血清補(bǔ)體C3對(duì)原發(fā)性膽汁性膽管炎相關(guān)肝纖維化分期的診斷價(jià)值

周 輝， 牛 斌， 宓余強(qiáng)， 劉勇鋼， 李 萍

1 天津醫(yī)科大學(xué)第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院， 天津 300070； 2 天津市第二人民醫(yī)院 a.肝病科， b.病理科，天津 300192

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC，舊稱(chēng)原發(fā)性膽汁性肝硬化）是一種慢性自身免疫性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病。盡管PBC 比較少見(jiàn)，但它對(duì)患者的生活質(zhì)量和生存率有重大影響，且PBC 的全球患病率正呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［1］。由于長(zhǎng)期膽汁淤積，PBC 可出現(xiàn)進(jìn)行性肝纖維化、肝硬化，最終可演變?yōu)榻K末期肝病。免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)通常用于PBC 的評(píng)估，本文主要分析了血清補(bǔ)體C3在PBC患者中的變化及其與肝纖維化分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2022年10月于天津市第二人民醫(yī)院就診并行肝穿刺活檢的PBC 患者108 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合PBC 診斷和治療共識(shí)［2-3］的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）進(jìn)行肝穿刺活檢；（3）在肝活檢1周內(nèi)行血清學(xué)檢測(cè)；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他慢性肝病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、重疊綜合征、原發(fā)性硬化性膽管炎、IgG4相關(guān)膽管炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷等；（2）肝移植者；（3）有惡性腫瘤史或其他終末期疾病者；（4）孕產(chǎn)婦；（5）患有影響血補(bǔ)體C3水平的相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、過(guò)敏性哮喘、非典型溶血性尿毒綜合征、遺傳性補(bǔ)體缺陷病等。

1.2 研究方法

1.2.1 觀(guān)察指標(biāo) 采用回顧性分析的方法，收集患者的一般人口學(xué)資料（年齡、性別、BMI 等）、臨床表現(xiàn)（乏力、納差、瘙癢等）、自身抗體指標(biāo)（ANA、AMA、M2、Sp100、Gp210）、肝穿刺活檢1 周內(nèi)的血清學(xué)指標(biāo)（PLT、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、Alb、TBil、DBil、

IBil）、免疫功能指標(biāo)（C3、C4、IgG、IgA、IgM）、肝纖維化指標(biāo)（LSM）及無(wú)創(chuàng)肝纖維化評(píng)分［（AST/ALT比值指數(shù)（AAR）、AST/PLT 比值指數(shù)（APRI）和肝纖維化4 因子指數(shù)（FIB-4）］。

1.2.2 組織學(xué)評(píng)估 所有患者均在局部麻醉狀態(tài)下，經(jīng)超聲引導(dǎo)進(jìn)行肝組織穿刺，標(biāo)本長(zhǎng)度為1.0～2.0 cm。用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色、Masson 三色染色和網(wǎng)狀纖維染色等。肝組織切片由兩名對(duì)患者臨床特征毫不知情且經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估，采用Scheuer 評(píng)分系統(tǒng)［4］評(píng)估肝纖維化程度，其中≥S2 定義為顯著肝纖維化；≥S3定義為進(jìn)展期肝纖維化；S4定義為肝硬化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用xˉ±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC 曲線(xiàn)）評(píng)估補(bǔ)體C3 對(duì)PBC 患者肝纖維化的診斷效能，ROC 曲線(xiàn)下面積（AUC）的比較采用Delong 法。采用Spearman 相關(guān)分析評(píng)估補(bǔ)體C3 與肝纖維化分期的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入PBC患者108例，平均（53.6±10.4）歲?；颊咭耘跃佣?7 例（80.6%），自身抗體陽(yáng)性102 例（94.4%）。肝纖維化分期S0 期5 例（4.6%），S1 期41 例（38.0%），S2 期23 例（21.3%），S3期25例（23.1%）、S4期14例（13.0%）。患者的其他資料見(jiàn)表1。不同肝纖維化分期患者PLT、CHE、Alb、TBil、C3、IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較的結(jié)果顯示，C3、LSM 在S3 與S0/1 之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），LSM 在S3 與S2 之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（P＜0.05），PLT、CHE、Alb、C3、LSM、AAR、APRI、FIB-4 在S4 與S0/1 之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、IgA、LSM、AAR、FIB-4在S4 與S2 之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、AAR、FIB-4 在S4 與S3 之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）（表2）。

表2 PBC患者肝纖維化分期的一般特征Table 2 General characteristics of hepatic fibrosis stage in patients with PBC

2.2 免疫功能對(duì)PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能 免疫功能指標(biāo)中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷顯著肝纖維化的AUC 分別為0.731、0.529、0.583、0.520、0.562；免疫功能指標(biāo)中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷進(jìn)展期肝纖維化的AUC 分別為0.832、0.591、0.609、0.602、0.503；免疫功能指標(biāo)中C3、C4、IgG、IgA 及IgM診斷肝硬化的AUC分別為0.968、0.687、0.604、0.739、0.638。綜上所述，補(bǔ)體C3 對(duì)PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能最佳（圖1）。

圖1 免疫功能指標(biāo)與不同肝纖維化分期的ROC曲線(xiàn)Figure 1 ROC curves of immune function indexes and different stages of liver fibrosis

2.3 ROC曲線(xiàn)診斷補(bǔ)體C3的性能分析 ROC曲線(xiàn)顯示顯著肝纖維化分期（≥S2）中C3 的最佳截?cái)嘀禐?.445 g/L，診斷顯著肝纖維化的敏感度為87.1%，特異度為52.2%（AUC=0.731，95%CI：0.637～0.812）（圖1a）。因此，根據(jù)C3這一截?cái)嘀邓絹?lái)比較PBC患者的一般特征。高補(bǔ)體C3組（C3＞1.445 g/L）PLT、GGT、ALP、Alb、TBil、C4明顯高于低補(bǔ)體C3組（C3≤1.445 g/L）（P值均＜0.05），高補(bǔ)體C3 組LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補(bǔ)體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無(wú)顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC曲線(xiàn)顯示進(jìn)展期肝纖維化分期（≥S3）中C3的最佳截?cái)嘀禐?.235 g/L，診斷進(jìn)展期肝纖維化的敏感度為82.1%，特異度為71.0%（AUC=0.832，95%CI：0.748～0.897）（圖1b）。因此，根據(jù)C3這一截?cái)嘀邓絹?lái)比較PBC 患者的一般特征。高補(bǔ)體C3 組（C3＞1.235 g/L）PLT、GGT、CHE、Alb、C4 明顯高于低補(bǔ)體C3 組（C3≤1.235 g/L）（P值均＜0.05），高補(bǔ)體C3組IgG、LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補(bǔ)體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無(wú)顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC 曲線(xiàn)顯示肝硬化分期（S4）中C3 的最佳截?cái)嘀禐?.005 g/L，診斷肝硬化的敏感度為100%，特異度為91.5%（AUC=0.968，95%CI：0.915～0.992）（圖1c）。因此，根據(jù)C3這一截?cái)嘀邓絹?lái)比較PBC患者的一般特征。高補(bǔ)體C3 組（C3＞1.005 g/L）PLT、CHE、Alb 和C4 明顯高于低補(bǔ)體C3 組（C3≤1.005 g/L）（P值均＜0.05），高補(bǔ)體C3 組IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補(bǔ)體C3組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無(wú)顯著差異（P值均＞0.05）（表3）。

表3 不同肝纖維化分期患者補(bǔ)體C3 水平的一般特征Table 3 General characteristics of complement C3 levels in patients with different stages of hepatic fibrosis

2.4 補(bǔ)體C3與肝纖維化分期、肝硬度及三種無(wú)創(chuàng)肝纖維化評(píng)分的相關(guān)性 補(bǔ)體C3與肝纖維化分期的相關(guān)系數(shù)為-0.565（P＜0.001），即肝纖維化分期越高，補(bǔ)體C3的水平越低（圖2a）。LSM、AAR、APRI 及FIB-4 與補(bǔ)體C3 的相關(guān)系數(shù)分別為-0.439（P＜0.001）、-0.323（P=0.001）、-0.206（P=0.033）和-0.291（P=0.002）（圖2b～e）。相比于3種無(wú)創(chuàng)肝纖維化評(píng)分，C3與LSM的相關(guān)性更高。

圖2 補(bǔ)體C3與肝纖維化分期、肝硬度及3種無(wú)創(chuàng)肝纖維化評(píng)分的相關(guān)性Figure 2 The correlation between C3 and liver fibrosis stage， LSM， AAR score， APRI score and FIB-4 score

2.5 補(bǔ)體C3 水平與不同肝纖維化分期的關(guān)系 單因素Logistic 回歸分析顯示PLT、CHE、C3、LSM、AAR和FIB-4 是與顯著肝纖維化相關(guān)的危險(xiǎn)因素；PLT、CHE、Alb、TBil、IBil、C3、LSM、AAR 和FIB-4 是進(jìn)展期肝纖維化相關(guān)的危險(xiǎn)因素；PLT、CHE、Alb、IBil、C3、C4、IgA、LSM、AAR 和FIB-4是肝硬化相關(guān)的危險(xiǎn)因素（表4）。為了避免冗余和最大限度的提高統(tǒng)計(jì)能力，以P＜0.1 為界限選取在單因素Logistic 回歸中有意義的指標(biāo)代入多因素Logistic 回歸進(jìn)一步計(jì)算。在分別調(diào)整了不同肝纖維化分期的纖維化相關(guān)混雜因素后，模型1、2、3、4中補(bǔ)體C3水平均為顯著肝纖維化、進(jìn)展期肝纖維化和肝硬化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，而LSM 是顯著肝纖維化和進(jìn)展期肝纖維化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（表5）。

表4 不同肝纖維化分期指標(biāo)的單因素分析Table 4 Univariate analysis of different liver fibrosis staging indicators

表5 不同肝纖維化分期調(diào)節(jié)混雜因素后指標(biāo)的多因素分析Table 5 Multi-factor analysis of indicators after adjustment of confounding factors for different liver fibrosis stages

2.6 C3、LSM 及C3 聯(lián)合LSM 對(duì)不同肝纖維化分期的診斷性能 C3、LSM及C3聯(lián)合LSM診斷顯著肝纖維化AUC 分別為0.731、0.764、0.811，最佳cut-off值分別為1.445、14.050、0.632，C3 聯(lián)合LSM 診斷顯著肝纖維化的AUC 與補(bǔ)體C3 的相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.604，P=0.009）。C3、LSM及C3聯(lián)合LSM診斷進(jìn)展期肝纖維化AUC 分別為0.832、0.911、0.941，C3 聯(lián)合LSM診斷進(jìn)展期肝纖維化的AUC與補(bǔ)體C3的相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.033，P=0.002）。C3、LSM 及C3 聯(lián)合LSM 診斷肝硬化AUC 分別為0.968、0.910、0.976，C3 聯(lián)合LSM 診斷肝硬化的AUC 與補(bǔ)體C3 相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.050，P=0.294），C3聯(lián)合LSM診斷肝硬化的AUC與LSM相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.326，P=0.020）（表6）。

表6 C3、LSM及C3聯(lián)合LSM對(duì)不同肝纖維化分期的診斷性能Table 6 Diagnostic performance of C3， LSM and C3 combined with LSM for different liver fibrosis stages

3 討論

目前，PBC 的年發(fā)病率為0.84/10 萬(wàn)～2.75/10 萬(wàn)，患病率為1.91/10 萬(wàn)～40.2/10 萬(wàn)，且PBC 的全球患病率呈不斷上升趨勢(shì)［1，5］。PBC 患者早期無(wú)明顯癥狀，主要表現(xiàn)為血清ALP、GGT 和AMA 的升高，部分患者會(huì)出現(xiàn)瘙癢、疲勞、黃疸等癥狀［6］，與本研究調(diào)查結(jié)果一致。PBC 患者的臨床預(yù)后與肝纖維化分期程度密切相關(guān)，如果沒(méi)有得到早期診斷和有效的治療，容易發(fā)展成肝硬化，甚至肝衰竭［7］。因此，尋找能有效評(píng)估肝纖維化程度的方法對(duì)PBC 的治療及病情控制具有重要意義。目前，肝活檢是評(píng)估PBC 肝纖維化分期的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)操作且花費(fèi)高，臨床應(yīng)用受到限制。一些肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型，如AAR、APRI 和FIB-4 等，以及瞬時(shí)彈性成像技術(shù)對(duì)肝纖維化有較高的診斷價(jià)值，然而上述模型都需要進(jìn)一步完善。有研究［8］發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的Child評(píng)分與補(bǔ)體C3水平呈負(fù)相關(guān)。還有研究［9-10］證實(shí)血清補(bǔ)體C3 水平能評(píng)估慢性乙型肝炎相關(guān)分期的嚴(yán)重程度，低補(bǔ)體C3 水平的失代償性肝硬化患者容易發(fā)生慢加急性肝衰竭。這些研究表明補(bǔ)體C3 可能與肝纖維化分期相關(guān)，然而目前的研究主要關(guān)注于評(píng)估慢性乙型肝炎相關(guān)肝纖維化分期，關(guān)于PBC 患者肝纖維化程度評(píng)估的研究較少?；诖耍狙芯刻接懥搜逖a(bǔ)體C3 對(duì)PBC 患者肝纖維化程度的診斷價(jià)值。

補(bǔ)體是存在于正常人和動(dòng)物血清及組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體的激活有3種途徑：經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑［11］。生理情況下能參與機(jī)體的抗感染免疫及擴(kuò)大體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。當(dāng)補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度激活時(shí)，也可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，甚至器官衰竭。C3 是補(bǔ)體系統(tǒng)的中心分子，它的激活對(duì)于該系統(tǒng)執(zhí)行的所有功能至關(guān)重要［12-13］。血清中存在的大部分補(bǔ)體蛋白是由肝臟產(chǎn)生和分泌的，其中C3 由肝細(xì)胞產(chǎn)生［14］。PBC是一種以小葉內(nèi)膽管為靶點(diǎn)的自身免疫性肝臟疾病，其特點(diǎn)是超過(guò)90%的患者中存在自身抗體和高血清IgM［15］。然而，補(bǔ)體在PBC 中的作用只在有限數(shù)量的研究中被描述。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，補(bǔ)體C3 評(píng)估PBC 相關(guān)肝纖維化的可能機(jī)制有兩個(gè)方面，分別是補(bǔ)體的生成減少和消耗增多。補(bǔ)體生成減少：已有研究［16-17］表明PBC患者處于急性炎癥狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，補(bǔ)體蛋白的水平會(huì)比健康人群高。而持續(xù)的炎癥刺激導(dǎo)致膽管破壞、膽管形態(tài)異常和分泌功能障礙，出現(xiàn)膽汁淤積，肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，容易發(fā)展成纖維化和肝硬化［18］。當(dāng)肝纖維化發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞功能?chē)?yán)重受損，補(bǔ)體蛋白產(chǎn)生減少［19］。補(bǔ)體的消耗增多：PBC 患者在發(fā)生肝損傷時(shí)會(huì)伴隨免疫應(yīng)答反應(yīng)，即生成抗原抗體復(fù)合物（IC），從而觸發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和補(bǔ)體成分的過(guò)度消耗［10］。但有研究［20］指出，PBC 患者膽管內(nèi)無(wú)補(bǔ)體C3的沉積，這表明補(bǔ)體C3可能沒(méi)有通過(guò)經(jīng)典途徑被激活而直接參與到PBC 患者膽管損傷的過(guò)程。這可能是因?yàn)镻BC 患者膽管中IC 沉積，誘發(fā)更多的C3 與其結(jié)合，同時(shí)黏附于表達(dá)補(bǔ)體受體1 的紅細(xì)胞或血小板，然后運(yùn)送至巨噬細(xì)胞被吞噬或清除，即免疫黏附作用導(dǎo)致血液循環(huán)中的補(bǔ)體C3水平下降。

本研究結(jié)果顯示，隨著肝纖維化程度的加重，補(bǔ)體C3 的水平呈下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析也證實(shí)了這一現(xiàn)象，補(bǔ)體C3水平與肝纖維化分期呈負(fù)相關(guān)。這與以往的研究結(jié)果一致［21］。此外，補(bǔ)體C3 水平與LSM、AAR、APRI 及FIB-4 纖維化評(píng)分也呈負(fù)相關(guān)。ROC 曲線(xiàn)分析顯示，免疫功能指標(biāo)中補(bǔ)體C3對(duì)PBC不同肝纖維化分期的診斷效能最佳。多因素Logistic 回歸分析顯示補(bǔ)體C3水平為顯著肝纖維化、進(jìn)展期肝纖維化和肝硬化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。因此，可以合理推斷補(bǔ)體C3水平可以在一定程度上評(píng)估PBC 患者的肝纖維化程度。此外，ROC 曲線(xiàn)分析顯示C3 聯(lián)合LSM 診斷PBC患者顯著肝纖維化、進(jìn)展期肝纖維化的AUC與補(bǔ)體C3的相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C3 聯(lián)合LSM 診斷PBC患者肝硬化的AUC與LSM的相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示C3 聯(lián)合LSM 能進(jìn)一步提高補(bǔ)體C3 或者LSM在診斷PBC患者肝纖維化分期程度時(shí)的效能。

綜上所述，補(bǔ)體C3 作為一種易獲取且不易受藥物因素影響的血清學(xué)指標(biāo)，在評(píng)估PBC 患者肝纖維化程度方面具有重要的臨床價(jià)值，C3 聯(lián)合LSM 后診斷效能更加顯著。本研究局限性：（1）是一項(xiàng)單中心、小樣本、回顧性研究，患者的選擇可能出現(xiàn)偏差。未來(lái)應(yīng)開(kāi)展多中心、大樣本、前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)體C3水平及C3聯(lián)合LSM對(duì)PBC患者肝纖維化程度的診斷價(jià)值。（2）目前的研究結(jié)果不能準(zhǔn)確的判斷補(bǔ)體C3水平和PBC 患者肝纖維化發(fā)生的因果關(guān)系。（3）PBC目前還是一種罕見(jiàn)病，臨床收集的樣本量較少，尤其是肝穿刺確診的PBC 患者樣本量更少，所以統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)偏倚。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年12月25日經(jīng)由天津市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：［2019］58。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：周輝負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)、資料分析及撰寫(xiě)論文；牛斌負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)和指導(dǎo)統(tǒng)計(jì)分析；宓余強(qiáng)負(fù)責(zé)指導(dǎo)文章撰寫(xiě)；劉勇鋼負(fù)責(zé)病理評(píng)分；李萍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)和最后定稿。