瓊脂中,然后覆蓋在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(Oxoid)上,待凝固后將純化的噬菌體點(diǎn)到每個(gè)細(xì)菌平板上,37℃孵育過(guò)夜后觀察噬菌斑形成情況。

1.5 大蠟螟幼蟲(chóng)模型 大蠟螟幼蟲(chóng)(新盛生物技術(shù)有限公司)儲(chǔ)存在4℃的黑暗環(huán)境中,使用時(shí)選擇重量在200～300mg之間的健康幼蟲(chóng)。取隔夜細(xì)菌培養(yǎng)物OD600為0.3,用10μl Hamilton注射器(Fisher Scientific)將5μl稀釋的細(xì)菌懸浮液注入每只幼蟲(chóng)右腿。感染2h后,向治療組的幼蟲(chóng)對(duì)側(cè)前腿注射5μl的噬菌體。對(duì)照組未予噬菌體治療。注射后的幼蟲(chóng)在37℃培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。每組隨機(jī)分配10只幼蟲(chóng)。另設(shè)一個(gè)空白組沒(méi)有接受任何注射,一個(gè)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)組只注射PBS以評(píng)估與創(chuàng)傷有關(guān)的死亡。每24h記錄一次存活率并持續(xù)7d,當(dāng)幼蟲(chóng)變黑或?qū)τ|摸無(wú)反應(yīng)時(shí)標(biāo)記為死亡。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的重復(fù),結(jié)果以生存曲線(xiàn)的形式呈現(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software Inc., CA)分析數(shù)據(jù)。用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析大蠟螟蟲(chóng)的存活率,以P≤0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 從腸道樣本中成功分離出可裂解標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300的噬菌體SY01對(duì)于臨床金葡菌具有不同的裂解作用。無(wú)嗜菌斑形成(-)的菌株有33.3%(20/60),可見(jiàn)噬菌斑形成的菌株占66.7%(40/60)。其中,根據(jù)噬菌斑情況(見(jiàn)圖1)分類(lèi),噬菌斑+占21.7%(13/60),噬菌斑++占35%(21/60),噬菌斑+++占10%(6/60),見(jiàn)表1。

(+) (++) (+++)

表1 臨床金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素耐藥性及噬菌體SY01對(duì)MRSA、MSSA的作用 60株臨床金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性分析顯示,大多數(shù)菌株對(duì)所檢測(cè)的多種抗生素耐藥。其中對(duì)苯唑西林耐藥率78.3%,即MRSA占78.3%(47/60),對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)占21.7%(13/60),對(duì)紅霉素耐藥率為80%(48/60),未檢測(cè)到對(duì)萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥(0/60),見(jiàn)表1。噬菌體敏感性分析顯示46.2%(6/13)的MSSA和72.3%(34/47)的MRSA對(duì)SY01噬菌體敏感,兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明噬菌體SY01具有較寬的裂解宿主范圍,對(duì)MRSA和MSSA均有裂解作用。

2.3 噬菌體SY01治療對(duì)金黃色葡萄球菌感染大蠟螟幼蟲(chóng)生存率的影響 感染金黃色葡萄球菌ATCC43300后,對(duì)照組的幼蟲(chóng)在3d內(nèi)全部死亡。使用噬菌體SY01的治療組在第3天存活率為40%,第7天存活率為10%(P<0.05)?？瞻捉M和PBS組的7d存活率分別為100%和90%,兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明注射引起的損傷與幼蟲(chóng)死亡率無(wú)關(guān)。

3 討論

本研究從病人腸道分離一株可裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體SY01,并通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了其治療金葡菌感染的潛在應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示,此次分離的噬菌體SY01可以裂解近2/3臨床金葡菌菌株,表現(xiàn)出較寬的裂解宿主范圍,多重耐藥的臨床菌株對(duì)該噬菌體表現(xiàn)出較好的敏感性,MRSA的敏感性高達(dá)72.3%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,金葡菌感染后的幼蟲(chóng)經(jīng)該噬菌體治療7d存活率高于對(duì)照組,提示該噬菌體具有抗金黃色葡萄球菌感染的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)中有1/3的臨床金黃色葡萄球菌菌株表現(xiàn)出對(duì)該噬菌體耐受,表明細(xì)菌抵抗噬菌體機(jī)制的存在?？傮w來(lái)說(shuō)噬菌體感染的過(guò)程包括五個(gè)階段,分別為附著、攝取、生物合成、組裝和裂解[4]。目前關(guān)于葡萄球菌的噬菌體抗性研究關(guān)注于附著、生物合成和組裝這三個(gè)階段:(1)噬菌體感染的首個(gè)步驟是噬菌體附著在葡萄球菌細(xì)胞的外部。如果細(xì)菌表面的受體分子不存在或被阻斷,噬菌體無(wú)法識(shí)別受體從而影響它的吸附。受體的相關(guān)突變可以通過(guò)抑制噬菌體吸附而導(dǎo)致噬菌體抗性的產(chǎn)生。分子研究顯示,通過(guò)刪除參與壁磷壁酸(WTA)生物合成的第一個(gè)基因,十一烯丙基磷酸N-乙酰葡糖胺1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(tagO),金黃色葡萄球菌表面的主要受體發(fā)生改變,從而表現(xiàn)出對(duì)測(cè)試的噬菌體(Φ812和ΦK)的抵抗[5]。(2)其次,在噬菌體的生物合成階段中可能存在抵抗機(jī)制。限制性修飾(R-M)系統(tǒng)是金黃色葡萄球菌感染的一個(gè)重要障礙,它能通過(guò)降解注入的噬菌體DNA來(lái)干擾其生物合成[6]。所有四種類(lèi)型的R-M系統(tǒng)都存在于金黃色葡萄球菌中:Ⅰ型R-M系統(tǒng)是金葡菌中最豐富的R-M系統(tǒng)類(lèi)型,其次是Ⅳ型和Ⅱ型系統(tǒng),Ⅲ型系統(tǒng)很罕見(jiàn)[7]。R-M系統(tǒng)是一個(gè)模塊化操作子,包含編碼三種功能的宿主特異性決定因素(hsd)的組合[8]。毒素—抗毒素(T-A)系統(tǒng)也通過(guò)干擾噬菌體的生物合成在細(xì)菌的抗噬菌體過(guò)程中起作用。例如Ⅲ型ToxN/Iyizhi對(duì)抗噬菌體A2M1[9],Ⅳ型系統(tǒng)AbiE/Id對(duì)抗多種噬菌體[10]。本研究組發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌T-A系統(tǒng)相關(guān)位點(diǎn)SAUSA300_2026的突變導(dǎo)致噬菌體敏感性改變,證明了Ⅱ型T-A系統(tǒng)在金黃色葡萄球菌防御噬菌體中的重要作用[11]。此外,另一種細(xì)菌的防御方式是簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPRs),它以序列特異性方式裂解外部DNA從而獲得對(duì)噬菌體感染的免疫力[12]。(3)再者,在噬菌體進(jìn)入細(xì)菌通過(guò)宿主環(huán)境合成所需元件后的組裝過(guò)程中也可能受到外來(lái)因素的干擾,導(dǎo)致噬菌體的組裝發(fā)生錯(cuò)誤而影響其進(jìn)一步增殖。研究顯示SaPI在搶奪噬菌體組裝元件過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[13]。 最近,Doron等人在研究中發(fā)現(xiàn)了26個(gè)新的細(xì)菌抗噬菌體防御系統(tǒng)[4],在10個(gè)驗(yàn)證的抗噬菌體防御系統(tǒng)中有5個(gè)在葡萄球菌基因組中有關(guān)聯(lián),這可能意味著更多的防御機(jī)制和金葡菌抵抗噬菌體作用有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的臨床菌株9號(hào)、14號(hào)、26號(hào)較標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)該噬菌體更加敏感,對(duì)其深入研究可能揭示更多噬菌體宿主適應(yīng)性的信息。

然而本研究依然存在局限性,例如未進(jìn)行噬菌體SY01的測(cè)序和分類(lèi),無(wú)法全面了解其生物學(xué)特性;未對(duì)相關(guān)噬菌體敏感和耐受的臨床菌株進(jìn)行基因分型以揭示各個(gè)不同特征臨床菌株對(duì)噬菌體敏感性的聯(lián)系,這也是本研究將來(lái)繼續(xù)進(jìn)行的課題。

本研究從病人腸道分離得到一株可以裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體,并針對(duì)此噬菌體對(duì)臨床菌株的裂解作用進(jìn)行評(píng)價(jià),揭示了此噬菌體對(duì)臨床金黃色葡萄球菌的裂解能力不受細(xì)菌耐藥性的局限,體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),該噬菌體在臨床MSSA和MRSA中均有較好的活性,具有治療臨床金黃色葡萄球菌感染的潛在能力。