銀川與恩施地區(qū)青年人腸道乳酸菌的鑒定及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

董蘊,王玉榮,郭壯,劇檸

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 2(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽,441053) 3(湖北文理學(xué)院,乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽,441053)

腸道菌群對人體新陳代謝和身體健康有著深遠(yuǎn)的影響,它能夠幫助人體從碳水化合物中提取能量并產(chǎn)生維生素[1],在維持機體免疫力[2]和抑制微生物病原體[3]等方面有重要作用,且影響著人體內(nèi)分泌系統(tǒng)和精神情感[4]。乳酸菌作為人體腸道中重要的益生菌,能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群的生長、抑制破壞性細(xì)胞、增強人體免疫力、保護腸黏膜屏障和降低腸道pH值[5-6]。同時乳酸菌是制備發(fā)酵乳的主要發(fā)酵劑,在原料奶的酸化和發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,是影響發(fā)酵乳品質(zhì)的主要因素之一[7]。不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳擁有不同的風(fēng)味和滋味,其主要通過生產(chǎn)有機酸(乳酸等)使原料快速酸化,同時產(chǎn)生乙酸、乙醇、芳香化合物和胞外多糖等副產(chǎn)品,有效延長產(chǎn)品保質(zhì)期、改善質(zhì)地,并有助于產(chǎn)品產(chǎn)生愉悅的感官特征[8]。有研究發(fā)現(xiàn)分離自嬰兒腸道中的鼠李糖乳桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)可作為益生菌幫助兒童預(yù)防腹瀉和食物過敏[9-10],其中干酪乳桿菌鼠李糖亞種GG(Lacticaseibacilluscaseisubsp.rhamnosusGG)[11]和L.rhamnosusMP108[12]作為配料應(yīng)用于嬰兒配方奶粉和發(fā)酵乳中,因此從腸道中分離乳酸菌并將其應(yīng)用于乳品發(fā)酵具有極強的可行性。

銀川市是寧夏回族自治區(qū)首府,位于我國西北地區(qū),恩施市是恩施土家族自治州首府,位于我國南部,兩地氣候差異大,且人口復(fù)雜。本研究對湖北恩施和寧夏銀川地區(qū)的青年人腸道乳酸菌進行了分離鑒定,利用分離出的乳酸菌制備發(fā)酵乳,并基于電子鼻和電子舌對發(fā)酵乳品質(zhì)進行了評價,以期篩選出發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便樣本,恩施和銀川地區(qū)青年人腸道;脫脂乳粉和蔗糖,市售;DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒,德國QIAGEN公司;脫氧核糖核苷三磷酸、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液和DNA聚合酶(5 U/μL),北京全式金生物技術(shù)有限公司;Axygen清潔試劑盒,康寧生命科學(xué)吳江有限公司;MRS培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖(生化試劑)、氯化鈉(分析純),上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;pMD18-T克隆載體,寶生物工程(大連)有限公司;引物M13F(-47)、M13R(-48)、27F與1495R,金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetiri梯度基因擴增儀,美國AB公司;Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),美國Protein Simple公司;CT15E臺式高速離心機、CR21 N型高速離心機,日本HITACHI公司;DG250厭氧工作站:英國DWS公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;YXQ-L31-400立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PEN3電子鼻,德國Airsense公司;SA-402B電子舌,日本Insent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 志愿者招募與樣品采集

銀川市是寧夏回族自治區(qū)首府,位于我國西北地區(qū),屬中溫帶大陸性氣候[13],本地人口主要包括漢族、回族、滿族和蒙古族等,飲食以面食、肉類和油炸食品為主[14];恩施市是湖北省恩施土家族苗族自治州首府駐地,位于我國華中地區(qū),屬亞熱帶季風(fēng)性山地濕潤氣候,土壤中富含硒元素,本地人口主要包括漢族和土家族等,具有食用腌制食品和泡菜等發(fā)酵食品的習(xí)慣[15]。本研究從寧夏回族自治區(qū)銀川市志愿者14名(YC1～YC14),年齡在17～22歲,招募湖北省恩施土家族苗族自治州招募青年人志愿者13名(ES1～ES13),BMI值為20～25,兩周內(nèi)未服用藥物。將樣品用無菌勺采集于無菌離心管后,快速置于裝有冰袋的采樣箱中運回實驗室進行處理。

1.3.2 青年人腸道乳酸菌的分離鑒定與篩選

乳酸菌分離與鑒定:將糞便樣品10倍梯度稀釋后,取10-5和10-6梯度的稀釋液涂布于含有CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基中,于厭氧工作站(85% N2,5% CO2及10% H2)37 ℃培養(yǎng)2 d后,選取有透明圈且菌落形態(tài)不同的單個菌落在MRS固體培養(yǎng)基中純化3代。將純化完成的菌落進行過氧化氫酶試驗及細(xì)胞形態(tài)觀測,將過氧化氫酶試驗陰性及革蘭氏染色陽性的菌株定為疑似乳酸菌,并用30%的甘油凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。將待定乳酸菌按照CTAB法提取基因組DNA[16]后進行PCR擴增,擴增體系和條件按照李娜等[17]的方法。使用Axygen PCR清潔試劑盒清潔PCR產(chǎn)物后克隆,挑選陽性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司測序。測序所得序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NationaL CENTER OF BIOTECHNOLOGY INFORMAtion.NCBI)數(shù)據(jù)庫進行比對。

菌株篩選:根據(jù)《可用于食品的菌種名單》選取分離的乳酸菌進行發(fā)酵乳制備[18]。

1.3.3 發(fā)酵乳的制備

將水(82.0%,體積分?jǐn)?shù))、脫脂乳粉(115 g/L)和蔗糖(65 g/L)按比例混合后60 ℃水合30 min,然后在95 ℃條件下水浴保溫殺菌5 min,使用冰水將其降至常溫后按照5×106CFU/mL的比例接入菌體,37 ℃發(fā)酵24 h后迅速冷卻至4 ℃,在4 ℃培養(yǎng)箱中后熟24 h。

1.3.4 發(fā)酵乳品質(zhì)檢測

取15.0 g發(fā)酵乳樣品置于頂空瓶中,參照CAI等[19]的方法使用電子鼻對發(fā)酵乳的風(fēng)味品質(zhì)進行分析。

在30.0 g發(fā)酵乳樣品中加入90 mL的去離子水10 000 r/min離心5 min后,取上清液抽濾后備用,參照ZHAO等[20]的方法使用電子舌對發(fā)酵乳滋味品質(zhì)進行分析。

1.4 多元統(tǒng)計學(xué)分析

利用主成分分析(principal component analysis, PCA)發(fā)酵乳樣品的品質(zhì)進行分析;使用GraphPad Prism 9.0繪制小提琴圖;使用SAS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,使用Origin 2021軟件繪制散點圖,使用EXCEL繪制餅圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)青年人腸道乳酸菌的分離鑒定

乳酸菌作為人體腸道中重要的益生菌,不僅廣泛存在于人體腸道中,還能夠調(diào)節(jié)人體腸道菌群的平衡。本研究對兩地區(qū)青年人腸道中的乳酸菌進行了分析,其中銀川地區(qū)青年人腸道分離株分析結(jié)果見圖1。

圖1 銀川地區(qū)青年人腸道乳酸菌分析Fig.1 Analysis of intestinal lactic acid bacteria in young people in Yinchuan area

由圖1可知,從銀川地區(qū)青年人腸道中分離出83株疑似乳酸菌,經(jīng)16S rRNA序列分析被鑒定為9個屬的22個種,其中隸屬于腸球菌屬(Enterococcus,32.52%)的4個種,分別為屎腸球菌(Enterococcusfaecium,27.71%)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans,2.41%)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,1.20%)和泰國腸球菌(Enterococcusthailandicus,1.20%);其次為隸屬于鏈球菌屬(Streptococcus,30.11%)的4個種,分別為黃體鏈球菌(Streptococcuslutetiensis,24.10%)、馬其頓鏈球菌(Streptococcusmacedonicus,3.61%)、馬鏈球菌(Streptococcusequinus,1.20%)和巴氏鏈球菌(Streptococcuspasteurianus,1.20%);隸屬于魏斯氏菌屬(Weissella,10.84%)的2個種分別為融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa,9.64%)和食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria,1.20%);隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus,6.02%)的菌株可分為3個種,包括淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus,2.41%)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii,2.41%)和卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus,1.20%);隸屬于黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus,4.81%)的3個種分別為發(fā)酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum,2.41%)、黏膜黏液乳桿菌(Limosilactobacillusmucosae,1.20%)和口黏液乳桿菌(Limosilactobacillusoris,1.20%);隸屬于聯(lián)合乳桿菌屬(Ligilactobacillus,6.02%)的2個種分別為瘤胃聯(lián)合乳桿菌(Ligilactobacillusruminis,4.82%)和唾液聯(lián)合乳桿菌(Ligilactobacillussalivarius,1.20%);隸屬于片球菌屬(Pediococcus)酸性乳片球菌(Pediococcusacidilactici,4.55%);隸屬于乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus,2.40%)的2個種分別為植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum,1.20%)和植物乳植物桿菌植物亞種(Lactiplantibacillusplantarumsubsp.plantarum,1.20%);隸屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的乳明串珠菌(Leuconostoclactis,1.20%)。

恩施地區(qū)青年人腸道乳酸菌分析結(jié)果見圖2。

圖2 恩施地區(qū)青年人腸道乳酸菌分析Fig.2 Analysis of intestinal lactic acid bacteria in young people in Enshi area

由圖2可知,從恩施地區(qū)青年人腸道中分離出88株乳酸菌,經(jīng)16S rRNA序列分析被鑒定為9個屬的20個種,其中隸屬于Streptococcus的3個種相對含量為30.68%,分別為黃體鏈球菌(Streptococcuslutetiensis,26.14%),馬其頓鏈球菌(Streptococcusmacedonicus,2.27%)和巴氏鏈球菌(Streptococcuspasteurianus,2.27%);隸屬于Weissella的2個種相對含量為23.86%,分別為Weissellaconfusa(21.59%)和Weissellacibaria(2.27%);隸屬于Enterococcus的3個種相對含量為15.92%,分別為Enterococcusfaecium(13.64%)、鳥腸球菌(Enterococcusavium,1.14%)和乳酸腸球菌(Enterococcuslactis,1.14%);隸屬于黏液乳桿菌屬(Limosilactobacillus,7.95%)的2個種分別為L.fermentum(5.68%)和羅伊氏黏液乳桿菌(Limosilactobacillusreuteri,2.27%);隸屬于Lactobacillus的3個種相對含量為5.69%,分別為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii,3.41%)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,1.14%)和L.johnsonii(1.14%);隸屬于Pediococcus的2個種相對含量為5.69%,分別為Pediococcusacidilactici(4.55%)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus,1.14%);隸屬于乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus,4.55%)的2個種分別為L.plantarumsubsp.plantarum(3.41%)和L.plantarum(1.14%);隸屬于聯(lián)合乳桿菌屬(Ligilactobacillus,3.41%)的2個種分別為L.ruminis(2.27%)和敏捷聯(lián)合乳桿菌(Ligilactobacillusagilis,1.14%);隸屬于乳球菌屬(Lactococcus)的1個種為格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae,2.27%)。

對兩地區(qū)青年人腸道乳酸菌分析可以發(fā)現(xiàn),從銀川地區(qū)青年人腸道中分離的乳酸菌多樣性較高于恩施地區(qū),且兩地區(qū)青年人腸道中分離出的乳酸菌種類略有差異。從銀川地區(qū)青年人腸道中分離出5種在恩施地區(qū)青年人腸道中未分離出的乳酸菌,分別為L.amylovorus、L.crispatus、L.mucosae、L.oris和L.salivarius;同時恩施青年人腸道中也分離出4種在銀川青年人腸道中未分離出的乳酸菌,分別為L.delbrueckii、L.reuteri、L.acidophilus和L.agilis,造成這種差異的原因可能與兩地區(qū)飲食文化和風(fēng)俗習(xí)慣的不同有關(guān)[21]。乳酸桿菌屬作為人體腸道中重要的益生菌,能夠分解代謝腸道內(nèi)益生元,抑制有害菌的生長[22]。研究發(fā)現(xiàn),L.plantarum和L.acidophilus能夠?qū)⒂坞x亞油酸轉(zhuǎn)化為有抗糖尿病、抗炎和抗癌特性的共軛亞油酸[23-24];L.delbrueckii作為天然益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群的功能,其常存在于一些發(fā)酵食品中[25];L.fermentum能產(chǎn)生多種有效的抗菌肽,可用作食品防腐劑或抗生素的替代品,且其能夠降低血膽固醇水平,可以作為降膽固醇劑[26];FRANCAVILLA等[27]研究發(fā)現(xiàn)L.reuteri能夠?qū)τ拈T桿菌的生長產(chǎn)生抑制作用,且能明顯降低抗生素帶來的副作用并提高根除率。

2.2 乳酸桿菌制備發(fā)酵乳品質(zhì)的評價

本研究進一步依據(jù)《可用于食品的菌種名單》選取23株乳酸菌進行發(fā)酵乳制備并對其品質(zhì)進行評價,以確定這些乳酸菌制備的發(fā)酵乳特性。選取菌株分別為7株L.fermentum(YC3-5、YC9-1、ES1-1、ES5-8、ES1-7、ES1-9和ES4-12),4株L.plantarumsubsp.plantarum(YC2-5、ES1-6、ES1-8和ES9-5),3株L.johnsonii(YC7-6、YC8-7和ES4-10)和3株L.delbrueckii(ES5-5、ES8-7和ES8-8),2株L.plantarum(YC8-8和ES5-1)和2株L.reuteri(ES4-9和ES4-11)以及L.salivarius(YC4-1)和L.acidophilus(ES3-4)各1株。選取的23株乳酸菌中有7 株分離自銀川青年人腸道,編號分別為YC2-5、YC3-5、YC4-1、YC7-6、YC8-7、YC8-8和YC9-1,其余16株分離自恩施青年人腸道。發(fā)酵乳風(fēng)味品質(zhì)特征分析結(jié)果見表1。

表1 電子鼻各傳感器對發(fā)酵乳的響應(yīng)值Table 1 Response values of electronic nose sensors to fermented milk

由表1可知,電子鼻傳感器W2W的變異系數(shù)最小,而傳感器W1C、W5S、W3C、W5C、W1S、W1W和W2S的變異系數(shù)均大于10%,因此乳酸菌制備的發(fā)酵乳風(fēng)味在有機硫化物的差異最小,而在香型化合物、氮氧化合物、甲烷、萜烯類和乙醇的差異大。由此可知,不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳風(fēng)味品質(zhì)存在較大的差異。發(fā)酵乳的風(fēng)味品質(zhì)是影響消費者感官體驗的一項重要因素,除此之外,發(fā)酵乳的滋味品質(zhì)也極大的影響著消費者的感官體驗[28]。本研究通過電子舌對發(fā)酵乳的各滋味指標(biāo)進行了測定,其相對強度值如圖3所示。

圖3 基于乳酸菌制備發(fā)酵乳滋味品質(zhì)分析Fig.3 Analysis of taste and quality of fermented milk prepared by lactic acid bacteria

由圖3可知,不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳中后味-A(澀味的回味)的極差值小于1,而酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味-B(苦味的回味)和豐度(鮮味的回味)的極差值大于1。說明不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳間后味-A差異較小,感官差異不明顯;而在酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味-B和豐度間的差異較大,且滋味指標(biāo)酸味、澀味和鮮味的極差值最大,分別為21.25、11.17和17.32。由此可知,不同乳酸菌制備的發(fā)酵乳滋味品質(zhì)各異,且乳酸菌對發(fā)酵乳滋味品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在酸味、澀味和鮮味方面。

本研究進一步使用PCA對發(fā)酵乳的品質(zhì)進行了評價。經(jīng)PCA發(fā)現(xiàn),不同乳酸菌制備發(fā)酵乳品質(zhì)的信息主要集中在前4個主成分,累計方差貢獻率為87.02%,其中前2個主成分的貢獻率分別為41.22%和28.12%,可視化分析結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 基于發(fā)酵乳品質(zhì)主成分分析的因子載荷圖Fig.4 Factor load diagram based on principal component analysis of fermented milk quality

圖5 基于發(fā)酵乳品質(zhì)主成分分析的因子得分圖Fig.5 Factor score chart based on principal component analysis of fermented milk quality

由圖4可知,第一主成分由W1S、W2S、W3S、W5S、W6S、W1W、W2W和W3C 8個風(fēng)味傳感器指標(biāo)構(gòu)成,第二主成分由W1C、酸味、苦味、澀味、咸味和豐度6個指標(biāo)構(gòu)成。其中酸味、W3C、W1W、W2W、W3S和W2S位于第一象限,咸味、澀味和苦味位于第二象限,傳感器W1S、W5S和W6S位于第三象限,傳感器W1C和豐度位于第四象限。

由圖5可知,有3株乳酸菌ES3-4、ES8-7和ES8-8制備的發(fā)酵乳樣品分布在第一象限,3株乳酸菌ES1-8、ES4-11和ES9-5制備的發(fā)酵乳分布在第二象限,9株乳酸菌YC7-6、YC8-7、YC8-8、ES1-6、ES1-7、ES1-9、ES4-9、ES4-10和ES4-12制備的發(fā)酵乳分布在第三象限,8株乳酸菌YC2-5、YC3-5、YC4-1、YC9-1、ES1-1、ES5-1、ES5-5和ES5-8制備的發(fā)酵乳位于第四象限。據(jù)PCA發(fā)現(xiàn),菌株ES3-4(L.acidophilus)制備的發(fā)酵乳有明顯的酸味,而ES1-1(L.fermentum)制備的發(fā)酵乳芳香風(fēng)味更明顯。由此可知,乳酸菌LactobacillusacidophilusES3-4可增加發(fā)酵乳的酸味,而乳酸菌L.fermentumES1-1可增加發(fā)酵乳的香氣。嗜酸乳桿菌作為第三代乳酸菌發(fā)酵劑具有良好的耐酸膽汁鹽的耐受性[29],其不僅廣泛應(yīng)用于乳制品等的生產(chǎn),還可增機體強免疫力,平衡腸道菌群[30]。任然等[31]使用4株益生菌,即雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌結(jié)合基礎(chǔ)發(fā)酵劑發(fā)酵了酸奶并對其品質(zhì)進行了分析,結(jié)果顯示嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力是最強的,本研究從青年人腸道中分離的嗜酸乳桿菌也可增加發(fā)酵乳的酸味。發(fā)酵乳桿菌具有調(diào)節(jié)機體免疫的功能、緩解胃腸道疾病的作用和對致病菌的拮抗作用[32]。LIM等[33]研究發(fā)現(xiàn)從人腸道中分離出的L.fermentumIM12能夠通過抑制NF-κb-STAT3信號通路來減輕炎癥。ALE等[34]研究顯示,L.fermentumLF2制備的發(fā)酵乳可以改變發(fā)酵乳的流變特性,同時可保護小鼠免受沙門氏菌感染。分離自嬰兒腸道中的菌株L.acidophilusLb和L.rhamnosusGG可用于牛奶、發(fā)酵乳和嬰兒配方奶粉的膳食補充劑,幫助預(yù)防兒童腹瀉;分離自人體糞便中的菌株L.caseisubsp.Shirota制備的發(fā)酵乳飲料對人體腸道具有一定的調(diào)理作用[35]。由此表明本研究中來源于青年人腸道的L.fermentum和L.acidophilus可以篩選作為發(fā)酵優(yōu)良的乳酸菌進行后續(xù)發(fā)酵乳產(chǎn)品的開發(fā)。

3 結(jié)論

本研究從銀川地區(qū)青年人腸道中分離出83株乳酸菌,被鑒定為9個屬的22個種,其中9個屬分別為Lactobacillus、Limosilactobacillus、Ligilactobacillus、Lactiplantibacillus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc、Weissella和Pediococcus;恩施地區(qū)青年人腸道中分離出88株乳酸菌,被鑒定為9個屬的20個種,其中9個屬分別為Lactobacillus、Limosilactobacillus、Ligilactobacillus、Lactiplantibacillus、Streptococcus、Enterococcus、Weissella、Pediococcus和Lactococcus。依據(jù)《可用于食品的菌種名單》選取23株乳酸菌制備的發(fā)酵乳,其中7株分離自銀川青年人腸道,16株分離自恩施青年人腸道,其制備的發(fā)酵乳感官品質(zhì)差異明顯,其中分離自恩施青年人腸道的L.acidophilusES3-4制備的發(fā)酵乳酸味強于其他菌株,分離自恩施青年人腸道的L.fermentumES1-1制備的發(fā)酵乳芳香物質(zhì)較高,香味更突出。