1株寄生桑樹的野生粗毛纖孔菌鑒定及資源特性分析

李劍梅，郭玲玲，柴林山，謝存一，張疏雨，朱萬芹

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

粗毛纖孔菌（Inonotushispidus）俗稱名粗毛黃孔菌或粗毛黃褐孔菌，屬于擔子菌門（Basidiomyeota）、傘菌綱（Agar ieomycetes）、銹革孔菌目（Hymenochaetales）、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）、纖孔菌屬（Inonotus）[1-2]，主要寄生在榆樹、桑樹、桃樹等闊葉樹的樹干上，在新疆南部以及山東“黃河故道”夏津、臨清等地區(qū)一直將其當作“桑黃”并沿用至今[3]，為桑黃的一種，用于治療癌癥、糖尿病、通風、關節(jié)炎等疾病，是我國重要的藥用真菌[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，粗毛纖孔菌的子實體含有豐富的多糖、多酚、黃酮、三萜類物質(zhì)和其它活性物質(zhì)[6-8]，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎、活血化瘀、保肝、增強免疫力和抗氧化等多種功效，具有較高的營養(yǎng)價值，在多個領域都具有應用價值和開發(fā)潛能[9-13]。

近年來，粗毛纖孔菌的藥用成分及其抗氧化能力引起了大量學者的關注。Liu 等[14]研究證明粗毛纖孔菌的多糖具有較好的抗氧化活性；昝立峰[15]從新疆南部桑樹粗毛纖孔菌子實體中分離鑒定出的9 個多酚類物質(zhì)中的桑黃酚可有效清除1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]陽離子自由基、羥自由基（·OH），具有良好的抗氧化活性；陳志娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)粗毛纖孔菌醇提取物中的總多酚和總黃酮含量較高、抗氧化活性較強；李學震等[17]通過對6 個桑黃菌株的羥自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總還原力進行評價，發(fā)現(xiàn)粗毛纖孔菌182有較強抗氧化能力。因此，粗毛纖孔菌是天然抗氧化劑的良好來源。但是，野生粗毛纖孔菌資源稀少，很難找到大量的子實體，且受季節(jié)限制，雖然已有成功栽培出粗毛纖孔菌子實體的相關研究[18]，但存在著出菇率和產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定的技術難題，難以滿足日益增長的市場需求。野生菌種質(zhì)資源的收集和鑒定是粗毛纖孔菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項基礎性研究工作，要推動珍稀藥用真菌粗毛纖孔菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展，必須創(chuàng)建和充分利用優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源庫。但是，目前對粗毛纖孔菌種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用力度不足，亟需對優(yōu)質(zhì)野生粗毛纖孔菌種質(zhì)資源開展野外調(diào)查、菌株采集、評價工作，為優(yōu)質(zhì)高效的粗毛纖孔菌菌種選育、馴化培養(yǎng)及應用提供豐富的種質(zhì)資源。本研究以采集于遼寧省喀左縣大營子鄉(xiāng)活體桑樹樹干上的野生粗毛纖孔菌子實體為材料，分離獲得純培養(yǎng)菌株，進一步開展分類學鑒定、培養(yǎng)特性及抗氧化活性評價研究，以期為珍稀藥用菌粗毛纖孔菌種質(zhì)資源挖掘及其開發(fā)利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生粗毛纖孔菌子實體：采集于遼寧省喀左縣大營子鄉(xiāng)活體桑樹樹干，采集時間為2022年8月，由遼寧省微生物科學研究院藥用蕈菌研究室提供。

Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；無水乙醇、碳酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂（均為分析純）：天津博迪化工股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、DPPH自由基清除能力測定試劑盒、羥自由基清除能力測定試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；沒食子酸標準品（純度98%）、葡萄糖標準品（純度98%）、蘆丁標準品（純度98%）：上海麥克林生化科技有限公司；pH7.0 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：上海源葉生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）綜合培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，3 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 維生素B1，15 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH6.0。

基礎培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 維生素B1，15 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH6.0。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽消毒器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD（標準型）雙人單面凈化工作臺：常州博萊爾凈化設備有限公司；DHP-PZ72 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；OLYMPUS生物顯微鏡：上海通灝光電科技有限公司；2720 thermal cycler 聚合酶鏈反應核酸擴增儀（polymerase chain reaction，PCR）：美國Applied Biosystems 公司；DYY-5電泳儀：北京市六一儀器廠；723N 型可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PR224ZH/E 型電子天平：奧豪斯（上海）儀器有限公司；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市江南實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離純化方法

采用組織分離法，將采集的子實體用75%酒精消毒表面，用無菌手術刀縱向切開，用接種針挑取子實體縱切面中心位置的菌塊置于PDA 綜合培養(yǎng)基表面，在25 ℃的環(huán)境中避光培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，挑取菌落邊緣新生菌絲于新的PDA 綜合培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，反復純化培養(yǎng)3 次后，獲得野生粗毛纖孔菌的純培養(yǎng)菌株，編號SK-4。

1.3.2 物種鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學鑒定

結合表觀形態(tài)及顯微形態(tài)特征完成樣本形態(tài)學初步鑒定。利用解剖鏡和顯微鏡觀察子實體及孢子形態(tài)特征，同時無菌挑取供試菌株新鮮斜面培養(yǎng)物置于預制好的PDA 綜合培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形狀，挑取菌落的菌絲，壓片后置于光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.2.2 分子鑒定

將供試菌株接種至PDA 綜合培養(yǎng)基上，在25 ℃的環(huán)境中避光倒置培養(yǎng)，待菌絲長滿后取適量菌絲，利用真菌基因組提取試劑盒提取其DNA；利用通用引物內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS4 進行ITS 片段擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。結合所得序列和GenBank 下載的相關序列，運用ClustalX 1.81 進行多重序列比對，利用MEGA 3.1 的鄰接法（N-J）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.3 培養(yǎng)特性研究

1.3.3.1 碳源對菌絲生長的影響

以基礎培養(yǎng)基為對照，其他培養(yǎng)基分別以蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖為碳源。將直徑5 mm 供試菌株的菌塊接種至預先制備好的供試培養(yǎng)基中央，于25 ℃的環(huán)境中避光、倒置培養(yǎng)。采用十字交叉法測定菌落直徑，并記錄菌絲生長情況，確定最適碳源。

1.3.3.2 氮源對菌絲生長的影響

以基礎培養(yǎng)基為對照，其他培養(yǎng)基分別以牛肉膏、蛋白胨、乙酸銨、硫酸銨、酵母粉為氮源。接種、培養(yǎng)及測量方法同1.3.3.1，確定最適氮源。

1.3.3.3 pH 值對菌絲生長的影響

采用PDA 綜合培養(yǎng)基，用0.01 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)PDA 綜合培養(yǎng)基初始pH 值分別為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0。接種、培養(yǎng)及測量方法同1.3.3.1，確定培養(yǎng)基最適初始pH 值。

1.3.3.4 培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響

采用PDA 綜合培養(yǎng)基，接種后分別置于19、22、25、28、31、35 ℃環(huán)境中避光培養(yǎng)。接種、培養(yǎng)及測量方法同1.3.3.1，確定最適培養(yǎng)溫度。

1.3.4 子實體抗氧化活性評價

1.3.4.1 子實體活性成分提取

以試劑殘留少、毒性低的水及70%乙醇為提取溶劑，準確稱取粗毛纖孔菌子實體粉末0.500 0 g 共2 份于50 mL 磨口三角瓶中，分別加入20 mL 蒸餾水及70%乙醇，在50 Hz、60 ℃條件下回流超聲輔助提取2 h，分別用蒸餾水及70%乙醇定容至25 mL，于15 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，即可獲得桑黃子實體水提、醇提供試樣品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.3.4.2 多酚含量測定

參照鄧真華等[19]的測定方法，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應的A750吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為y=4.168x-0.008，R2=0.993 0。于750 nm 處分別測定不同條件下獲得的子實體提取液的吸光值，按照標準曲線方程計算供試樣品液中多酚的濃度，并換算成每克子實體相對于沒食子酸的量（mg/g）。

1.3.4.3 黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，按照龍華等[20]的測定方法，稍作修改。準確吸取0.2 mg/mL 蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于25 mL 比色管中，分別加70%乙醇至5.0 mL；加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min；加入4%NaOH 溶液10 mL，放置10 min 后用70%乙醇定容至25 mL，510 nm 下測定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為y=2.536 7x-0.000 4，R2=0.999 7。準確吸取不同條件獲得的粗毛纖孔菌子實體提取液3.0 mL 于25 mL 比色管中，同法測定供試樣品液的吸光值，按照標準曲線方程計算供試樣品液中黃酮的濃度，并換算成每克子實體相對于蘆丁的量（mg/g）。

1.3.4.4 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法，按照余麗等[21]的測定方法。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應的A490吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為y=12.274x+0.01，R2=0.999 1，于490 nm 處分別測定不同條件獲得的粗毛纖孔菌子實體提取液的吸光值，按照標準曲線方程計算供試樣品液中多糖的濃度，并換算成每克子實體相對于葡萄糖的量（mg/g）。

1.3.4.5 總抗氧化能力測定

采用Trolox 等效總抗氧化能力評價方法，使用總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（ABTS 法）對子實體不同提取液進行測試分析，測試步驟參考試劑盒說明書，按照公式（1）計算供試樣品總抗氧化能力。

式中：M為總抗氧化能力，μmol Trolox/g；△A為吸光值差值；A測定為樣品ABTS 的吸光值；A對照為樣品與PBS 混合液吸光值；A空白為ABTS 工作液與PBS 混合液的吸光值；D為樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4.6 DPPH 自由基清除率測定

利用DPPH 自由基清除能力測定試劑盒進行測試分析，測試步驟參考試劑盒說明書，按照公式（2）計算供試樣品液的DPPH 自由基清除率，按照公式（3）計算供試樣品的DPPH 自由基的清除能力。

式中：M1為DPPH 自由基清除率，%；M2為DPPH自由基清除能力，mg Trolox/g；A測定為樣品與DPPH 混合液吸光值；A對照為樣品與無水乙醇混合液吸光值；A空白為DPPH 與無水乙醇混合液吸光值；D為樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4.7 羥自由基清除率測定

利用羥自由基清除能力測定試劑盒進行測試分析，測試步驟參考試劑盒說明書，按照公式（4）計算供試樣品的羥自由基清除率。

式中：N為羥自由基清除率，%；A測定為測定管的吸光值；A對照為對照管的吸光值；A空白為空白管的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件Excel 2007、IBM SPSS Statistics25 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和處理，結果以平均值±標準差表示，試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

2.1.1 形態(tài)學鑒定結果

SK-4 菌株子實體、菌落及菌絲體形態(tài)見圖1。

圖1 SK-4 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of SK-4 strain

由圖1 可知，試驗菌株子實體平展至半圓形，無柄，木栓質(zhì)，新生子實體表面光滑、呈淡黃色；成熟子實體表面覆蓋著粗毛、呈黃褐色至暗褐色，菌蓋邊緣頓，菌管管口多角形，較菌肉色澤淺；擔孢子呈橢圓形，表面光滑，金黃色，有明顯厚壁；在PDA 綜合培養(yǎng)基上，以接種塊為中心呈輻射狀擴張生長，菌絲初期為白色絨毛狀，后逐漸變?yōu)檩^暗的淺黃褐色，邊緣為白色細微菌絲，菌絲有分枝和分隔，老熟菌絲呈淡黃色，無鎖狀聯(lián)合。這些特征與郭春宣等[22]描述的粗毛纖孔菌形態(tài)特征一致。

2.1.2 分子鑒定

經(jīng)過對SK-4 菌株ITS 序列的測定及生物大分子序列比對搜索工具比對，發(fā)現(xiàn)SK-4 菌株ITS 序列的長度為738 bp，與粗毛纖孔菌MZ467700.1、MN699465.1 ITS 序列的相似度達到了99%以上，顯示較高的同源性比對結果。從美國國家生物技術信息中心選取與SK-4 菌株同源性較高的菌株及在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的桑黃菌屬模式菌種的ITS 序列，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖2所示。

圖2 基于ITS 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖2 可知，SK-4 菌株與GenBank 中的3 株粗毛纖孔菌InonotushispidusITS 片段聚在一個高支持率的獨立支系，親緣關系較近，尤其是與粗毛纖孔菌MZ467700.1、MN699465.1 的親緣關系最近，屬于同一個物種，進一步證實了SK-4 菌株為粗毛纖孔菌，該結果與子實體形態(tài)鑒定結果一致。結合形態(tài)鑒定和分子生物學結果，將采集的菌株鑒定為粗毛纖孔菌Inonotushispidus。

2.2 生物學特性試驗結果

2.2.1 碳源對菌絲生長的影響

不同碳源對試驗菌株菌絲生長的影響結果見表1。

表1 不同碳源對SK-4 菌株菌絲生長的影響Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelium of SK-4 strain

由表1 可知，試驗范圍內(nèi)，SK-4 菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況存在明顯差異。在菌絲生長速度方面，供試菌株菌絲的生長速度由快到慢依次為蔗糖＞甘露醇＞乳糖＞麥芽糖＞葡萄糖；在菌絲長勢方面，相比其它碳源培養(yǎng)基，SK-4 菌株在蔗糖培養(yǎng)基上長勢最佳，菌落黃褐色、邊緣整齊、致密毯狀、菌絲濃密旺盛；葡萄糖培養(yǎng)基次之，甘露醇培養(yǎng)基上菌絲長勢最差，菌落邊緣不整齊、菌絲較細弱稀疏；無碳源的對照培養(yǎng)基菌絲也能萌發(fā)生長，菌絲生長速度為1.93 mm/d，明顯低于葡萄糖培養(yǎng)基，菌絲長勢較甘露醇培養(yǎng)基更為細弱稀疏。由此可見，碳源是菌絲生長的重要營養(yǎng)成分，培養(yǎng)基中添加不同的碳源對SK-4 菌株菌絲生長具有明顯的促進作用，綜合菌絲長勢和菌絲生長速度，SK-4 菌株生長的最適碳源為蔗糖。

2.2.2 氮源對菌絲生長的影響

不同氮源對試驗菌株菌絲生長的影響結果見表2。

表2 不同氮源對SK-4 菌株菌絲生長的影響Table 2 Effects of the different nitrogen sources on the mycelium of SK-4 strain

由表2 可知，試驗范圍內(nèi)，不同的氮源對SK-4菌株菌絲的生長影響顯著。氮源為酵母粉、硫酸銨培養(yǎng)基中試驗菌株菌絲的生長速度相近，分別為2.51、2.58 mm/d，明顯優(yōu)于其它氮源培養(yǎng)基，其次為無氮源對照、蛋白胨、乙酸銨、牛肉膏培養(yǎng)基。酵母粉為氮源培養(yǎng)基上的菌絲長勢最好，菌落呈淺黃褐色，菌絲濃密健壯，菌落呈致密毯狀、邊緣整齊；硫酸銨培養(yǎng)基次之，菌絲較為濃密健壯、菌落邊緣整齊；牛肉膏、蛋白胨為氮源培養(yǎng)基上的菌絲較為稀疏，菌落邊緣不整齊；乙酸銨培養(yǎng)基上的菌絲長勢最差，菌落中心略顯淡黃色，菌落周邊白色菌絲氣生性強，且細弱稀疏；無氮源對照培養(yǎng)基上的菌絲生長速度（1.93 mm/d）介于硫酸銨（2.58 mm/d）和蛋白胨（1.66 mm/d）培養(yǎng)基之間，菌絲較為細弱稀疏，說明酵母粉、硫酸銨對試驗菌株菌絲的生長具有顯著的促進作用。綜合菌絲長勢和菌絲生長速度，SK-4 菌株生長的最適氮源為酵母粉。

2.2.3 pH 值對菌絲生長的影響

不同pH 值對試驗菌株菌絲生長的影響見表3。

表3 pH 值對SK-4 菌株菌絲生長的影響Table 3 Effects of different pH on the mycelium of SK-4 strain

由表3 可知，在試驗范圍內(nèi)，SK-4 菌株在酸度較強的pH3.0 培養(yǎng)基上停止生長，但在pH4.0～9.0 條件下均能生長，除在pH4.0 菌絲生長緩慢、長勢細弱外，在pH 值為5.0～9.0 時菌絲生長情況均較好，說明SK-4菌株能較好地適應pH 值為5.0～9.0 的環(huán)境；當培養(yǎng)基初始pH 值為5.0、5.5 時，菌絲生長速度達到較高水平，分別為2.50、2.27 mm/d，明顯優(yōu)于其它處理，pH5.0菌絲生長速度最快。因此，SK-4 菌株菌絲生長最適pH值為5.0。

2.2.4 培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響

不同培養(yǎng)溫度對試驗菌株菌絲生長的影響結果見表4。

培養(yǎng)溫度的變化對食用菌菌株的影響較大，培養(yǎng)溫度過高或過低均不利于其生長繁殖。由表4 可知，試驗范圍內(nèi)，SK-4 菌株的菌絲生長速度隨培養(yǎng)溫度升高逐漸加快，菌絲的長勢也隨著培養(yǎng)溫度的升高而逐步改善，當培養(yǎng)溫度達到25～28 ℃時，菌絲生長速度為2.52～2.56 mm/d，菌絲生長速度相對穩(wěn)定，并且達到了較高水平，此時菌絲長勢也最為濃密、旺盛；隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生長受到抑制，菌絲長勢變?nèi)?、生長速度減慢。由此可見，SK-4 菌株最適生長溫度為25～28 ℃。

2.3 抗氧化活性評價結果

2.3.1 主要活性成分含量及抗氧化活性

SK-4 菌株子實體活性成分含量分析及抗氧化活性測試結果見表5。

表5 子實體不同提取物的主要活性成分含量及抗氧化活性Table 5 Content of active components and antioxidant activity of the fruiting body extracts prepared with different solvents

由表5 可知，SK-4 菌株子實體含有豐富的黃酮、多酚及多糖成分，不同提取溶劑所獲提取物中黃酮、多酚、多糖的含量存在明顯差異。其中，子實體70%乙醇提物中黃酮、多酚的含量明顯高于水提物，其黃酮、多酚含量分別是水提物的1.13、1.28 倍，而子實體多糖主要存在于水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，明顯高于醇提物，說明SK-4 菌株子實體多糖主要為水溶性多糖，而70%乙醇溶液更有利于提取SK-4 菌株子實體酚類化合物。試驗范圍內(nèi)，供試菌株子實體70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力（5.83 mg Trolox/g）雖略低于水提物（6.29 mg Trolox/g），但總抗氧化能力（70.98 μmol Trolox/g）是水提物（45.56 μmol Trolox/g）的1.56 倍，同時其醇提物具有羥自由基清除能力，未檢測到水提物羥自由基清除能力，可見試驗菌株子實體不同提取物均具有一定的抗氧化活性，其中子實體70%乙醇提取物的抗氧化活性明顯優(yōu)于水提物。

2.3.2 抗氧化活性與主要活性成分含量相關性分析

抗氧化活性與主要活性成分含量相關性分析結果見表6。

表6 子實體不同提取物的抗氧化活性與活性成分相關性分析Table 6 Correlation coefficients of antioxidant activity with the active component content in fruiting bodies

由表6 可知，試驗范圍內(nèi)，供試菌株子實體總抗氧化能力、羥自由基清除率與多酚和黃酮的含量呈線性正相關（P＜0.01），相關系數(shù)均大于0.95，與DPPH 自由基清除能力呈一定的負相關關系；多糖含量與DPPH自由基清除能力相關系數(shù)為0.557，呈中等的正相關，與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈極顯著負相關（P＜0.01）。說明黃酮及多酚是粗毛纖孔菌SK-4 總抗氧化能力、羥自由基清除能力的關鍵物質(zhì)，而多糖是其DPPH自由基清除能力的主要活性成分。

3 結論

試驗以寄生在活體桑樹上的粗毛纖孔菌子實體為材料，通過菌種的分離、純化，獲得純培養(yǎng)菌株SK-4，并通過形態(tài)特性觀察、ITS 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建將其鑒定為粗毛纖孔菌Inonotushispidus。培養(yǎng)特性試驗結果顯示：試驗范圍內(nèi)，寄生在活體桑樹上的野生菌株SK-4 菌絲生長的最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母粉，最適pH 值為5.0，最適培養(yǎng)溫度為25～28 ℃。野生菌種資源是粗毛纖孔菌優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)菌種選育的重要來源，但由于生長環(huán)境條件及菌種種性的差異，其菌絲體生長發(fā)育所需營養(yǎng)條件、培養(yǎng)溫度、pH 值等培養(yǎng)條件有所不同，故加強野生菌種質(zhì)資源采集、鑒定及培養(yǎng)特性研究，對豐富粗毛纖孔菌菌種資源及粗毛纖孔菌株SK-4 人工馴化培養(yǎng)具有重要意義。

在探究SK-4 菌株生物學特性基礎上，以試劑殘留少、毒性低的水及70%乙醇為提取溶劑，進一步研究了野生粗毛纖孔菌SK-4 子實體主要活性成分的含量及體外抗氧化活性。結果表明，子實體70%乙醇提取物具有總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力3 個體系的抗氧化活性，抗氧化活性明顯優(yōu)于水提物，特別是總抗氧化能力達到了水提物的1.56 倍；SK-4 菌株子實體的水提物及醇提物均含有豐富的多糖、黃酮及多酚成分，其子實體多糖主要存在水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，且其多糖含量與DPPH 自由基清除能力呈中等正相關（R2=0.557），與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈負相關；70%乙醇溶液有利于黃酮、多酚的提取，黃酮、多酚含量分別是水提物的1.13、1.28 倍，二者的含量與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈極顯著正相關（R2＞0.95），與DPPH 自由基清除能力呈負相關。這一研究結果說明了SK-4 菌株子實體多糖成分是其清除DPPH 自由基的主要活性成分，而其子實體中的黃酮、多酚對粗毛纖孔菌SK-4 抗氧化活性起到了關鍵作用。本研究為粗毛纖孔菌SK-4 菌株子實體中抗氧化活性成分提取及開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。