狹鱈魚蛋白肽對腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰竭小鼠的影響

董晶寧，侯虎

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為全球性的公共健康問題，每年患病人數(shù)不斷增長[1-2]。每年患病人數(shù)不斷增長，高達(dá)2.8 億，發(fā)病率和死亡率高，每年死亡人數(shù)高達(dá)120 萬[3-5]。CKD 的致病機制主要途徑有漸進性腎臟間質(zhì)纖維化、腎小管毛細(xì)血管缺氧和腎小管萎縮導(dǎo)致的腎臟功能破壞[6]，最終導(dǎo)致慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）[7]。CRF的特征是持續(xù)性腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，造成腎小球濾過率降低，腎臟排泄物質(zhì)滯留[7]。目前臨床上尚未有效針對CRF 的治療技術(shù)，仍有大量早期腎病患者進入終末期透析治療階段。

研究表明蛋白質(zhì)水解物對腎損傷具有一定的保護作用。Nasri 等[8]發(fā)現(xiàn)從蝦虎魚中制備得到的肌肉蛋白及其水解物可以抑制高糖飲食誘導(dǎo)小鼠的尿酸及血清肌酐水平的升高，防止腎臟結(jié)構(gòu)變化，改善高熱量飲食大鼠的腎損傷。Hidayat 等[9]從營養(yǎng)支持角度出發(fā)，探究豌豆蛋白水解物保護腎臟功能的作用，研究結(jié)果表明蛋白水解物促進系膜細(xì)胞增殖，降低了糖尿病腎小球硬化系膜細(xì)胞模型的纖連蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的水平。多肽具有多種生物活性，如抗炎活性[10]、抗氧化活性[11]、促進細(xì)胞增殖[12]等，而且營養(yǎng)價值高，吸收性好，作為營養(yǎng)功能組分，在預(yù)防疾病惡化方面具有極大的研究潛力。目前關(guān)于海洋源多肽對腎臟影響作用的研究較少，而狹鱈魚的營養(yǎng)價值極高，并且狹鱈魚蛋白肽具有多種潛在活性[13]。

高濃度的腺嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用在體內(nèi)生成極難溶于水的2，8-二羥基嘌呤，沉積于腎小管后發(fā)生阻塞，抑制了機體氮質(zhì)化合物的排泄，造成機體出現(xiàn)氮質(zhì)血癥、毒素蓄積和電解質(zhì)、氨基酸代謝紊亂，引起的病理特征類似于CRF[14]。腺嘌呤造模具有周期短、死亡率低、技術(shù)難度小等優(yōu)點，已經(jīng)成為常用的腎病模型[15]。

本研究使用腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰竭小鼠模型，探究狹鱈魚蛋白肽對腎臟功能、結(jié)構(gòu)以及炎癥、纖維化因子的影響，旨在揭示狹鱈魚蛋白肽對慢性腎衰竭小鼠的影響，以期為狹鱈魚蛋白肽在腎病預(yù)防以及治療領(lǐng)域的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹鱈魚：青島昱順杰商貿(mào)有限公司；胰蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、肌酐（serum creatinine，Scr）試劑盒：南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量轉(zhuǎn)錄試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；生理鹽水、4%甲醛固定液：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1260）：安捷倫科技（中國）有限公司；質(zhì)譜儀（QTOF 5600）：美國SCIEX 公司；電動顯微鏡（NIKON/Ni-E）：上海通灝光電科技有限公司；超微量分光光度計（Nano-100）：美國Thermo Scientific 公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（FQD-96C）：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 狹鱈魚蛋白肽（protein peptides of pollock，THP）的制備

以狹鱈魚肉為原料，用1.5%胰蛋白酶水解，經(jīng)滅酶、冷卻、100 Da 透析袋除鹽，收集透析液，冷凍干燥，得到狹鱈魚蛋白肽。

1.3.2 THP 理化性質(zhì)的測定

1.3.2.1 THP 分子量的測定

THP 的分子量分布使用高效液相色譜儀測定[16]。分析柱為TSK GEL G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為乙腈∶三氟乙酸∶超純水=30∶0.1∶70（體積比）。所選用的標(biāo)準(zhǔn)品為不同分子量的谷胱甘肽（307 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、牛胰島素（5 733 Da）、細(xì)胞色素C（13 500 Da）和牛血清白蛋白（68 000 Da），以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)（lgM）和保留時間作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)方程（y=-0.200 1x+7.258 1，R2=0.991），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算THP 的分子量。

1.3.2.2 THP 氨基酸組成的測定

根據(jù)GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》[17]，采用氨基酸自動分析儀測定THP 的氨基酸組成。

1.3.2.3 THP 氨基酸評分的計算

根據(jù)Hammad 等[18]的方法進行必需氨基酸評分（amino acid score，AAS）計算，計算公式（1）如下。

式中：A為必需氨基酸評分；S為樣品蛋白質(zhì)中氨基酸含量，mg/g；F為聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織評分標(biāo)準(zhǔn)模式中相應(yīng)必需氨基酸含量（RPa），mg/g。

1.3.3 慢性腎衰竭小鼠模型的建立和給藥方式

慢性腎衰竭小鼠模型的建立參考Wang 等[19]的方法并作一定的修改。6 周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6J 雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機分組，每組10 只，分別為正常組、模型組、陽性藥物組（吡非尼酮藥物治療）、TL 組[THP 400 mg/（kg·d）]、TH 組[THP 800 mg/（kg·d）]。本研究中所有方案和程序經(jīng)中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗動物護理倫理委員會的審批通過。具體實驗分組及給藥方式如下。

1）正常組（CON）：喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。

2）模型組（CRF）：造模期間喂養(yǎng)0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，自由飲水。

3）陽性藥物組（PFD）：造模期間喂養(yǎng)0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，同時灌胃吡非尼酮混懸液[102 mg/（kg·d）]，自由飲水。

4）TL 組、TH 組：造模期間喂養(yǎng)0.2%腺嘌呤飼料，自由飲水，21 d；造模成功后，換為普通飼料，灌胃THP溶液[TL 組400 mg/（kg·d），TH 組800 mg/（kg·d）]，自由飲水。

整個實驗過程中，每日觀察小鼠的生長狀態(tài)，每周記錄小鼠的體質(zhì)量。藥物作用28 d 后，進行眼部取血，然后解剖采取腎臟組織，記錄腎臟組織質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)（R，mg/g），計算公式（2）如下。

式中：W為腎臟質(zhì)量，mg；M為體質(zhì)量，g。

1.3.4 小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察

取小鼠腎臟組織于4%甲醛固定液中48 h，石蠟包埋，使用冷凍切片機得到厚度為4 μm 的切片，對切片進行蘇木精-伊紅（H＆E）染色和馬松（Masson）染色，使用電動光學(xué)顯微鏡拍攝染色照片。

1.3.5 小鼠血清生化指標(biāo)的測定

小鼠禁食12 h 后取材，采集小鼠血液后，于常溫下靜置1～2 h，使血清分層，6 000 r/min、4 ℃離心40 min，取上層血清，使用試劑盒測定尿素氮、肌酐含量。

1.3.6 小鼠腎臟組織中因子mRNA 水平的測定

稱取50～100 mg 腎臟組織，使用Trizol 法提取總mRNA，使用超微量分光光度計測定吸光度（OD 值），OD260/280范圍在1.8～2.0 之間表明RNA 純度較好。根據(jù)試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系：總RNA 1 μg；4×g DNA wiper Mix 4 μL；Rnase-free ddH2O 補足至16 μL；42 ℃反應(yīng)5 min；5×HiScript ⅡqRT SuperMixⅡ4 μL；50 ℃反應(yīng)15 min；85 ℃反應(yīng)5 s。cDNA 溶液于-80 ℃冷凍保存。

以cDNA 為模板，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，實時熒光定量PCR 進行定量分析，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量-PCR 反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences of real time quantitative-PCR

反應(yīng)體系：cDNA 2 μL；Primer 1（10 μmol/L）0.4 μL；Primer 2（10 μmol/L）0.4 μL；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL；ddH2O 7.2 μL。擴增程序：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，延伸95 ℃、15 s，40 個循環(huán)；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。每個樣品設(shè)置兩個復(fù)孔，采用2-△△Ct法進行相對定量分析[20]。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析采用SPSS 25.0 以及Graghpad 軟件進行分析處理，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 THP 的理化性質(zhì)測定結(jié)果

THP 的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 THP 的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of THP

由圖1 可知，THP 的出峰時間為24.984 min，計算得分子量為181.47 Da。分子量小于1 000 Da，屬于小分子肽，具有結(jié)構(gòu)簡單、易于吸收等優(yōu)點。

THP 的氨基酸組成見表2。

表2 THP 的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of THP

由表2 可知，谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量都較高。由表中數(shù)據(jù)可以看出，氨基酸種類齊全，THP 可以作為一種潛在優(yōu)質(zhì)蛋白來源。

THP 的氨基酸評分見表3。

表3 THP 的必需氨基酸評分Table 3 Essential amino acid score of THP

由表3 可知，THP 的必需氨基酸種類齊全且大部分必需氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸）的氨基酸評分大于1.0，其氨基酸組成符合人體對氨基酸的需求，說明THP 可以作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，為人體提供能量。

2.2 THP 對慢性腎衰竭小鼠的生理狀態(tài)和臟器指數(shù)的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠的體質(zhì)量和腎臟指數(shù)的影響見圖2。

圖2 THP 對慢性腎衰竭小鼠的體質(zhì)量和腎臟指數(shù)的影響Fig.2 Effects of THP on the body mass and kidney index in the mouse model of chronic renal failure

實驗期間，對小鼠的生長狀態(tài)進行觀察。CON 組小鼠反應(yīng)靈敏，活動力強；皮毛呈現(xiàn)亮黑色且具有光澤度。CRF 組小鼠的精神狀態(tài)明顯下降，反應(yīng)遲鈍，活動力減弱；皮毛光澤度下降且變稀疏；墊料易潮濕，表現(xiàn)出多飲多尿癥狀，糞便干燥，出現(xiàn)一定程度的血尿。28 d 干預(yù)期間，TL、TH 組小鼠活動力明顯增強，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，皮毛光澤度增加。因此，THP 可以很好地改善慢性腎衰竭小鼠的生長狀態(tài)。

由圖2A 可知，28 d 時，與CRF 組相比，PFD、TH組[800 mg/（kg·d）]的小鼠體質(zhì)量逐漸增加，而[400 mg/（kg·d）]THP 對慢性腎衰竭小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。

組織器官損傷程度可以通過組織器官的質(zhì)量變化來間接反映，腎臟指數(shù)是反映腎功能的半定量指標(biāo)[21]。干預(yù)28 d 后，取各組小鼠的腎臟組織稱重、計算腎臟指數(shù)。由圖2B 可知，CON 組的腎臟指數(shù)為12.82 mg/g，CRF 組的腎臟指數(shù)為14.69 mg/g。與CON 組相比，CRF腎臟指數(shù)極顯著上升（P＜0.01），表明模型組小鼠出現(xiàn)腎臟損傷和水腫。PFD、TL 組和TH 組的腎臟指數(shù)分別為10.27、11.01、10.07 mg/g，與CRF 組相比，PFD 組小鼠的腎臟指數(shù)下降（P＜0.01），TL組和TH 組小鼠的腎臟指數(shù)分別下降了25.05%和31.45%，表明THP 對改善慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷有促進作用。

2.3 THP 對慢性腎衰竭小鼠血清生化指標(biāo)的影響

上述結(jié)果表明，THP 對慢性腎衰竭的腎臟損傷有改善作用。測定慢性腎衰竭小鼠的血清尿素氮和肌酐含量的變化，分析THP 對腎臟功能的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 THP 對慢性腎衰竭小鼠的尿素氮和肌酐含量的影響Fig.3 Effects of THP on urea nitrogen and creatinine content in mice with chronic renal failure

機體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物尿素氮，主要通過腎小球的濾過作用排出體外[22]。臨床上，尿毒氮是判斷腎小球濾過率功能的重要指標(biāo)之一。由圖3A 可知，與CON 組相比，CRF 組血清尿素氮含量升高了3.31 mmol/L（P＜0.01），表明腺嘌呤飲食對小鼠的腎臟功能具有損害作用，表現(xiàn)出腎損傷。經(jīng)過28 d 干預(yù)后，PFD、TL、TH組尿素氮含量分別為12.04、11.70、11.39 mmol/L，與CRF 組相比，TL 組和TH 組小鼠的尿素氮含量下降了16.55%和18.76%。并且，隨著THP 作用劑量的增加，尿素氮含量下降程度增大。

機體內(nèi)產(chǎn)生的血肌酐在腎小球過濾作用下，經(jīng)過尿液排出體外，是評價腎臟功能的一項指標(biāo)[23]。由圖3B可知，CON 和CRF 組血肌酐含量分別為25.84 μmol/L和55.49 μmol/L，CRF 組小鼠的血肌酐含量是CON組的2 倍，表現(xiàn)出腎功能不全。28 d 干預(yù)后，TL、TH 組血肌酐含量分別為36.19 μmol/L 和35.31 μmol/L。與CRF 組相比，THP 極顯著降低了慢性腎衰竭小鼠的血肌酐含量（P＜0.01），并且具有劑量依賴性，TL 組和TH組小鼠的血肌酐含量分別降低了34.78%和36.37%。

綜合以上實驗結(jié)果，THP 對改善腎臟功能具有顯著作用。

2.4 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織狀態(tài)的影響

觀察小鼠的腎臟形態(tài)，如圖4A所示。為了研究THP 對腎臟結(jié)構(gòu)的影響，取小鼠的腎臟進行染色處理，H＆E 染色結(jié)果如圖4B所示，Masson 染色結(jié)果如圖4C所示。

圖4 THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of THP on kidney histopathology in the mouse model of chronic renal failure

由圖4A 可知，CON 組小鼠雙腎大小、色澤均正常，呈現(xiàn)紅褐色，表面光滑且有光澤；CRF 組小鼠腎臟萎縮，質(zhì)地變軟，呈現(xiàn)出灰白色，表面無光澤且凹凸不平，表現(xiàn)出明顯的腎損傷。與CRF 組相比，TL、TH 組小鼠腎臟逐漸恢復(fù)，色澤和形態(tài)有所改善，凹凸不平癥狀有所減輕，表明THP 可以改善慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷并具有劑量依賴性。

由圖4B 可知，CON 組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整且清晰，腎小球皮質(zhì)和髓質(zhì)輪廓清晰，腎小管大小、形狀、間質(zhì)面積正常，腎小管腔無擴張，腎小管上皮細(xì)胞有序排列，腎間質(zhì)無膠原纖維組織增生，無炎癥浸潤。CRF 組腎小球數(shù)量減少，腎小管上皮細(xì)胞脫落，腎小管間質(zhì)不規(guī)則，管腔擴張，炎性細(xì)胞浸潤。TL、TH 組小鼠腎臟的管腔擴張明顯減輕，腎間質(zhì)炎性浸潤減輕。

腎小管間質(zhì)纖維化與CKD 向ESRD 進展密切相關(guān)[24]。由圖4C 可知，肌原纖維被染成紅色，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色。CON 組小鼠的腎小球、腎小管及間質(zhì)狀態(tài)均正常，未見間質(zhì)纖維化；CRF 組呈藍(lán)色的纖維性腎組織廣泛分布，腎小球、腎小管及腎間質(zhì)沉積大量膠原纖維，表明慢性腎衰竭小鼠的腎臟間質(zhì)損傷嚴(yán)重。與CRF 組相比，THP 干預(yù)28 d 后，腎損傷面積明顯減少。

以上染色結(jié)果說明，THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎損傷具有一定的保護作用。

2.5 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中炎癥因子mRNA 相對水平的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟中促炎因子在mRNA水平的影響見圖5。

圖5 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中炎癥因子mRNA 水平的影響Fig.5 Effects of THP on the mRNA levels of inflammatory cytokines in the kidney tissue of the mouse model of chronic renal failure

有大量研究表明，炎癥細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6[25]等）誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生，炎癥的持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致白細(xì)胞募集、小管細(xì)胞凋亡、腎小管萎縮以及間質(zhì)纖維化[26]。由圖5 可知，與CON 組相比，CRF 組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平極顯著升高（P＜0.01）。與CRF 組相比，THP 極顯著下調(diào)慢性腎衰竭小鼠腎臟炎癥因子水平（P＜0.01），并且具有劑量依賴性。這說明THP 對慢性腎衰竭小鼠的腎臟炎癥具有一定的抑制作用，與腎臟組織的H&E 染色結(jié)果一致。

2.6 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中纖維化因子mRNA 相對水平的影響

THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟中促纖維化因子在mRNA 水平的影響見圖6。

圖6 THP 對慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中纖維化因子mRNA 水平的影響Fig.6 Effects of THP on the mRNA levels of fibrotic factors in the kidney tissue of the mouse model of chronic renal failure

TGF-β1 通過與膜上TGFβ II 型受體（TβRII）、TGFβ Ⅰ型受體（TβRⅠ）結(jié)合使Smad2/3 磷酸化[27]，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)靶基因如COL1、a-SMA 和FN1 的轉(zhuǎn)錄，促使腎臟間質(zhì)纖維化[28-30]。由圖6可知，與CON 組相比，CRF 組中纖維化因子COL1、FN1 的mRNA 水平極顯著上升（P＜0.01）。干預(yù)28 d 后，與CRF 組相比，TH 組慢性腎衰竭小鼠腎臟組織中的COL1 因子的mRNA 水平顯著下降（P＜0.05）；FN1 因子的mRNA水平極顯著下降（P＜0.01）。這說明THP 可以減輕慢性腎衰竭小鼠的腎臟纖維化，并且具有劑量依賴性，與腎臟組織的Masson 染色結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究探究了狹鱈魚蛋白肽THP 對腺嘌呤誘導(dǎo)慢性腎衰竭小鼠的影響作用。結(jié)果表明，THP 干預(yù)了小鼠體質(zhì)量下降，顯著降低了腎臟指數(shù)，降低了血清尿素氮和肌酐含量，有助于改善腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷，同時下調(diào)炎癥和纖維化因子mRNA 水平，可以有效緩解慢性腎衰竭小鼠的腎臟損傷程度。因此，THP 在預(yù)防腎臟疾病領(lǐng)域具有很好的潛質(zhì)。