龍安柚果皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化

趙 靜,譚 玉,房可欣,吳 霜,柳 廷,王慶彪

(廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川廣安,638000)

龍安柚(Citrusgrandis‘Longanyou’)產(chǎn)于四川省廣安市,果肉粉紅,肉質(zhì)脆嫩,酸甜適中,汁多,少核或無(wú)核,于2008年獲準(zhǔn)成為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[1]。近年來(lái),龍安柚作為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品得到了大力發(fā)展,正逐步成為新的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一[2]。在龍安柚的銷售與加工過程中,柚皮多被廢棄。果膠是一種存在于水果、蔬菜等植物壁中特有的直線型高分子多糖聚合物,因具有良好的膠凝性、乳化穩(wěn)定性和生理功效,而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、煙草以及紡織行業(yè)[3]。柚皮富含果膠,利用龍安柚的果皮提取果膠,可以減少柚皮資源浪費(fèi),提升柚果附加值,有利于提高龍安柚產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定性。果膠大多數(shù)存在于植物細(xì)胞壁中,原果膠難溶于水,并且植物硬度與原果膠含量有關(guān)[4],經(jīng)過酸、堿、鹽、酶或超聲波等外界因素的作用,再經(jīng)過分離工藝,可提取出細(xì)胞壁中的水溶性果膠。果膠提取法主要有超聲提取法、微波提取法、酸提取法、萃取法、離子交換法和酶提取法等,不同的提取方法各有優(yōu)劣,目前生產(chǎn)中常用的植物果膠提取方法是將多種方法結(jié)合的復(fù)合提取法[5]。已有研究者對(duì)酶法協(xié)同超聲波輔助酸法提取馬家柚果皮果膠的工藝進(jìn)行了探索[6]。針對(duì)龍安柚的研究報(bào)道已經(jīng)涵蓋育種栽培、保鮮、果皮加工和天然產(chǎn)物提取等方面[7-11],但尚未見龍安柚柚皮果膠提取工藝的研究報(bào)道。本研究采用超聲波輔助復(fù)合酶法提取龍安柚柚皮果膠,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響龍安柚柚皮果膠得率的主要因素,再采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化果膠提取工藝,為后續(xù)進(jìn)一步分析龍安柚柚皮果膠理化特性、功能性和深加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍安柚果實(shí)為廣安本地市售。纖維素酶(2×104U/g)、木瓜蛋白酶(8×105U/g)和無(wú)水檸檬酸(均為食品級(jí)),由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。無(wú)水乙醇,重慶川東化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器和設(shè)備

超聲清洗機(jī)(KH5200DE,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司),恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司),pH計(jì)(PHS-3C ,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司),數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司),臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司),粉碎機(jī)(艾澤拉電器有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柚皮預(yù)處理 新鮮龍安柚果實(shí)洗凈后,取果皮切成1 cm ×1 cm顆粒,于沸騰蒸餾水中漂燙5 min,置于50 ℃干燥箱中烘干,磨碎,過60目篩,將制備好的柚皮粉放于干燥器中密封備用。

1.3.2 柚皮果膠提取工藝 稱取適量柚皮粉于錐形瓶中,根據(jù)不同料液比加入蒸餾水,加入一定比例的兩種酶,水浴酶解前加入無(wú)水檸檬酸調(diào)節(jié)提取液至不同pH值,于不同溫度下水浴酶解一定時(shí)間,設(shè)置一定超聲功率、時(shí)間和溫度在超聲波清洗機(jī)中提取果膠,完成提取后于離心機(jī)中離心10 min(4 000 轉(zhuǎn)/min),取上清液。加入2倍體積的無(wú)水乙醇于上清液中,攪拌后靜置30 min,離心15 min(6 000轉(zhuǎn)/min ),棄上清液,保留沉淀,置于35 ℃烘箱中干燥至恒重,得到果膠。

1.3.3 工藝優(yōu)化試驗(yàn) 單因素試驗(yàn):分別對(duì)料液比(1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55 g/mL)、復(fù)合酶比例(預(yù)設(shè)酶添加總量為柚皮粉質(zhì)量的2%[6],纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,質(zhì)量比)、提取液pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)、酶解時(shí)間(30、40、50、60、70 min)、超聲功率(40、50、60、70、80 W)、超聲提取時(shí)間(15、20、25、30、35 min)和超聲提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。不是試驗(yàn)因素時(shí),各因素的設(shè)定值如下:料液比為1∶40,提取液pH值5.0,復(fù)合酶比例(纖維素酶∶木瓜蛋白酶)為1∶3,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間60 min,超聲功率70 W,超聲提取溫度50 ℃,超聲提取時(shí)間30 min。單因素試驗(yàn)每處理組稱取5 g柚皮粉,并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn):在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以果膠得率作為響應(yīng)值,對(duì)料液比、提取液pH值、復(fù)合酶比例、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲提取時(shí)間、超聲功率、超聲提取溫度8個(gè)影響因素進(jìn)行評(píng)價(jià),試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝Plackett-Burman設(shè)計(jì)(因素與水平編碼)

Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn):根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果,選取提取液pH值、酶解時(shí)間、超聲功率和超聲提取溫度4個(gè)因素作為自變量,以柚皮果膠得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),探索最佳工藝條件,并開展驗(yàn)證試驗(yàn)。Box-Behnken設(shè)計(jì)見表2。

表2 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)(因素與水平編碼)

1.3.4 果膠得率計(jì)算 果膠得率(%)=(提取的果膠質(zhì)量/干燥柚皮粉質(zhì)量)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Minitab19軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析;Design-Expert 8.05 軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1A可知,果膠得率隨著提取液(蒸餾水)比例的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)料液比為1∶40時(shí)果膠得率最大。這可能是溶劑浸入植物細(xì)胞中,加快果膠水解溶出,當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí),提取液比例太大,溶液中果膠濃度下降,不利于溶出。

注:不是試驗(yàn)因素時(shí)的設(shè)定值,料液比為1∶40,提取液pH值5.0,復(fù)合酶比例(纖維素酶∶木瓜蛋白酶)為1∶3,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間60 min,超聲功率70 W,超聲提取溫度50 ℃,超聲提取時(shí)間30 min。圖1 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取各單因素對(duì)果膠得率的影響

由圖1B可知,果膠得率隨著pH值增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)pH值為5.0時(shí)果膠得率最大。這是因?yàn)閺?fù)合酶在最適pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出最強(qiáng)活性,高于或低于這個(gè)范圍,復(fù)合酶的活性降低。

由圖1C可知,果膠得率隨著酶解提取時(shí)間增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),當(dāng)時(shí)間為30 min時(shí)果膠得率最大。這可能是由于提取時(shí)間較少時(shí),果膠未完全水解,導(dǎo)致果膠得率較低,當(dāng)提取時(shí)間超過長(zhǎng)時(shí),溶出的果膠在酸性環(huán)境下被分解或破壞,導(dǎo)致果膠得率下降[12]。

由圖1D可知,隨著酶解溫度的升高,果膠得率先增加后減少,當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí),果膠得率最大,這可能是由于復(fù)合酶在最適溫度范圍內(nèi)活性最大,當(dāng)?shù)陀诨蚋哂谶@個(gè)范圍,復(fù)合酶活性降低,因此最佳酶解溫度選擇50 ℃。

由圖1E可知,果膠得率隨著酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng)時(shí),會(huì)導(dǎo)致果膠水解,反而降低果膠得率。

由圖1F可知,果膠得率隨著復(fù)合酶中木瓜蛋白酶比例的增大呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)趨勢(shì),當(dāng)纖維素酶和木瓜蛋白酶比例為1∶3時(shí)果膠得率最大,這與周文俊等在提取檸檬果膠時(shí)所得結(jié)果一致[13],當(dāng)木瓜蛋白酶用量較高時(shí),部分酶會(huì)相互附著,導(dǎo)致果膠得率不再增加[14]。

由圖1G可知,果膠得率隨著超聲功率的增大先上升后下降,超聲功率為70 W時(shí)果膠得率最大。這可能是因?yàn)檫m宜的超聲功率,其空化作用使柚皮細(xì)胞壁破裂,果膠溶出,當(dāng)超聲功率過高,超聲波的空化作用過強(qiáng),導(dǎo)致果膠水解過度,裂解成了多糖分子[15]。

由圖1H可知,果膠得率隨著超聲提取溫度的升高先上升后下降,溫度50 ℃時(shí)果膠得率最大。這可能是因超聲提取溫度為50 ℃時(shí)酶促反應(yīng)比較完全,隨著溫度繼續(xù)上升,使復(fù)合酶活性降低。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

采用 Minitab 19軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)見表4。由表4可知,因素X2(提取液pH值)、X5(酶解時(shí)間)、X7(超聲功率)和X8(超聲提取溫度)對(duì)果膠得率影響顯著(p<0.05),且這4個(gè)因素對(duì)果膠得率影響排序?yàn)閄8>X7>X5>X2;因素X1(料液比)、X3(超聲提取時(shí)間)、X4(酶解溫度)和X6(復(fù)合酶比例)對(duì)果膠得率影響不顯著。因此,選擇因素X2、X5、X7和X8進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),綜合考慮提取效率和成本,將因素X1、X3、X4和X6分別固定為1∶40、30 min、50 ℃和1∶3。

表3 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表4 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn) Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表5。采用Design-Expert 8.0.5對(duì)表5中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸,得到果膠得率(Y)對(duì)提取液pH值(A)、酶解時(shí)間(B)、超聲功率(C)以及超聲提取溫度(D)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=27.33+0.40A-0.61B-0.62C+1.29D-0.57AB+0.50AC+0.033AD-0.0075BC-0.41BD-1.09CD-2.53A2-2.94B2-2.86C2-5.59D2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表6?；貧w模型具有極顯著性(p<0.000 1),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),說明該回歸模型可靠,可用于龍安柚柚皮果膠得率的優(yōu)化。該模型決定系數(shù)R2為0.988 7,表明該模型擬合度較好;校正決定系數(shù)為0.977 3,說明有約97.73%的果膠得率可以由該模型進(jìn)行解釋。一次項(xiàng)因素B、C、D,二次項(xiàng)因素A2、B2、C2、D2和交互項(xiàng)CD對(duì)果膠得率影響極顯著(p<0.01),一次項(xiàng)因素A和交互項(xiàng)AB的影響為顯著水平(p<0.05),交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD則對(duì)果膠得率無(wú)顯著影響。各一次項(xiàng)因素對(duì)果膠得率的影響程度為:D>C>B>A,與Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果一致。超聲提取溫度(D)與超聲功率(C)影響果膠得率的響應(yīng)曲面見圖2,果膠得率隨著超聲功率和超聲提取溫度的升高均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),果膠得率存在極大值。

表5 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 龍安柚柚皮果膠超聲波輔助復(fù)合酶法提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果

圖2 超聲功率與超聲提取溫度對(duì)果膠得率的影響

2.3.2 最佳提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 采用Design-Expert 8.0.5軟件分析,確定提取柚皮果膠最佳工藝為提取液pH值5.04、酶解時(shí)間58.79 min、超聲功率68.73 W、超聲提取溫度51.32 ℃。在此條件下,柚皮果膠得率最大理論值為27.51%。結(jié)合試驗(yàn)可操作性,優(yōu)化最佳工藝為提取液pH值5.0、酶解時(shí)間59 min、超聲功率70 W、超聲提取溫度51 ℃[其他條件:料液比1∶40、復(fù)合酶(纖維素酶∶木瓜蛋白酶)比例1∶3、酶解溫度50 ℃、超聲提取時(shí)間30 min。對(duì)優(yōu)化最佳工藝進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),柚皮果膠得率平均值為27.43%,比最大理論值低0.08百分點(diǎn),比劉媛潔等[6]采用單一纖維素酶(2×104U/g)酶協(xié)同超聲波輔助酸法優(yōu)化最佳工藝[酶用量1.7%、超聲功率260 W、超聲提取溫度83 ℃、超聲提取時(shí)間50 min、酶解時(shí)間70 min、料液比(g/mL)1∶25、提取液pH值2.0]提取馬家柚柚皮果膠的平均得率(27.01%)高0.42百分點(diǎn),并且酶解時(shí)間減少11 min。可見,本試驗(yàn)所得優(yōu)化最佳工藝對(duì)于柚皮果膠的提取具有較高的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

試驗(yàn)所得超聲波輔助復(fù)合酶法提取龍安柚柚皮果膠的最佳提取工藝為:料液比1∶40、提取液pH值5.0、復(fù)合酶(纖維素酶∶木瓜蛋白酶)比例1∶3、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間59 min、超聲功率70 W、超聲提取溫度51 ℃、超聲提取時(shí)間30 min。在工藝條件下,果膠得率平均值為27.43%。