沙子空心李離體快繁體系建立及組培苗遺傳變異檢測

李蕊蕊,吳茂宏,任菲宏,王 貴,張曼瑩,閆藝心,喬 光

(1 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽,550025;2 銅仁市林業(yè)科學(xué)院,貴州銅仁,554300;3 銅仁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州銅仁,554300)

沙子空心李(PrunussalicinaLindl. ‘Shazikongxinli’)產(chǎn)自貴州省沿河土家族自治縣,是該縣地方特色水果,其成熟果實(shí)肉核分離,色綠酥脆,酸甜可口,被消費(fèi)者譽(yù)為“李中茅臺”,2006年獲得國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù),沙子空心李產(chǎn)業(yè)已成為沿河土家族自治縣脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興的重點(diǎn)農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)[1-2]。目前,沿河土家族自治縣沙子空心李產(chǎn)業(yè)存在著因采用傳統(tǒng)的扦插繁殖及分株繁殖導(dǎo)致品種退化、栽種新苗存活率低等迫切需要解決的生產(chǎn)問題。利用離體培養(yǎng)技術(shù)可以短期內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)苗,在蘋果[3]、火龍果[4]、草莓[5]、香蕉[6]和葡萄[7]等果樹生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。有研究指出,隨著組培材料繼代增殖次數(shù)的增加,組培苗極易產(chǎn)生遺傳變異,種苗優(yōu)良種性難以保持[8]。因此,實(shí)施離體快繁時(shí)需要對組培苗遺傳變異進(jìn)行檢測[9-10]。本研究建立了沙子空心李離體快繁培養(yǎng)體系,并利用ISSR和SSR分子標(biāo)記對增殖苗進(jìn)行遺傳變異檢測,旨在為工廠化繁育優(yōu)質(zhì)種苗提供技術(shù)支撐,解決目前沙子空心李產(chǎn)業(yè)發(fā)展欠缺優(yōu)質(zhì)種苗的問題。

1 材料與方法

1.1 材料來源材料采自貴州省沿河土家族自治縣十二盤村沙子空心李種植基地,于2021年12月至2022年1月選取長勢強(qiáng)、無病害成年樹上帶有健壯飽滿休眠芽的枝條為外植體。

1.2 材料消毒將采集的枝條進(jìn)行修剪,剪成長1～2 cm、含休眠芽的莖段,在流動(dòng)自來水下沖洗15 min,無菌水漂洗5次后用無菌紗布擦盡多余水分,放入超凈工作臺。在超凈工作臺上,對莖段用75%酒精浸泡消毒30 s,無菌水漂洗3次(震蕩洗滌),用0.1%HgCl2消毒不同時(shí)間(6、8、10、12、14 min),無菌水漂洗5次,取無菌濾紙吸干表面水分,剪去莖段兩端0.3～0.4 cm,剝?nèi)パ客怊[片,接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L初代培養(yǎng)基中。0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間每個(gè)處理接種30個(gè)休眠芽,重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后,檢查外植體污染情況、褐變情況和萌發(fā)情況。污染率=(污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;褐變率=(褐化外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;萌發(fā)率=(萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

1.3 增殖培養(yǎng)基篩選待休眠芽萌發(fā)至1～2 cm時(shí),將其從基部斜切下來,選取長勢基本一致的萌發(fā)苗接種于不同植物生長調(diào)節(jié)劑配方的增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以6-BA(A)、NAA(B)、GA3(C)為試驗(yàn)因子,各因子3個(gè)水平,采用L9(33)正交設(shè)計(jì)(表1)。每處理接種20個(gè)萌發(fā)苗,重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后,觀察組培苗生長情況,統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=增殖苗株數(shù)/接種組培苗株數(shù)。

表1 沙子空心李增殖培養(yǎng)基篩選采用L9(33)正交設(shè)計(jì)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合處理

1.4 生根培養(yǎng)基篩選以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以不同質(zhì)量濃度IBA(0.1、0.5、1.0 mg/L)及NAA(0、0.2、0.5 mg/L)組合成9種生根培養(yǎng)基處理。每種處理接種4株組培苗,重復(fù)5次。培養(yǎng)50 d后,統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、平均根長及植株長勢。生根率=生根植株數(shù)/接種組培苗總數(shù)×100%;平均生根數(shù)=總根數(shù)/植株總數(shù);平均根長=所有根的長度和/植株根總數(shù)。

1.5 移栽選取株高2～3 cm并帶有3～6條不定根的健壯組培苗,連瓶置于溫室內(nèi)煉苗5 d,然后打開瓶蓋露置2 d,再取出組培苗,洗凈根部附著的培養(yǎng)基,移栽到草炭∶珍珠巖=1∶1(體積比)的滅菌營養(yǎng)土中。移栽30 d后,觀察植株長勢,并統(tǒng)計(jì)成活率。成活率=(成活數(shù)/移栽數(shù))×100%

1.6 遺傳變異的ISSR檢測繼代第1代至第5代組培苗每代隨機(jī)選取3株幼苗,分別用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取葉片DNA,用0.1%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,于-20 ℃保存。以每代組培苗DNA為模板,選取21條ISSR引物(序列見表2),進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳后統(tǒng)計(jì)條帶數(shù),進(jìn)行ISSR遺傳變異檢測。PCR引物、反應(yīng)體系及程序參考田田[8]。

表2 沙子空心李組培苗遺傳變異ISSR檢測所用引物及序列

1.7 遺傳變異的SSR檢測以每代組培苗DNA為模板,選取22對引物(引物1～12參考?xì)W昱岑[11],引物13～22參考李興婷[12],序列見表3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,聚丙烯酰胺電泳統(tǒng)計(jì)條帶數(shù),進(jìn)行SSR遺傳變異檢測。SSR-PCR反應(yīng)體系為10 μL,含0.5 μL引物(10 mmol/μL),1.0 μL DNA(40～50 ng/μL),5.0 μL 預(yù)混液(天根生化科技有限公司2×Tap Plus Master Mix),3.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火(溫度依引物而定)30 s,72 ℃延伸60 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

6%聚丙烯酰胺凝膠總體積25 mL,各組分依次加入40% PAGE原液3.25 mL、10×TBE緩沖液2.5 mL、尿素10.5 g、ddH2O補(bǔ)足25 mL,待其溶解后用濾紙過濾出雜質(zhì),同時(shí)加入10%APS原液100 μL及TEMED 19 μL,搖晃混勻后灌膠、凝膠。聚丙烯酰胺電泳步驟參考梅利那[13]。

1.8 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行鄧肯氏新復(fù)極差法差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對休眠芽萌發(fā)的影響由表4可知,隨著0.1%HgCl2消毒時(shí)間從6 min增加至14 min,沙子空心李莖段污染率逐漸降低,最低達(dá)22.22%;褐化率逐漸升高,最高達(dá)到63.33%;萌發(fā)率先升后降,消毒14 min時(shí)最低,僅為14.45%。消毒時(shí)間為10 min時(shí),休眠芽污染率(34.44%)和褐化率(23.33%)居中,萌發(fā)率最高,新梢呈嫩綠色、長勢良好,葉片舒展(見圖1A)。因此,0.1%HgCl2消毒10 min是建立沙子空心李休眠芽無菌系的最佳消毒時(shí)間。

表4 不同消毒時(shí)間沙子空心李莖段外植體的組培效果

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對增殖培養(yǎng)的影響

由表5可見,處理9的增殖系數(shù)最高為7.15,但此時(shí)增殖苗整體呈玻璃化,葉片脆且易斷。處理3和處理6也出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。處理1、處理2和處理3的增殖芽較少,部分出現(xiàn)無增殖芽的現(xiàn)象。處理4的增殖系數(shù)為5.15,增殖苗葉片呈綠色,莖干較粗且植株健壯(見圖1B、C)。因此,適宜沙子空心李組培苗增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對沙子空心李組培苗增殖的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對生根培養(yǎng)的影響由表6可見,組培苗在5號培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L)中生根率最高(65%),平均生根數(shù)最多(6.38條),平均根長最長(9.35 cm),植株生長最好,葉片大且呈翠綠色,莖干粗壯(見圖1D),主根粗壯須根多(見圖1E)。當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí)(處理3、處理6和處理9)對組培苗生根有一定抑制作用,且植株長勢較弱生長慢,呈矮小狀。

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對沙子空心李組培苗生根的影響

2.4 移栽成活率將植株健壯且根系生長良好的組培苗煉苗移栽(50株),30 d后成活率達(dá)74%,且長勢較好(見圖1F)。

2.5 ISSR遺傳變異檢測利用21條ISSR引物,對繼代1～5代的沙子空心李幼苗葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,共擴(kuò)增出98條清晰的譜帶,不同引物擴(kuò)增出的譜帶數(shù)為3～7條,平均擴(kuò)增4.7條,DNA長度在250～2 000 bp之間,98條帶全部為單態(tài)帶。表明,在所用ISSR引物檢測范圍內(nèi)沙子空心李增殖繼代1～5次均未發(fā)生遺傳變異。部分引物擴(kuò)增的譜帶見圖2。

注:A:引物811;B:引物873。M為相對分子質(zhì)量標(biāo)記,1～5為隨機(jī)抽取的第1代至第5代組培苗,a、b、c為每代組培苗的3個(gè)重復(fù)。圖3同。圖2 不同繼代次數(shù)組培苗遺傳變異的ISSR檢測

2.6 SSR遺傳變異檢測利用22對SSR引物對沙子空心李增殖繼代1～5代的組培苗葉片DNA進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增出57條清晰的譜帶,各引物擴(kuò)增出的譜帶數(shù)為2～5條,平均每個(gè)擴(kuò)增2.6條,DNA長度在100～500 bp之間,57條帶全部為單態(tài)帶。表明,在所用SSR引物檢測范圍內(nèi)沙子空心李在增殖繼代5次內(nèi)組培苗未發(fā)生遺傳變異。部分引物擴(kuò)增出的譜帶見圖3。

圖3 不同繼代次數(shù)組培苗遺傳變異的SSR檢測(引物CPSCT18)

3 討論與結(jié)論

沙子空心李是貴州省特有的地方品種。目前沿河土家族自治縣沙子鎮(zhèn)繁育空心李多采用扦插及分株的方法。扦插繁殖,短期成活率高,產(chǎn)苗量大,但扦插苗無主根,根系較淺,不易長時(shí)間存活,且長期扦插繁殖導(dǎo)致了品種退化。由于缺乏規(guī)范的苗木生產(chǎn)技術(shù),僅靠傳統(tǒng)的扦插繁殖難以滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求[14]。沙子空心李樹容易萌發(fā)根蘗苗,可利用其進(jìn)行分株繁殖,此法雖能保持種性,但繁殖速度慢,不適合大量繁殖。植物離體培養(yǎng)能夠有效地縮短繁殖周期,穩(wěn)定地遺傳優(yōu)良性狀,為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料[15]。離體培養(yǎng)過程中外植體消毒極為重要,消毒時(shí)間過長會導(dǎo)致材料活力弱、褐化、死亡嚴(yán)重,影響萌發(fā);時(shí)間過短,則消毒不徹底,會導(dǎo)致外植體接種后未萌發(fā)就污染,成活率低。對于木質(zhì)化程度高的枝條莖段,通過延長消毒時(shí)間可將表面真菌等很好地除去,但內(nèi)生菌污染會很嚴(yán)重[16]。本研究以沙子空心李休眠芽為外植體,用0.1% HgCl2消毒10 min,配合萌發(fā)后切下新芽轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基,有效減少了莖段木質(zhì)部內(nèi)生菌污染新生芽的情況發(fā)生,萌發(fā)率達(dá)到42.22%,萌發(fā)出的芽長勢好且葉片舒展呈嫩綠色。

陳曦等[17]在歐洲李增殖培養(yǎng)基中加入6-BA 0.7 mg/L、NAA 0.3 mg/L,增殖系數(shù)達(dá)到2.8。韓曉瑩等[18]以貴州酥李莖段為研究對象,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)基中加入KT 1.0 mg/L、IBA 0.1 mg/L及GA31.0 mg/L,增殖苗長勢好,植株健壯,增殖系數(shù)為3.5。浦艷吉等[19]研究歐洲李離體培養(yǎng)時(shí),在增殖培養(yǎng)基中加入6-BA 0.5 mg/L及GA30.5 mg/L,增殖系數(shù)僅為2.06。本研究采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行增殖培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA、GA3)配比篩選,結(jié)果表明增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L時(shí),增殖系數(shù)可達(dá)5.15,增殖苗葉片呈綠色,莖干較粗,長勢較好。研究還發(fā)現(xiàn),NAA為1 mg/L時(shí),沙子空心李組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。由此推測,較高濃度的生長素會導(dǎo)致沙子空心李組培苗玻璃化。

李晶等[20]在君遷子生根培養(yǎng)基中加入IBA 1.0 mg/L,生根率達(dá)58.14%。高壯壯等[21]在探索優(yōu)化蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)體系時(shí)發(fā)現(xiàn),幼苗生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L,生根率為73.7%。本研究用不同濃度配比的IBA及NAA篩選最佳生根培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)IBA對組培苗的生根作用顯著,NAA起輔助作用,但若NAA濃度提高到0.5 mg/L時(shí),植株呈矮小黃化現(xiàn)象,這與增殖實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果保持一致,故沙子空心李離體培養(yǎng)過程中應(yīng)謹(jǐn)慎控制NAA濃度。適宜沙子空心李組培苗生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L,平均生根數(shù)達(dá)6.38條,平均根長為9.35 cm,組培苗葉片寬大呈翠綠色,長勢極好,主根粗壯,須根極多,有利于后續(xù)的煉苗移栽。

在植物組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生體細(xì)胞無性系變異(變異率可達(dá)30%～40%),這不利于保持無性系繁殖后代的優(yōu)良種性[22-23],因此組培增殖苗投入生產(chǎn)前需要進(jìn)行遺傳變異檢測,以確保優(yōu)良種性未變異。ISSR和SSR分子標(biāo)記在植物基因組中具有豐富、穩(wěn)定的多態(tài)性,常用來進(jìn)行遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析和遺傳變異檢測[24-26]。本研究采用ISSR及SSR兩種分子標(biāo)記方法,對沙子空心李組培增殖苗進(jìn)行遺傳變異檢測,通過21條ISSR引物和22對SSR引物的擴(kuò)增檢測,發(fā)現(xiàn)繼代5代內(nèi)所有組培增殖苗DNA片段無論從帶型大小及譜帶的強(qiáng)弱、數(shù)目均一致。表明沙子空心李繼代5次的組培增殖苗遺傳物質(zhì)穩(wěn)定,能保持其優(yōu)良母株的遺傳特性。

本研究建立的沙子空心李離體快繁體系可有效地縮短繁殖周期,穩(wěn)定地遺傳優(yōu)良性狀,為開展沙子空心李工廠化育苗提供了技術(shù)支撐。