溶血磷脂酸（LPA）對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制的初步探討

趙燕穎， 韓振琦， 鄒艷平， 李云鵬， 徐 濤， 劉麗艷， 程海濤

1 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡科， 長(zhǎng)春 130021； 2 吉林省一汽總醫(yī)院消化內(nèi)科， 長(zhǎng)春 130011

目前肝癌的復(fù)發(fā)率仍較高，如何更好的預(yù)防肝癌和開(kāi)發(fā)新的治療方法是臨床有待于攻克的難題［1］。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一種生物活性磷脂介質(zhì)，在體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中引起多種生物學(xué)效應(yīng)，如參與心臟成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，促進(jìn)平滑肌收縮［2］、參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移。研究［3-4］報(bào)道LPA 在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本文主要是探討LPA 與肝癌惡性進(jìn)展作用的相關(guān)性以及具體機(jī)制，并就LPA 相關(guān)的信號(hào)通路在肝癌靶向治療中的前景進(jìn)行討論。

1 資料和方法

1.1 ELISA法測(cè)定LPA

1.1.1 研究對(duì)象 選取2016 年1 月—2022 年12 月吉林省一汽總醫(yī)院診治的伴有腹腔積液的肝癌患者26例，男16例，女10例，年齡39～70歲。另選取伴有腹腔積液的肝硬化（Child-Pugh B 級(jí)18 例，Child-Pugh C 級(jí)10例）患者28例（其中酒精性肝硬化患者17例，肝炎肝硬化患者11例），男19例，女9例，年齡38～68歲。同時(shí)體檢中心選28例健康人群（男16例，女12例，年齡38～66歲）作為對(duì)照組。所有腹腔積液患者中移動(dòng)性濁音界于鎖骨中線與腋中線的二度者占64.3%，移動(dòng)性濁音超出鎖骨中線的三度者占35.7%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有除肝癌以外的其他腫瘤患者；（2）已知或可能懷孕者、哺乳期婦女；（3）嚴(yán)重心、腎功能異常，及有腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作及外周深靜脈血栓形成者。

1.1.2 LPA測(cè)定方法 全部受驗(yàn)者均于清晨空腹采血取樣2～4 mL，有腹腔積液的患者抽取腹腔積液10 mL。所有標(biāo)本均于采集后30 min內(nèi)3000 r/min離心10 min，仔細(xì)收集上清，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)血清LPA 含量。LPA≥3.2 μmol/L 設(shè)為陽(yáng)性，＜3.2 μmol/L 設(shè)為陰性。

1.2 體外試驗(yàn)主要儀器設(shè)備和試劑 CO2孵箱、蛋白電泳、實(shí)時(shí)定量PCR 及顯影系統(tǒng)。DMDM 培養(yǎng)基、小牛血清（Gbico 公司）、LPA（MSK 公司）、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）（Sigma 公司）、結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich 公司）、小鼠抗人β-actin、P53 抗體（北京中杉金橋）。鼠抗人FAK、RhoA 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司，辣根酶標(biāo)記抗生物素IgG 抗體、Western Blot Luminol Reagent 和PVDF 膜均購(gòu)自美 國(guó)SantaCruz 公司。DAB 顯色試劑盒購(gòu)自中杉公司。RNA 提取試劑及RT-qPCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC7721人肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞在DMDM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，鏈霉素100 mg/L）中，5%CO2孵箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿(mǎn)細(xì)胞瓶底面80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4 MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按照5×103個(gè)細(xì)胞/孔將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合后分組：空白對(duì)照組（只加無(wú)血清培養(yǎng)基）、LPA 組（含12.5、25、50 μmol/L LPA 的無(wú)血清培養(yǎng)基）、PTX 組（PTX 是LPA 拮抗劑，濃度為100 μg/L）、LPA+PTX 組（100 μg/L PTX和濃度為50 μmol/L的LPA）。

分別于加藥后24、48 和72h，每孔加入15 μL MTT（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO（150 μL/孔），振蕩10 min后采用酶標(biāo)儀（570 nm）測(cè)定吸光度（A）值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值）×100%。每組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 取一無(wú)菌96孔培養(yǎng)細(xì)胞板，每孔加入約100 μL 的Matrigel 膠，置于4 ℃冰箱。約12 h后吸出上清液。用含5%血清的封閉液室溫封閉約30 min。用移液器取1×105細(xì)胞接種于之前用Matrigel 膠包被的孔中分組實(shí)驗(yàn)，分組與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相同。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用移液器輕輕吸出上層培養(yǎng)液。取100 μL含結(jié)晶紫溶液加入孔中，室溫靜置15 min染色。洗滌2次后靜置培養(yǎng)板至其干燥。最后用移液器取100 μL 含5%SDS的乙醇滴入培養(yǎng)細(xì)胞的孔中，靜置約30 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，并定量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SMMC7721 肝癌細(xì)胞分組處理：LPA 組（終濃度為50 μmol/L），LPA+PTX 組（50 μmol/L LPA 和100 μg/L PTX），對(duì)照組（只加無(wú)血清培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用Trizol 裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280值評(píng)價(jià)提取RNA 質(zhì)量與純度，定量后各組取2 μg 總RNA 應(yīng)用cDNA 合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)RNA 表達(dá)水平，均按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。各基因的合成引物分別為：RhoA 上游引 物5'-TTCAGCAAAGACCAAAGATGGA-3'，下 游 引物5'-CACAAGACAAGGCACCCAGA-3'；p53 上游引物5'-GTGGTGGTGCCCTATGAG-3'；下 游 引 物 5'-GGGAGGTAGACTGACCCTTT-3'；FAK 上 游 引 物5'-GCCTGGTGAAAGCTGTCATC-3'；下 游 引 物 5'-GCTTCTGTGCCATCTCAATC-3'；GAPDH 上游引物5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3'，下 游 引 物5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'。對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 Western Blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SMMC7721肝癌細(xì)胞分組處理，分組同RT-PCR實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS 洗1次，加4 ℃的裂解液（按1×107個(gè)細(xì)胞加入100 μL），超聲粉碎細(xì)胞，低溫離心后取上清液-80 ℃凍存。為確保蛋白上樣量一致，樣品中蛋白經(jīng)Bradford定量，然后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液100 ℃煮沸變性，樣品中蛋白通過(guò)12%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉4 ℃過(guò)夜；分別加入兔抗人P53，F(xiàn)AK，RhoA 和β-actin 抗體（1∶500），4 ℃過(guò)夜；用TBST 洗膜10 min，3次，加入1∶2 000 稀釋的羊抗兔二抗，振搖1 h，TBST 洗膜，DAB 顯色、拍照。分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組LPA 水平比較 （1）肝癌組血漿LPA 水平（4.99±0.55）μmol/L 明顯高于肝硬化組（2.63±0.43）μmol/L 及對(duì)照組（1.61±0.39）μmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。肝硬化組與健康對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）肝硬化組2例腹腔積液LPA 值較高，但仍低于肝癌組LPA 水平。肝癌組腹腔積液LPA水平（5.19±0.63）μmol/L明顯高于肝硬化組（2.91±0.46）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 肝癌、肝硬化患者以及正常人群LPA的表達(dá)水平Table 1 Expression level of LPA in patients with liver cancer， liver cirrhosis and normal people

2.2 各組SMMC7721細(xì)胞增殖情況 對(duì)照組、（12.5、25、50 μmol/L）LPA 組、PTX 組 以 及LPA+PTX 組 的SMMC7721細(xì)胞24、48 和72 h 的增殖率具體如圖1 所示。LPA 可明顯促進(jìn)SMMC7721 細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖率隨劑量和時(shí)間增加而增加，尤其中高劑量組增殖率明顯高于對(duì)照組，具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性，隨著給藥劑量和時(shí)間的增加，增殖率逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而PTX 抑制其增殖能力，且具有時(shí)間依賴(lài)性，對(duì)照組和LPA 組細(xì)胞增殖率明顯高于PTX 組，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72 h高劑量LPA組的增殖率是對(duì)照組的3.6倍，PTX組是對(duì)照組的0.6倍，二者聯(lián)合組是對(duì)照組的1.2倍。高劑量組LPA 聯(lián)合PTX 組細(xì)胞增殖率有所增加，但和對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。說(shuō)明LPA拮抗了PTX抑制細(xì)胞增殖的作用，這再次證明了LPA 有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力。

圖1 各組SMMC7721細(xì)胞增殖情況Figure 1 The proliferation of SMMC7721 cells in each group

2.3 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了LPA 和PTX 對(duì)SMMC7721 肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和黏附能力的影響（圖2）。與對(duì)照組相比，加入LPA的SMMC7721細(xì)胞黏附能力明顯增加，提示LPA能增加細(xì)胞黏附能力。LPA的拮抗劑PTX能明顯降低SMMC7721細(xì)胞黏附能力，LPA可增加肝癌細(xì)胞的遷襲能力，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但加用較高劑量LPA 和PTX 的聯(lián)合組SMMC7721細(xì)胞的黏附能力與對(duì)照組比變化不明顯。LPA能增加肝癌細(xì)胞黏附能力，PTX 作為L(zhǎng)PA 的拮抗劑抑制肝癌細(xì)胞的黏附，抑制其遷移。結(jié)果表明隨時(shí)間增加上述能力增加，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72 h 高劑量LPA 的遷襲率是對(duì)照組的3.09倍，PTX 組是對(duì)照組的0.4倍，二者聯(lián)合組是對(duì)照組的0.99倍。

圖2 各組SMMC7721細(xì)胞侵襲、遷移和黏附能力Figure 2 Adhesion ability of SMMC7721 cells in each group

2.4 qPCR 結(jié)果 與對(duì)照組相比，50 μmol/L 的LPA 作用SMMC7721細(xì)胞48 h后，細(xì)胞P53基因mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，而RhoA 和FAK 基因mRNA 表達(dá)量增加。LPA 組和對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPA+PTX 組的P53、RhoA 和FAK 基因表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 各組SMMC7721細(xì)胞P53、FAK、RhoA基因表達(dá)情況Figure 3 Expression of P53， FAK and RhoA genes in SMMC7721 cells

2.5 Western Blot 結(jié)果 同等內(nèi)參β-actin 水平下，LPA 組SMMC7721細(xì)胞P53蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的20.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），LPA+PTX 組P53 蛋白表達(dá)水平有所升高，但仍低于對(duì)照組。LPA組SMMC7721 細(xì)胞的RhoA、FAK 蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的161.1%和153.9%，兩組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），LPA+PTX 組RhoA、FAK 蛋白表達(dá)水平和對(duì)照組無(wú)明顯差異。LPA能明顯降低P53蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)增加SMMC7721 細(xì)胞的RhoA 和FAK蛋白表達(dá)水平（圖4）。

圖4 各組SMMC7721細(xì)胞P53、FAK、RhoA蛋白表達(dá)情況Figure 4 Expression of P53， FAK and RhoA in SMMC7721 cells

3 討論

LPA 最早是從卵巢癌患者的腹腔積液中分離純化出的［5-6］，LPA 是血清中的正常成分，體液當(dāng)中如血清、唾液和腫瘤患者腹水中都存在LPA。LPA 及其受體在一些腫瘤中的異常高表達(dá)表明LPA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起一定作用，LPA 可誘導(dǎo)多種細(xì)胞增殖，可增加腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。LPA 作為一種多功能的生物活性磷脂分子，能夠參與調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為［8］。

本研究通過(guò)ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中LPA 水平明顯高于肝硬化患者和正常人群，而且肝癌患者腹腔積液中的LPA 水平明顯高于肝硬化患者腹腔積液中的表達(dá)水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，再次證明了LPA 在肝癌患者中有異常高表達(dá)，可作為肝癌腫瘤預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)［9］。

腫瘤細(xì)胞中有廣泛的LPAR1表達(dá)，并且能夠通過(guò)激活MAPK、Akt和Rho信號(hào)通路等方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移［10］，同時(shí)LPAR1 能夠下調(diào)腫瘤抑制因子p53的表達(dá)情況［11］。LPAR2 可通過(guò)激活Rho、Ras、Rac、MAPK、PLC 和PI3K 等信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和增殖。LPA能夠通過(guò)與其緊密連接的受體激活下游多條信號(hào)通路，其中RhoA/ROCK信號(hào)通路在LPA信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。有研究［12］報(bào)道野生型的p53基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但突變的p53基因可能通過(guò)激活RhoA 的這條途徑，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控。FAK是一種位于胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶，F(xiàn)AK 涉及到細(xì)胞的黏附、播散、遷移和凋亡表達(dá)，有研究［13］顯示在多種腫瘤中有FAK的過(guò)度表達(dá)，包括起源于肝臟、直腸、肺部等腫瘤。FAK可能在肝癌相關(guān)通路調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的存活、增殖，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞與其他促進(jìn)細(xì)胞遷移細(xì)胞因子如RhoA 的相互作用過(guò)程。FAK 會(huì)調(diào)控RhoA 的激活，RhoA 可以介導(dǎo)FAK的磷酸化作用，激活細(xì)胞遷移信號(hào)通路［14-17］。既往研究［18-19］顯示肝癌細(xì)胞中RhoA 蛋白的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞?；谏鲜稣擖c(diǎn)，本文研究了LPA對(duì)肝癌細(xì)胞中RhoA、FAK 和野生型P53基因和蛋白的影響，進(jìn)一步明確LPA 的作用機(jī)制。本研究通過(guò)RTqPCR 和Western Blot 實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)LPA 處理的肝癌細(xì)胞中RhoA、FAK基因和蛋白表達(dá)明顯增加，同時(shí)，LPA可以抑制野生型P53 基因和蛋白的表達(dá)，與既往研究［20］結(jié)果一致。

PTX 對(duì)LPA 有較明顯的阻斷效應(yīng)，PTX 能拮抗LPA 對(duì)上述基因和蛋白的作用。本研究通過(guò)MTT 細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加用LPA 抑制劑PTX 后細(xì)胞增殖和黏附能力明顯下降，且明顯低于對(duì)照組。LPA 和PTX 互相拮抗，LPA 對(duì)細(xì)胞增殖和黏附、遷移能力有明顯的促進(jìn)作用，提示LPA 能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和黏附、遷移作用，從而誘發(fā)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021 年經(jīng)由吉林省一汽總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：SB-2021-014。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙燕穎負(fù)責(zé)撰寫(xiě)文章；鄒艷平、李云鵬、徐濤、劉麗艷參與了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；程海濤指導(dǎo)文章撰寫(xiě)過(guò)程；韓振琦負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。