復合酶解提取牡蠣糖胺聚糖及其降血糖活性

王雅茹，陳暉，閻光宇，林河通，洪專，

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350001；2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院，福建 廈門 361022）

牡蠣又稱海蠣子、蠔或牡蛤，屬軟體動物門、雙殼綱類牡蠣科。目前，有100 多種牡蠣分布在全球各大海域，我國牡蠣有20 余種，主要分布于福建、廣東、山東等地，常見的品種有長牡蠣、褶牡蠣、福建牡蠣和近江牡蠣等[1]。牡蠣肉質(zhì)鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、?；撬帷⒍嗖伙柡椭舅嵋约案哂谇菪笕忸惡康拟}、鐵、鋅、硒，素有“海洋牛奶”、“海的玄米”之美譽[2-4]。據(jù)研究分析，干牡蠣肉中糖類化合物含量能夠達到20%～40%，糖原能改善人的心臟及血液循環(huán)功能，增強肝臟功能，可直接被機體吸收利用，對糖尿病的防治十分有益[3]。

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAGs）又稱為酸性黏多糖，是一類由己糖醛酸和氨基糖重復單元構(gòu)成的長線性雜多糖陰離子聚合物（硫酸角質(zhì)素除外），以絲氨酸殘基共價結(jié)合在核心蛋白上組合形成蛋白聚糖，結(jié)構(gòu)復雜，具有極性和帶負電荷的分子[5-6]。GAGs 主要分為肝素、硫酸乙酰肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和硫酸角質(zhì)素等，對凝血、血糖、血栓形成、炎癥、癌癥、病毒感染和組織發(fā)育等具有重要影響[7-9]。GAGs 是貝類中的特征多糖之一，具有抗血栓[10]、抗病毒[11-13]、抗腫瘤[14-15]、抗氧化[16]、抗凝血[17]等多種生物活性。研究表明，貝類中提取的GAGs 能夠通過抑制葡萄糖生成所需的α-葡萄糖苷酶的活性，達到抑制葡萄糖吸收、降低血糖的效果。孔艷等[18]從近江牡蠣中提取得到的GAGs 短時間內(nèi)對α-葡萄糖苷酶抑制率效果優(yōu)于阿卡波糖。宋佩林[19]從瘤背石磺貝類中提取的多糖濃度在0.05 mg/mL 時對α-葡萄糖苷酶抑制率可達到（82.2±3.3）%。此外，海洋來源的GAGs 不受陸源GAGs病原體污染，安全性高，具有開發(fā)成降血糖功能食品的潛力[20-21]。

目前，國內(nèi)牡蠣產(chǎn)業(yè)中，養(yǎng)殖和粗加工占很大比例，產(chǎn)業(yè)化程度低、綜合利用不充分等問題依然比較突出。因此，深入研究牡蠣蛋白類、糖類等活性物質(zhì)的生理功能，進而開發(fā)出新型功能食品，對于發(fā)展牡蠣精深加工業(yè)，完善牡蠣的全產(chǎn)業(yè)鏈結(jié)構(gòu)，具有積極的意義。本試驗以福建牡蠣為原料，采用復合酶解法提取牡蠣中的GAGs，以牡蠣糖胺聚糖提取率為指標，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定牡蠣糖胺聚糖最優(yōu)提取工藝條件，并對獲得的牡蠣糖胺聚糖進行成分分析和體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價，以期建立具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的牡蠣糖胺聚糖提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建牡蠣：市售；胰蛋白酶（2 500 U/g）、堿性蛋白酶（20 萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶（20 萬U/g）、木瓜蛋白酶（30 萬U/g）、胃蛋白酶（20 萬U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；阿利新藍8GX、硫酸軟骨素：北京索萊寶科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、α-葡萄糖苷酶（24.19 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer-ed solution，PBS）（0.1 mol/L，pH6.8）：上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍、牛血清蛋白標準品、硼酸、硫酸、磷酸、鹽酸、無水乙醇、丙酮、硫酸鉀、四硼酸鈉、咔唑：西隴科學股份有限公司。以上試劑均為分析純。

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；Hei-VAP Value G3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph 公司；WF-20B 萬能粉碎機：江陰市方圓機械制造有限公司；標準檢驗篩（80 目）：上虞市銀河測試儀器廠；UH5300 紫外-可見分光光度計：日本島津公司；MULTISKAN Sky 全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；890 TITRANDO 水分測定儀：瑞士萬通中國有限公司；DZF6050 中型真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

新鮮福建牡蠣，經(jīng)去殼、清洗、瀝干、凍干、研磨成粉、過篩（80 目）后備用。

1.2.2 牡蠣糖胺聚糖提取工藝

準確稱取10 g 牡蠣干粉，按料液比1∶15（g/mL）加水，混勻后按照設(shè)定的參數(shù)進行酶解提取，所得提取液經(jīng)滅酶后，調(diào)節(jié)酶解液pH 值為2，離心除蛋白（10 000 r/min，10 min），取上清液將其pH 值調(diào)至7，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液至原體積的1/3，在60%乙醇4 ℃條件下沉淀24 h 后7 500 r/min 離心10 min 收集沉淀，分別用無水乙醇、丙酮洗滌2 次，于50 ℃真空干燥獲得牡蠣糖胺聚糖。

1.2.3 單因素試驗

按照1.2.2 的方法進行酶解提取，分別考察蛋白酶種類、2 種單一酶添加量、復合酶質(zhì)量比、起始pH 值、復合酶添加量、酶解溫度和酶解時間8 個單因素對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響。單因素試驗梯度設(shè)置見表1。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

基于單因素試驗結(jié)果，以中性蛋白酶添加量（A）、胰蛋白酶添加量（B）、酶解溫度（C）為考察因素，以牡蠣糖胺聚糖提取率為響應(yīng)值，進行Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計，并對試驗獲得的最優(yōu)提取參數(shù)進行驗證試驗。響應(yīng)面試驗因素水平見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計試驗因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.2.5 牡蠣糖胺聚糖主要成分分析

1.2.5.1 糖胺聚糖含量的測定

采用阿利新藍比色法測定糖胺聚糖含量[22]。取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的硫酸軟骨素標準溶液0～0.8 mL，加超純水至1 mL，加入1.5 mL 阿利新藍染色液混勻，反應(yīng)10 min，481 nm 處測定吸光度。以硫酸軟骨素標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度A481nm為縱坐標繪制標準曲線：y=0.498 6x-0.015 1（R2=0.993 7）。將樣品配制成1 mg/mL 溶液，參照上述方法測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中糖胺聚糖含量。糖胺聚糖提取率（X，%）計算公式如下。

式中：m1為糖胺聚糖粗品質(zhì)量，g；m2為原料質(zhì)量，g；c為糖胺聚糖含量，%。

1.2.5.2 多糖測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[23]，以葡萄糖為對照品。

取6 支潔凈試管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖標準溶液，補純水至1 mL；依次加入1 mL 5%苯酚、5 mL 濃硫酸，渦旋混勻，室溫靜置10 min，40 ℃水浴20 min，取出冷卻至室溫，用紫外分光光度計于490 nm 處測定吸光度；以葡萄糖標準品濃度為橫坐標，吸光度A490nm為縱坐標，繪制標準曲線：y=10.496x+0.007 6（R2=0.995 3）。將樣品配制成1 mg/mL 溶液，參照上述方法測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中多糖含量。

1.2.5.3 糖醛酸含量測定

采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[24]，以葡萄糖醛酸為標準品。

取7 支潔凈試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖醛酸標準溶液，用純水補至1.0 mL，冰水浴5 min；分別加入5.0 mL 12.5 mmol/L四硼酸鈉-濃硫酸溶液，渦旋混勻，沸水浴15 min，取出后置于冰水浴中冷卻至室溫；再分別加入0.15%咔唑溶液0.2 mL，渦旋混勻，室溫反應(yīng)20 min，用紫外分光光度計于530 nm 處測定吸光度；以葡萄糖醛酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度A530nm為縱坐標，繪制標準曲線：y=6.226x+0.026 9（R2=0.995 1）。將樣品配制成1 mg/mL 溶液，參照上述方法測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中糖醛酸含量。

1.2.5.4 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[25]，以牛血清蛋白為標準品。

配制考馬斯亮藍溶液：準確稱取考馬斯亮藍10 mg，依次加入90%乙醇5 mL、85%磷酸溶液10 mL 溶解，充分溶解后加入去離子水，抽濾2 次，定容至100 mL棕色容量瓶備用。

取7 支潔凈試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標準品溶液，補去離子水至1.0 mL；加入考馬斯亮藍溶液5 mL 混勻，放置2 min，用紫外分光光度計于595 nm 處測定吸光度，以牛血清蛋白標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度A595nm為縱坐標繪制標準曲線為y=0.006 8x+0.009 8（R2=0.992 4）。將樣品配制成1 mg/mL 溶液，參照上述方法測定樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.5 灰分含量測定

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[26]的方法進行測定。

1.2.5.6 硫酸基含量測定

采用離子色譜法測定硫酸基含量[27]。色譜條件如下，色譜柱：Dionex IonPacTMAS 18 RFICTM 4 mm×250 mm；淋洗液：超純水；流速：1.2 mL/min；檢測器：電導檢測器；抑制器電流：75 mA；柱溫30 ℃；柱壓：200～3 000 MPa；進樣量：10 μL；檢測時間：8 min。

配制50、100、150、200、250 μg/mL 濃度的硫酸根離子標準品溶液，進樣分析，繪制峰面積-樣品濃度標準曲線：y=0.059 8x+0.008 0（R2=0.997 1）。取1.2.5.5 中干法灰化至灰白色的樣品，制成2.5 mg/mL 樣品溶液進樣分析，根據(jù)標準曲線計算樣品中硫酸基的含量。

1.2.6 牡蠣糖胺聚糖α-葡萄糖苷酶活性抑制率測定

α-葡萄糖苷酶活性測定參考文獻[28]的方法并加以修改，取一定量牡蠣糖胺聚糖粗制品，用0.1 mol/L PBS 緩沖溶液（pH6.8）配制成不同濃度的溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），分別取上述不同濃度的樣品溶液50 μL 于96 孔中，加入50 μL 5.0 mmol/L PNPG混勻后37 ℃下孵育10 min，再加入100 μL 0.1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，于酶標板恒溫37 ℃孵育20 min。以PBS 緩沖溶液（pH6.8）代替糖胺聚糖溶液作為空白組，PBS 緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶為樣品對照組，于405 nm 波長處測定吸光度，分別為A樣品、A空白和A樣品對照。以阿卡波糖作為陽性對照，用同樣方法測定阿卡波糖為樣品的吸光度。通過以下公式計算樣品與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制率（Y，%）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果均以平均值±標準偏差表示（n=3）。采用Design-Expert 12.0 軟件和IBM SPSS statistics 27.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。運用Duncan 多重比較分析方法確定差異是否具有統(tǒng)計學意義；使用Origin 2021 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣糖胺聚糖提取工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.1 蛋白酶的確定

5 種蛋白酶對牡蠣糖胺聚糖酶解效果的影響如表3所示。

表3 蛋白酶對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響Table 3 Effect of protease on the extraction rate of glycosaminoglycan in oyster

由表3 可知，5 種蛋白酶的糖胺聚糖提取率由大到小順序為胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶的提取率較高。胰蛋白酶屬于肽鏈內(nèi)切酶，可水解分子量較大的蛋白質(zhì)，使其易與糖胺聚糖分離開；中性蛋白酶則能切斷多肽的肽鍵，產(chǎn)生短肽和疏水性氨基酸，去除核心蛋白釋放出糖胺聚糖。故本試驗選擇胰蛋白酶和中性蛋白酶復合酶解提取牡蠣糖胺聚糖。

2.1.2 單一酶添加量的確定

單一酶添加量對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響如圖1所示。

圖1 單一酶添加量對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響Fig.1 Effect of single enzyme addition on the extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由圖1（a）可知，隨著中性蛋白酶添加量增加，牡蠣糖胺聚糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，當添加量為1.0%時，牡蠣糖胺聚糖提取率最高，達到0.27%，表明在此添加量下，中性蛋白酶酶解位點已達飽和，酶添加量過多會降低酶的作用效率，致使牡蠣糖胺聚糖提取率降低。由圖1（b）可知，隨著胰蛋白酶添加量的增加，牡蠣糖胺聚糖提取率呈逐漸上升趨勢，當添加量為1.2%時提取率達到0.37%，之后牡蠣糖胺聚糖提取率幾乎保持不變，差異不顯著，表明在此添加量下，胰蛋白酶酶解位點達到飽和。從最少酶添加量和最大提取率兩方面因素考慮，確定中性蛋白酶添加量1.0%、胰蛋白酶添加量1.2%較為適宜。

2.1.3 復合酶質(zhì)量比的確定

中性蛋白酶與胰蛋白酶酶解的作用位點不同，采用雙酶復合酶解，能夠釋放更多的糖胺聚糖，提高酶解程度。復合酶質(zhì)量比對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響如圖2所示。

由圖2 可知，當復合酶添加總量固定時，隨胰蛋白酶添加量的降低，糖胺聚糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。復合酶質(zhì)量比為1∶1.20 時，酶解效果較好，糖胺聚糖提取率為0.41%。由于酶解反應(yīng)的作用位點幾乎飽和，繼續(xù)增大中性蛋白酶添加量，糖胺聚糖提取率隨之下降。因此確定中性蛋白酶和胰蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1.20。

2.1.4 起始pH 值的確定

起始pH 值對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響如圖3所示。

圖3 起始pH 值對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響Fig.3 Effect of initial pH on extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由圖3 可知，當起始pH 值從6.5 上升至8.5 時，糖胺聚糖提取率逐漸上升后趨于平緩。當起始pH 值為8.0 時，提取率達到最高，為0.39%。這可能是由于中性蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH 值為8.0 左右，當pH 值過低時不符合蛋白酶的最適pH 值，提取率較低；當pH 值過高時，可能會引起蛋白酶本身的變性，降低蛋白酶的活性。綜上，確定酶解起始pH 值為8.0。

2.1.5 復合酶添加量的確定

在最優(yōu)復合酶質(zhì)量比1∶1.20 和最適pH 值的條件下，考察復合酶添加量對牡蠣糖胺聚糖提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 復合酶添加量對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響Fig.4 Effects of compound enzyme supplementation on extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由圖4 可知，隨著復合酶添加量的增加，糖胺聚糖提取率逐漸上升，當添加量為2.20%時其提取率達到最大值0.42%，此后趨于平穩(wěn)。這可能是由于隨著復合酶添加量的提高，底物與酶位點的結(jié)合隨之增加，酶解效果變好。但是當復合酶添加量繼續(xù)增加時，由于底物與酶位點的結(jié)合趨于飽和，從而導致糖胺聚糖提取率不再上升，因此確定復合酶添加量為2.20%。

2.1.6 酶解時間的確定

酶解時間對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響如圖5所示。

由圖5 可知，隨著酶解時間的延長，糖胺聚糖提取率逐漸升高，當酶解時間為4 h 時達到最高值0.48%，隨后糖胺聚糖的提取率有所降低。表明牡蠣中的蛋白質(zhì)需要完全水解，才能釋放糖胺聚糖，而隨著反應(yīng)時間的不斷延長，可能有部分糖胺聚糖降解導致提取率降低。由此確定酶解時間為4 h 最佳。

2.1.7 酶解溫度的確定

酶解溫度對牡蠣糖胺聚糖提取率的影響如圖6所示。

由圖6 可知，隨著酶解溫度由30 ℃上升至70 ℃，糖胺聚糖提取率先上升后下降，在50 ℃達到最高值0.54%。說明溫度會直接影響酶活力，酶解溫度過高會減弱蛋白酶的活性，影響酶解效果；適宜的酶解溫度，有助于充分發(fā)揮蛋白酶的活性，提高糖胺聚糖提取率。由此選擇酶解溫度40、50、60 ℃進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2 牡蠣糖胺聚糖提取工藝響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，選擇中性蛋白酶添加量（A）、胰蛋白酶添加量（B）、酶解溫度（C）作為變量，以Design-Expert 12.0 軟件設(shè)計中心組合試驗，探究酶解的最佳條件，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表4。

2.2.2 響應(yīng)面試驗方差分析

以糖胺聚糖提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12.0 軟件分析得到的二次多項式回歸方程為Y=0.710 0-0.013 7A+0.091 3B-0.062 5C+0.022 5AB-0.015 0AC-0.015 0BC-0.061 3A2-0.181 3B2-0.158 7C2。

將上述二次回歸方程進行方差分析檢驗，響應(yīng)面回歸系數(shù)模型及方差分析見表5。

表5 響應(yīng)面回歸系數(shù)模型及方差分析Table 5 Response surface regression coefficient model and variance analysis

由表5 可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.979 6，R2Adj=0.953 4，且模型p值小于0.01，表明模型極顯著，失擬項p值為0.125 8＞0.05（失擬項不顯著），說明試驗所得值與預(yù)測值相關(guān)性高，該模型的可信度和擬合度均高，可以用來分析和預(yù)測復合酶解法提取福建牡蠣糖胺聚糖的工藝條件。一次項B、C，二次項A2、B2、C2對結(jié)果有極顯著影響（p＜0.01），一次項A與交互相AB、AC、BC均不顯著（p＞0.05）。由F值可知，3 個因素對糖胺聚糖提取率影響的大小順序為B＞C＞A。

因素間兩兩交互作用等高線及三維響應(yīng)曲面如圖7所示。

圖7 因素間交互作用等高線圖及三維響應(yīng)曲面圖Fig.7 Contour diagram and 3D response surface diagram of interaction between factors

由圖7 可知，酶解溫度的曲線最陡峭，等高線密集，其次是胰蛋白酶添加量，而中性蛋白酶添加量最平滑、稀疏，說明對結(jié)果影響大小的順序為C>B>A，因素B和C的交互作用對結(jié)果影響最大，與方差結(jié)果分析一致。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝的確定及驗證

利用響應(yīng)面分析Design-Expert 12.0 軟件分析得出復合酶解牡蠣糖胺聚糖的最佳工藝條件為中性蛋白酶添加量0.98%、胰蛋白酶添加量1.30%、酶解溫度47.92 ℃、料液比1∶15（g/mL）、起始pH8.0 及酶解時間4 h，預(yù)測得到的提取率為0.72%。考慮到實際操作中的可行性，將工藝參數(shù)調(diào)整為中性蛋白酶添加量1.00%、胰蛋白酶添加量1.20%、酶解溫度50 ℃、起始pH8.0、酶解時間4 h。在最優(yōu)工藝條件下進行了3 組重復試驗，所得到的牡蠣糖胺聚糖提取率為（0.71±0.12）%，與現(xiàn)有報道的波紋巴菲蛤糖胺聚糖提取率（0.413%）[29]較為接近，優(yōu)于翡翠貽中糖胺聚糖提取率（0.255%）[30]，但低于鹿茸中糖胺聚糖提取率（2.89%）[31]。雖然牡蠣糖胺聚糖的提取率較低，但可與牡蠣肽等活性成分的開發(fā)形成聯(lián)動，獲得系列牡蠣功能產(chǎn)品，充分發(fā)掘、利用牡蠣資源。

2.3 牡蠣糖胺聚糖主要成分分析

對提取獲得的糖胺聚糖粗制品進行了成分檢測，結(jié)果見表6。

表6 牡蠣糖胺聚糖粗制品組成成分分析結(jié)果Table 6 Composition analysis results of oyster glycosaminoglycan coarse products

由表6 可知，牡蠣糖胺聚糖中糖胺聚糖含量為（14.32±0.32）%，糖醛酸含量為（17.08±1.16）%，多糖含量為（15.50±0.05）%，其余為蛋白質(zhì)、無機鹽等雜質(zhì)。表明為得到較高純度的糖胺聚糖，還需進一步精制純化。

2.4 牡蠣糖胺聚糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制結(jié)果

對提取的牡蠣糖胺聚糖進行了α-葡萄糖苷酶活性抑制的研究，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同濃度的牡蠣糖胺聚糖與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Fig.8 α-Glucosidase activity inhibition rates of oyster glycosaminoglycans and acarbose at different concentrations

由圖8 可知，牡蠣糖胺聚糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力呈明顯的量效關(guān)系，濃度在0.2～1.0 mg/mL時，隨著糖胺聚糖濃度的增大，其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用增強。當牡蠣糖胺聚糖粗提物配制濃度為1.0 mg/mL 時，對α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值42.65%，但仍弱于阿卡波糖（88.46%）。糖胺聚糖是天然雜多糖，其生物活性與其溶解性、空間構(gòu)型、取代基、純度等因素密切相關(guān)[8]，表明所得糖胺聚糖還需要進一步純化，以提高對α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

3 結(jié)論

本研究采用復合酶解的提取方法獲得牡蠣糖胺聚糖，通過對中性蛋白酶添加量、胰蛋白酶添加量和酶解溫度3 個因素進行優(yōu)化，得到牡蠣糖胺聚糖復合酶解提取的最佳工藝條件為中性蛋白酶添加量1.00%、胰蛋白酶添加量1.20%、酶解溫度50 ℃，此工藝條件下牡蠣糖胺聚糖提取率為（0.71±0.12）%，接近預(yù)測值0.72%。由此表明經(jīng)過響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化后的條件可用于牡蠣糖胺聚糖的提取工藝，為高效制備牡蠣糖胺聚糖提供了借鑒。通過對制備所得的牡蠣糖胺聚糖粗品進行成分檢測，表明牡蠣糖胺聚糖中糖胺聚糖含量為（14.32±0.32）%，糖醛酸含量為（17.08±1.16）%，多糖含量為（15.50±0.05）%，其余為蛋白質(zhì)、無機鹽等雜質(zhì)，需進一步精制純化得到較高純度的糖胺聚糖。采用PNPG 法，考察以阿卡波糖為陽性對照，對牡蠣糖胺聚糖的α-葡萄糖苷酶抑制能力進行測定，發(fā)現(xiàn)牡蠣糖胺聚糖濃度與α-葡萄糖苷酶活性的抑制率呈明顯的量效關(guān)系，隨著牡蠣糖胺聚糖濃度的增加，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率逐漸增強；但其效果弱于阿卡波糖。牡蠣糖胺聚糖粗制品配制濃度為1.0 mg/mL 時，α-葡萄糖苷酶活性抑制率可達到42.65%，表明其具有一定的降血糖功效。通過進一步的精制純化或結(jié)構(gòu)改性，有望提高其生物活性，并進一步開發(fā)成功能食品。