胃癌腫瘤突變負荷相關(guān)差異基因的研究*

安覃景 劉 麗 李曉松

首都醫(yī)科大學石景山教學醫(yī)院 北京市石景山醫(yī)院檢驗科,北京市 100043

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一,目前其主要的治療方法是手術(shù)切除和放化療,現(xiàn)有的治療方法對正常組織和細胞都有較大的損傷且治愈率較低[1],因此對于胃癌患者來說,選擇合適的治療方法顯得更為重要。而免疫治療目前已成為一種新興的治療方法,其對患者影響小,治愈率較高。免疫治療的主要方式是激發(fā)患者自身免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷和清除作用,從而起到治療作用。胃癌的腫瘤突變負荷(Tumor Mutation Burden, TMB)是影響免疫治療的關(guān)鍵因素之一,其反映了基因的突變密度,其與免疫反應之間存在一定的相關(guān)性,TMB越高,其突變的細胞越多,免疫系統(tǒng)越容易發(fā)現(xiàn),則免疫治療效果越好[2]。以往的研究對胃癌的TMB進行分析,僅發(fā)現(xiàn)了高 TMB 的患者生存及預后較好,但未明確找到影響TMB高低的Hub關(guān)鍵基因,從而不能為治療方式的選擇提供幫助。因此本研究以胃癌TMB為研究對象,篩選出影響胃癌腫瘤突變負荷高低的Hub關(guān)鍵基因,旨在為其靶向免疫治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究的所有TMB數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)均來自癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫。共納入 441 例病例,本研究完全符合TCGA提供的發(fā)表指南。

1.2 高低TMB差異基因分析 使用 R 軟件中的“l(fā)imma”包對高低腫瘤突變負荷進行差異基因分析。根據(jù) TMB 中值確定高和低 TMB 組,大于中值為高TMB組,小于中值為低TMB組。這項研究的截止值是|log2foldChange|>1.0 且調(diào)整后的P<0.05。

1.3 基因本體富集分析及KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析 使用R軟件(3.6.0版)中的“clusterProfiler”包對獲得的差異基因進行基因本體富集分析和KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析。截止值調(diào)整為P<0.05。

1.4 TMB與生存的關(guān)系 本研究使用 R 軟件的“survival”包(版本 3.6.0)對高低 TMB 樣本進行生存分析。當P<0.05 時,差異具有統(tǒng)計學意義。

1.5 統(tǒng)計學方法 本研究所有數(shù)據(jù)分析均使用R 3.6.0軟件進行統(tǒng)計學分析,所使用的數(shù)據(jù)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人口特征 該研究共納入 32 個正常樣本和 375 個腫瘤樣本,總共來自 441 例病例。

2.2 差異分析基因 根據(jù)TMB值對mRNAs表達數(shù)據(jù)進行分組,對TMB高低組進行差異基因分析,根據(jù)篩選條件發(fā)現(xiàn)了491個差異基因。

2.3 GO富集分析和KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析 對mRNAs表達數(shù)據(jù)的高、低TMB組的差異基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)它們主要集中在3個途徑:生物過程(Biological Process,BP)、細胞成分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF),具體結(jié)果見圖1。同時,對KEGG信號轉(zhuǎn)導通路進行了分析,見圖2。最后,還進行了PPI分析,發(fā)現(xiàn)7個Hub基因為MYH11、TAC1、ALB、AOX1、DMD、FGFR1、IGF1,見圖3。

圖1 GO富集分析

圖2 KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析

2.4 生存分析 對高、低TMB組進行的生存分析顯示,高TMB組的5年生存率顯著高于低TMB組(P=0.007)。 其中,高TMB組為41.8%,低TMB組為28.3%,見圖4。

圖4 生存分析

3 討論

胃癌是全世界較為常見的消化道腫瘤之一,也是亞洲國家每年癌癥相關(guān)死亡的主要原因,在中國大多數(shù)患者被診斷時多已發(fā)展為晚期疾病,生存率低且預后較差[3]。TMB是反映機體對免疫反應的大小的一項指標,體細胞突變的積累是腫瘤發(fā)生的主要原因之一,并有助于新抗原的表達,新抗原通過識別腫瘤細胞上的靶抗原,激活T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用,其不僅可以影響腫瘤的發(fā)生、進展和治療耐藥性,而且還能促進免疫檢查點阻斷劑療法的反應預測。然而目前與其相關(guān)的關(guān)鍵基因尚未明確,因此本研究對胃癌TMB進行分析,以期找到相關(guān)差異基因,從而為胃癌的治療提供新思路。

本研究中GO富集分析主要集中在肌肉收縮、細胞外基質(zhì)和肝素結(jié)合等,而KEGG信號轉(zhuǎn)導通路分析發(fā)現(xiàn)涉及的通路包括血管平滑肌收縮、擴張型心肌病等,這與以往的研究結(jié)果一致[4-5]。

在本研究中,發(fā)現(xiàn)了高低負荷組之間的差異表達基因中的最為關(guān)鍵的7個Hub基因是MYH11、TAC1、ALB、DMD、FGFR1、IGF1和AOX1。

肌球蛋白重鏈11(Myosin Heavy Chain 11,MYH11)基因產(chǎn)物是一個六聚體蛋白的亞基,由兩個重鏈亞基和兩對不相同的輕鏈亞基組成。Wang J等[6]的研究表明MYH11通過結(jié)合TNFRSF14啟動子抑制TNFRSF14的表達,而TNFRSF14可逆轉(zhuǎn)MYH11對胃癌細胞惡性表型的抑制作用。He F等[7]進行了胃癌的WGCNA分析,發(fā)現(xiàn)了與衰老分子表型相關(guān)的關(guān)鍵基因(ACTA2、CALD1、LMOD1、MYH11、MYL9、MYLK和TAGLN),這些基因在腫瘤中特異性上調(diào),與預后不良相關(guān)。在本研究中,MYH11在低突變負荷中高表達,從而不被免疫細胞識別,導致預后不良,這與之前的結(jié)果一致。速激肽1(Tachykinin-1,TAC1)通過選擇性剪接、轉(zhuǎn)錄編碼神經(jīng)肽物質(zhì)P、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)肽K和γ,主要參與胃分泌、運動、黏膜免疫和細胞增殖。David S等[8]采用實時熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)了胃癌患者中TAC1甲基化更為普遍 (P<0.01)。另外,還有研究表明TAC1啟動子高甲基化在食管癌中較為常見,發(fā)生較早,與食管腺癌發(fā)生的其他進展危險因素相關(guān),是ESCC預后不良的組織生物標志物[9]。在本研究中,TAC1在低突變負荷中高表達,不易被免疫細胞識別,因此更易導致患者預后不良。白蛋白(Albumin,ALB)是反映機體營養(yǎng)狀況的一項很重要的指標。Alkurt EG等的研究表明較高的術(shù)前CRP/ALB的比值可以預測局部晚期胃癌患者的不良預后[10]。在本研究中,ALB在高突變負荷中高表達,更容易被免疫細胞識別,患者預后較好。

DMD是一個具有 79 個外顯子的大基因,可編碼肌肉必需的抗肌萎縮蛋白,這是一種突變會導致肌肉紊亂的基因。在骨骼肌外,DMD最主要和普遍存在的基因產(chǎn)物是Dp71,其中至少有14個剪接亞型已被鑒定。Tan S等[11]的研究表明104例胃癌患者中,72.2%的患者Dp71表達被抑制,而Dp71表達降低與腫瘤分化程度(P=0.001)和淋巴管侵犯程度(P= 0.041)顯著相關(guān)。在本研究中,DMD在胃癌的低突變負荷中高表達,這可能會使癌細胞遷徙、侵襲和增殖變快,從而導致患者預后較差,這與之前的結(jié)果一致。成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)家族由FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4 4個成員組成,它們通過與成纖維細胞生長因子(FGFs)相互作用激活,導致下游信號通路的激活,其中FGFR1屬于酪氨酸受體激酶,具有多種生物學功能,如增殖、生存、遷移和分化等。另外還有研究表明,FGFR1基因的下調(diào)可抑制胃癌細胞的惡性表型,其高表達與腹腔灌洗細胞學和同步的腹膜播散陽性以及預后不良顯著相關(guān)[12]。在本研究中,其在胃癌的低突變負荷中高表達,胃癌細胞增殖侵襲變快,患者預后較差。

胰島素樣生長因子1 (Insulin-like Growth Factor 1,IGF1)是肌肉和骨骼發(fā)育所必需的,也是生長激素作用的主要介質(zhì)。Li H等[13]的研究表明IGF1通過GSK-3β和ZEB2誘導BGC-823胃癌細胞系上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化,從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。在本研究中其在低突變負荷中高表達,使癌細胞更易轉(zhuǎn)移擴散,患者預后較差。

醛氧化酶1(Aldehyde Oxidase 1,AOX1)是一種具有廣泛底物的氧化酶,包括多種芳香氮雜環(huán)和醛。此外,它還參與藥物前體的生物活化、氧平衡的調(diào)節(jié)、一氧化氮的產(chǎn)生和脂肪的形成。Narci K等[14]發(fā)現(xiàn)AOX1和AGER作為PI3K/Akt/mTOR通路的靶點參與了這種聯(lián)合增殖作用,siRNA敲除AOX1和AGER后,肝細胞癌的細胞增殖明顯降低。但目前尚無AOX1在胃癌方面的研究,本文發(fā)現(xiàn)AOX1在胃癌的低突變負荷中高表達,其不易被免疫細胞識別,更易進行細胞侵襲、增殖,導致患者預后較差。

綜上所述,本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌數(shù)據(jù)進行腫瘤突變負荷的相關(guān)差異基因分析,篩選出了7個Hub關(guān)鍵基因,其中首次發(fā)現(xiàn)AOX1基因可能在胃癌的進展中發(fā)揮著重要作用,針對關(guān)鍵基因選擇靶向治療,可能會產(chǎn)生更好的效果,這為胃癌的免疫治療提供了新思路。