普魯蘭多糖/殼聚糖/黃原膠/膠原蛋白復(fù)合膜的制備及保鮮效果研究

鄭穩(wěn),莊文靜,宮萱,黃可承,趙璐,李雪艷,成謙益,包建強(qiáng),2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海,201306)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)隸屬鱸亞目(Percoidei)棘臀魚科(Centrarchidae)黑鱸屬(Micropterus),20世紀(jì)80年代引入我國(guó),經(jīng)過多年的養(yǎng)殖發(fā)展,已成為國(guó)內(nèi)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[1]。大口黑鱸具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、易起捕、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn),加之肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩,無肌間剌,外形美觀,深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者歡迎[2]。然而宰殺后的大口黑鱸由于其特殊的營(yíng)養(yǎng)成分及特征極易發(fā)生腐敗變質(zhì),因此,常采用涂膜、保鮮劑或氣調(diào)包裝結(jié)合冷藏、微凍或凍藏來延緩其腐敗變質(zhì)的進(jìn)程[3]。

普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖,又名普聚多糖[4-5]。因其具有高水溶性、可降解性、成膜性和阻氧性良好等優(yōu)點(diǎn),近年來其涂膜已廣泛應(yīng)用于食品保鮮[6-8]。胡云峰等[9]探究了普魯蘭多糖水溶液對(duì)雞蛋的保鮮效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)普魯蘭多糖涂膜液可將蛋殼的氣孔覆蓋,阻止外界微生物侵入和雞蛋內(nèi)容物流失,極大延長(zhǎng)了雞蛋的貨架期。羧甲基殼聚糖是殼聚糖的一種衍生物,因?yàn)橛辛己玫乃苄浴⒈裥?、成膜?安全無毒并具有抑菌、抗病毒、抗凝血等多種作用,在醫(yī)藥、化工、環(huán)保、保健品等方面應(yīng)用十分廣泛[10]。為了增強(qiáng)羧甲基殼聚糖保鮮膜的性能和保鮮效果,目前關(guān)于羧甲基殼聚糖與其他成分復(fù)合制備保鮮膜已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。陳露珠等[11]在羧甲基殼聚糖膜液中加入普魯蘭多糖,所制成的羧甲基殼聚糖-普魯蘭多糖復(fù)合膜的理化性能和抗菌效果均得到提升,羅氏沼蝦的劣變受到抑制,貨架期延長(zhǎng)近2倍。黃原膠又稱漢生膠,是由糖類經(jīng)黃單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外微生物多糖,具有多種功能,可作為膜成型劑、凝膠增稠劑、穩(wěn)定劑等,廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域[12]。樊彥玲[13]采用黃原膠/果膠/海藻酸鈉復(fù)合涂膜保鮮馬鈴薯,發(fā)現(xiàn)黃原膠復(fù)合膜能有效降低馬鈴薯的失重率及褐變度,保持鮮切馬鈴薯的感官品質(zhì)和總酚含量。膠原蛋白作為天然的生物高分子,具有良好的生物相容性、可降解性、成膜性和抗菌等特點(diǎn),適合作為“綠色”食品包裝膜在食品工業(yè)中發(fā)揮作用[14-15]。因此將普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠與膠原蛋白進(jìn)行復(fù)配,可制備出一種可食用、環(huán)保、性能優(yōu)良的多糖復(fù)合保鮮膜。

近年來,普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠與魚皮膠原蛋白作為一種天然的保鮮劑已被廣泛研究,但是制成復(fù)合涂膜劑協(xié)同用于大口黑鱸的保鮮較為鮮見。本實(shí)驗(yàn)將普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠添加至膠原蛋白中,研究成膜劑質(zhì)量濃度、成膜劑質(zhì)量比及超聲時(shí)間對(duì)復(fù)合膜理化性能的影響,并用制備的復(fù)合膜液對(duì)大口黑鱸進(jìn)行涂膜保鮮,在-2 ℃條件下貯藏,對(duì)大口黑鱸進(jìn)行pH、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)、菌落總數(shù)(total viable count,TVC)、持水力(water holding capacity,WHC)、肌動(dòng)球蛋白含量、巰基(—SH)含量和Ca2+-ATP酶活性的測(cè)定,以研究復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸的保鮮效果。本文可為普魯蘭多糖/羧甲基殼聚糖/黃原膠/膠原蛋白復(fù)合膜的進(jìn)一步研究及其在食品中的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

活體大口黑鱸魚購(gòu)于上海市南匯新城鎮(zhèn)小馬海鮮批發(fā)店,每條質(zhì)量約0.7 kg、體長(zhǎng)約26 cm。

普魯蘭多糖,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;黃原膠,上海麥克林生化科技股份有限公司;羧甲基殼聚糖,上海吉至生化科技有限公司;魚皮膠原蛋白,上海源葉生物科技有限公司;氯化鈉,上海艾希爾化工有限公司;氧化鎂(輕質(zhì)),上海啟仁化工有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA),廣州天駿生物科技有限公司;總蛋白定量測(cè)定試劑盒(BCA法),南京建成正浩科技有限公司;總巰基測(cè)定試劑盒,北京峰格生物技術(shù)有限公司;超微量Ca2+-ATP酶試劑盒,柏吉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì),奧豪斯儀器(上海) 有限公司;BS-210型電子天平,德國(guó)Sartorius Instruments有限公司;Kjeltec8400全自動(dòng)凱氏定氮儀,丹麥 FOSS 公司;SPARK型酶標(biāo)儀,瑞士TECAN儀器公司;H-1850離心機(jī),湖南湘怡實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;SZ-130010型磁力攪拌器,上海禾汽玻璃儀器有限公司;SP-723可見光分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;TESA外徑千分尺,上海捷滬儀器儀表有限公司;HD-B617-S型電子拉力試驗(yàn)機(jī),海達(dá)儀器檢測(cè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 普魯蘭多糖復(fù)合膜的制備與條件優(yōu)化

將成膜劑普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖與黃原膠按不同比例混合,加入100 mL去離子水。在45 ℃水浴磁力攪拌器中攪拌均勻,將攪拌均勻的膜液添加到3 g/100 mL的魚皮膠原蛋白溶液中繼續(xù)攪拌,均勻后加入溶液總體積比2%的甘油,繼續(xù)攪拌并將膜液在超聲儀中240 W處理不同時(shí)間。最后,取膜液20 mL倒于水平放置的培養(yǎng)皿(直徑為100 mm),自然干燥后揭膜備用,即制得測(cè)定用普魯蘭多糖復(fù)合膜[15]。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)成膜劑(普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠)質(zhì)量比2∶1∶1(CPX1)、2∶1∶2(CPX2)、2∶2∶1(CPX3)、2∶2∶2(CPX4),成膜劑質(zhì)量濃度1 g/100 mL(CPX5)、1.2 g/100 mL(CPX6)、1.4 g/100 mL(CPX7)、1.6 g/100 mL(CPX8)和超聲時(shí)間5 min(CPX9)、10 min(CPX10)、15 min(CPX11)、20 min(CPX12)進(jìn)行優(yōu)化,考察以上因素對(duì)復(fù)合膜性能的影響。

1.2.2 復(fù)合膜性能的測(cè)定

1.2.2.1 抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的測(cè)定

參考曹立妤等[16]的方法稍加改動(dòng),將復(fù)合膜裁剪為20 mm×60 mm的矩形條狀,在相對(duì)濕度40%,溫度25 ℃的干燥器中平衡24 h備用。

測(cè)試條件:測(cè)試環(huán)境溫度25 ℃,相對(duì)濕度56%,設(shè)置初始上下夾片距離為40 mm,拉伸速率40 mm/min。記錄薄膜的拉伸強(qiáng)度(MPa)和斷裂伸長(zhǎng)率(%),每個(gè)樣品平行測(cè)定5次,取其平均值。

1.2.2.2 溶脹率的測(cè)定

溶脹率的測(cè)定參考PEI等[17]所述的方法,并略作修改。將普魯蘭多糖復(fù)合膜裁剪為20 mm×20 mm大小并稱其干重Wa后浸入30 ℃、25 mL蒸餾水中,2 h后取出用濾紙吸干復(fù)合膜的水,直到達(dá)到平衡之前,測(cè)量溶脹后膜的質(zhì)量Wb。根據(jù)公式(1)計(jì)算其溶脹率:

(1)

式中:Wb為溶脹后復(fù)合膜的質(zhì)量,g;Wa為干燥復(fù)合膜的質(zhì)量,g。每組膜測(cè)量重復(fù)3次。

1.2.2.3 復(fù)合膜厚度的測(cè)定

膜厚度采用千分尺測(cè)定,在被測(cè)膜上隨機(jī)抽取3點(diǎn)測(cè)量取平均值。

1.2.2.4 復(fù)合膜透光率的測(cè)定

參考鄒麗娜等[18]的方法并稍加改動(dòng),將復(fù)合膜裁剪為10 mm×40 mm大小,緊貼在比色皿的內(nèi)側(cè)。以空皿作為空白對(duì)照,在600 nm處測(cè)定其透光率。

1.2.2.5 復(fù)合膜水蒸氣透過率的測(cè)定

參考吳秀華等[19]的方法略加改動(dòng)。取20 mL蒸餾水倒入50 mL燒杯中,用膜包裹住杯口并用橡皮筋進(jìn)行固定,在25 ℃條件下,放入干燥器中。每隔3 h稱量1次,稱取5次,每組膜取2個(gè)平行樣品,按照公式(2)計(jì)算復(fù)合膜水蒸氣透過系數(shù)。

(2)

式中:x為膜厚,mm;S為有效面積,S=16.61×10-4m2;Δm為水分透過的質(zhì)量,g;t為間隔時(shí)間,s;ΔP為膜兩邊的壓強(qiáng)差,ΔP=3.17 MPa(25 ℃)。

1.2.3 最優(yōu)工藝條件下復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸魚保鮮效果的影響

1.2.3.1 原料的處理及貯藏

活體大口黑鱸魚洗凈宰殺,去皮、去頭尾、去內(nèi)臟,取背部肌肉切成約3 cm×3 cm×1 cm的均一魚片,擦干表面水分后,分裝于保鮮袋中,每袋分裝300 g左右。將分裝好的魚肉分為2組,一組為實(shí)驗(yàn)組(CPX-G組),在膜液中浸漬15 min;另一組為未涂膜的對(duì)照組(CK組)。將處理后的兩組魚肉在-2 ℃的冰箱中貯藏10 d,每隔2 d測(cè)1次各組魚肉的物化指標(biāo)。

1.2.3.2 TVB-N值的測(cè)定

依照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》,測(cè)定大口黑鱸魚肉的TVB-N值。

1.2.3.3K值的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10 g剁碎的魚肉加入10%的高氯酸20 mL,在4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,再加入5%的高氯酸20 mL,在4 ℃下12 000 r/min離心5 min重復(fù)3次,最后合并上清液,將pH值調(diào)至6.5,后定容于50 mL容量瓶,最后用0.22 μm微孔濾膜過濾待用。

HPLC條件:C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),采用pH值為6.7的0.05 mol/L磷酸緩沖液洗脫,樣品進(jìn)樣量為10 μL,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。按公式(3)計(jì)算K值:

(3)

式中:A為次黃嘌呤核苷含量;B為次黃嘌呤含量;C為三磷酸腺苷含量;P為二磷酸腺苷含量;M為腺苷酸含量;N為肌苷酸含量。

1.2.3.4 pH值的測(cè)定

稱取20 g絞碎的鱸魚肌肉,加入200 mL去離子水,均質(zhì)2 min浸提2 h后過濾,取上清液測(cè)定pH值,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3.5 TVC的測(cè)定

依照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》,測(cè)定大口黑鱸魚肉的TVC。

1.2.3.6 肌動(dòng)球蛋白的測(cè)定

參考ZHOU等[20]的方法提取肌動(dòng)球蛋白并稍加修改。

提取方法:準(zhǔn)確稱取10 g大口黑鱸魚肉于燒杯中,絞碎后加入50 mL預(yù)冷的KCl溶液(0.6 mol/L,pH 7.0),在冰浴條件下均質(zhì)5 min,為防止溶液過熱,每均質(zhì)20 s停10 s。均質(zhì)結(jié)束后,15 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,收集上清液。向上清液加入3倍體積預(yù)冷的蒸餾水,15 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,收集沉淀后加入等體積的預(yù)冷KCl溶液(1.2 mol/L,pH 7.0),冰浴條件下攪拌20 min,再次離心收集上清液,上清液即為肌動(dòng)球蛋白。

測(cè)定方法:參照南京建成蛋白定量測(cè)試盒(BCA法)說明書,在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定OD值。

1.2.3.7 總巰基的測(cè)定

以肌動(dòng)球蛋白為待測(cè)樣,參照北京峰格總巰基測(cè)定試劑盒說明書的方法進(jìn)行測(cè)定,在412 nm處測(cè)定OD值。

1.2.3.8 Ca2+-ATP酶活性的測(cè)定

以肌動(dòng)球蛋白為待測(cè)樣,參考柏吉生物超微量Ca2+-ATP酶試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定,在636 nm處測(cè)定OD值。

1.2.3.9 持水力的測(cè)定

參照劉欣榮等[21]的方法。精確稱取10 g左右魚肉(W1),擦干魚肉表面的水分后置于干燥離心管4 ℃、10 000 r/min離心10 min,再精確稱重(W2),按照公式(4)計(jì)算持水力。

(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和整理,采用Excel 2019進(jìn)行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成膜劑質(zhì)量比對(duì)復(fù)合膜性能的影響

研究成膜劑的質(zhì)量濃度1.4 g/100 mL、超聲時(shí)間15 min條件下,普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖與黃原膠質(zhì)量之比對(duì)復(fù)合膜性能的影響,結(jié)果如圖1所示。m(普魯蘭多糖)∶m(羧甲基殼聚糖)∶m(黃原膠)=2∶2∶1(CPX3組)時(shí)溶脹率最大,水蒸氣透過率最小。透光率是反映普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠與魚皮膠原蛋白相容性的指標(biāo),透光性越高則說明各組分相互協(xié)同的作用越好當(dāng),從圖1中可看出各組復(fù)合膜的透光率均>90%,隨著普魯蘭多糖添加量占比的增加,復(fù)合膜的透光率逐漸增大,即CPX1>CPX3>CPX2>CPX4,這可能是因?yàn)槠蒸斕m多糖呈白色,而羧甲基殼聚糖與黃原膠為淡黃色物質(zhì),因此普魯蘭多糖比例的增加會(huì)提高復(fù)合膜液的透明度?？估鞆?qiáng)度反映保鮮膜的力學(xué)強(qiáng)度,是表征復(fù)合膜機(jī)械性能的重要指標(biāo),當(dāng)普魯蘭多糖和黃原膠的質(zhì)量比一定時(shí)(CPX1與CPX3、CPX2與CPX4),復(fù)合膜的抗拉伸強(qiáng)度隨羧甲基殼聚糖添加量的增加而增加,且各組間存在顯著差異,即CPX3>CPX1;CPX4>CPX2。這可能是普魯蘭多糖中的羥基與羧甲基殼聚糖中的羧基之間所形成氫鍵作用所致,隨著復(fù)合膜中羧甲基殼聚糖比例的增加,羥基的數(shù)目也相應(yīng)增加,從而增強(qiáng)了多糖分子間的氫鍵作用,從而使復(fù)合膜具有較強(qiáng)的抗拉伸作用[22]。水蒸氣透過率的大小反映了復(fù)合膜透濕性的高低,透過率越小透濕性越低,即說明復(fù)合膜的隔水性越好,越有利于食品的保鮮[23]。當(dāng)普魯蘭多糖和羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比一定時(shí)(CPX3與CPX4),增大黃原膠的添加量,水蒸氣透過率隨之增加,即CPX4>CPX3,該結(jié)果可能與黃原膠具有良好的親水性有關(guān)。綜合考慮,制備普魯蘭多糖復(fù)合膜選擇的最佳成膜劑質(zhì)量比為m(普魯蘭多糖)∶m(羧甲基殼聚糖)∶m(黃原膠)=2∶2∶1(CPX3組)。

2.2 不同成膜劑質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

確定m(普魯蘭多糖)∶m(羧甲基殼聚糖)∶m(黃原膠)=2∶2∶1之后,研究了超聲15 min條件下,不同成膜劑質(zhì)量濃度對(duì)普魯蘭多糖復(fù)合膜性能的影響,結(jié)果如圖2所示。隨著質(zhì)量濃度的增加復(fù)合膜厚度和溶脹率逐漸增大,溶脹率增大是因?yàn)轸燃谆鶜ぞ厶?、膠原蛋白與黃原膠均為親水性的,具有較強(qiáng)的吸水能力。水蒸氣透過系數(shù)先減小后增大,且在質(zhì)量濃度為1.4 g/100 mL (CPX7)時(shí)最小,為7.07×10-12g/(m·s·Pa)?？赡苁钱?dāng)質(zhì)量濃度<1.4 g/100 mL時(shí),隨著質(zhì)量濃度的增加,單位體積內(nèi)成膜物質(zhì)的量增多,水分子及其他成膜基質(zhì)與呈現(xiàn)有序的螺旋結(jié)構(gòu)的黃原膠分子之間借助范德華力和氫鍵形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),因此水蒸氣透過率降低[24]。當(dāng)質(zhì)量濃度超過1.4 g/100 mL時(shí),膜液黏度變大,難以形成均一的復(fù)合膜,膜液內(nèi)向收縮,脫氣泡困難,造成復(fù)合膜性能下降,水蒸氣透過率增大。抗拉伸強(qiáng)度先增大后減小,膜液質(zhì)量濃度為1.4 g/100 mL(CPX7)時(shí)達(dá)到最大值15.78 MPa?？估鞆?qiáng)度降低的原因可能是高質(zhì)量濃度下成膜劑極易發(fā)生組分聚集,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,增加了膜結(jié)構(gòu)中的大孔比例,從而對(duì)復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度產(chǎn)生影響。綜合考量,制備普魯蘭多糖復(fù)合膜選擇的最佳成膜劑質(zhì)量濃度為1.4 g/100 mL(CPX7組)。

圖2 不同成膜劑質(zhì)量濃度對(duì)普魯蘭多糖復(fù)合膜性能的影響Fig.2 Effect of different mass concentrations of film formers on the performance of pullulan composite films

2.3 不同超聲時(shí)間對(duì)復(fù)合膜性能的影響

在成膜劑質(zhì)量比為m(普魯蘭多糖)∶m(羧甲基殼聚糖)∶m(黃原膠)=2∶2∶1,成膜劑質(zhì)量濃度為1.4 g/100 mL的條件下,研究不同超聲時(shí)間對(duì)復(fù)合膜性能的影響,結(jié)果如圖3所示。隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng),普魯蘭多糖復(fù)合膜的厚度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),這可能是因?yàn)檫^度超聲情況下,復(fù)合膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被打散,從而使普魯蘭多糖復(fù)合膜的性能變差。超聲15 min以內(nèi)時(shí),隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng),普魯蘭多糖復(fù)合膜的水蒸氣透過率先降低后微微升高,當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí),水蒸氣透過率最小,為7.11×10-12g/(m·s·Pa),繼續(xù)超聲至20 min時(shí),水蒸氣透過率略微增大。水蒸氣透過率先降低的原因是因?yàn)樵诔曌饔孟?水分子迅速均勻地滲透到了普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖、黃原膠和膠原蛋白締結(jié)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,加速形成了牢固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);水蒸氣透過率后微微升高是因?yàn)槌曌饔卯a(chǎn)生的空化效應(yīng)以及某些機(jī)械振動(dòng)對(duì)普魯蘭多糖的構(gòu)象產(chǎn)生了一定的影響,使得化學(xué)鍵遭到破壞,相互作用力減弱,所以水蒸氣透過系數(shù)增大[25]。普魯蘭多糖復(fù)合膜的抗拉伸強(qiáng)度呈先增大后減小的趨勢(shì),在超聲時(shí)間為15 min時(shí)達(dá)到最大值15.89 MPa,這是因?yàn)槌暜a(chǎn)生的空穴作用與振蕩作用大大增加了膜液不同分子之間的接觸次數(shù),促進(jìn)了分子間的相互作用,繼續(xù)超聲,則會(huì)導(dǎo)致膜液網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被打散,抗拉伸強(qiáng)度降低[26]。綜合考慮,制備普魯蘭多糖復(fù)合膜選擇的最佳超聲時(shí)間為15 min(CPX11組)。

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)普魯蘭多糖復(fù)合膜性能的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic times on the performance of pullulan composite films

2.4 普魯蘭多糖復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸保鮮效果的影響

2.4.1 TVB-N的變化

TVB-N值常用來判斷魚肉氨基酸被破環(huán)的程度,對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)估的主要參數(shù)之一。普魯蘭多糖復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸魚TVB-N值的影響見圖4。兩組魚肉的TVB-N值均呈上升趨勢(shì),0～2 d兩組魚肉的TVB-N值的變化幅度較小,這是因?yàn)樵谖鰟?chuàng)造的低溫條件下魚肉自身酶和腐敗微生物所分解的胞外酶的活性受到抑制,蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)的速率降低,因此TVB-N值上升速度較慢。2 d后CK組TVB-N值上升速度較快,貯藏至第10天由初始值(8.19±0.24) mg/100 g上升至(12.55±0.44) mg/100 g,達(dá)二級(jí)鮮度,而CPX-G組TVB-N僅上升至(11.35±0.17) mg/100 g,仍處于一級(jí)鮮度,且貯藏期內(nèi)CPX-G組TVB-N值始終低于CK組。CPX-G組上升速度較慢是因?yàn)閺?fù)合膜具有良好的包裹作用,可以有效隔絕外界的空氣和水,抑制魚肉內(nèi)微生物的生長(zhǎng)以及防止外界微生物的進(jìn)一步侵染[27],因此貯藏期內(nèi)經(jīng)涂膜處理的魚肉其TVB-N值優(yōu)于對(duì)照組。

圖4 大口黑鱸貯藏過程中TVB-N值的變化Fig.4 Changes in TVB-N values during storage of Micropterus salmoides

2.4.2K值的變化

K值可反映核苷酸的降解程度,是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度程度的常用指標(biāo),一般認(rèn)為K值≤20%時(shí)樣品非常新鮮,20%70%為不新鮮。由圖5可知,各組魚肉K值總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),這與TVB-N值的變化趨勢(shì)相似,但是K值作為水產(chǎn)品前期鮮度評(píng)價(jià)的指標(biāo),上升趨勢(shì)比TVB-N值更明顯,更能代表水產(chǎn)品貯藏前期的鮮度變化[28]。新鮮魚肉K值為3.11%,此后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加,CK組增長(zhǎng)速度較快,到第10天已增至20.11%,處于中度新鮮;CPX-G組增長(zhǎng)速度相對(duì)較慢,至貯藏期結(jié)束(10 d)仍為非常新鮮,可見,貯藏期內(nèi)CPX-G組的K值要優(yōu)于CK組。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)涂膜處理的魚肉K值更低,ZHU等[29]認(rèn)為這可能是由于羧甲基殼聚糖的強(qiáng)抑菌特性減緩了微生物生長(zhǎng)繁殖對(duì)ATP的分解作用,從而降低了K值。

圖5 大口黑鱸貯藏過程中K值的變化Fig.5 Changes in K value during storage of Micropterus salmoides

2.4.3 pH值的變化

pH值的變化情況可在一定程度上表征大口黑鱸的新鮮程度,是評(píng)價(jià)魚肉品質(zhì)的指標(biāo)之一。普魯蘭多糖復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸魚pH值的影響見圖6。2組魚肉pH值均呈先下降后上升的趨勢(shì),pH值下降可能與魚死后魚體內(nèi)的磷酸肌酸和ATP等物質(zhì)分解產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)有關(guān),pH值回升則可能與魚肉蛋白質(zhì)在微生物和酶的作用下不斷的分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)有關(guān)。CK組魚肉pH值在第4天降低到最小值6.58,而CPX-G組pH值在第7天降低到最小值6.24,且貯藏期內(nèi)CK組pH值始終高于CPX-G組,原因可能是膜液中的黃原膠與魚肉中的蛋白質(zhì)發(fā)生了共凝膠作用, 使蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)固, 減緩了蛋白質(zhì)的變性進(jìn)程,進(jìn)而使pH值變化緩慢[30];也有可能與普魯蘭多糖的抗氧化作用阻礙了魚肉中肌原纖維蛋白的氧化,抑制了游離氨基酸和多肽的生成有關(guān)[31]。

圖6 大口黑鱸貯藏過程中pH值的變化Fig.6 Changes in pH during storage of Micropterus salmoides

2.4.4 TVC的變化

普魯蘭多糖復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸魚TVC的影響如圖7所示。2組魚肉TVC均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),TVC降低的原因可能是微凍時(shí)魚肉溫度降低過快,魚體表面的嗜溫菌出現(xiàn)死亡。新鮮魚肉的TVC為3.11 lg CFU/g,處于一級(jí)鮮度。2 d后CK組TVC開始上升,到第10天已超過5.0 lg CFU/g,達(dá)到二級(jí)鮮度,而CPX-G組TVC從第6天開始上升,到第10天時(shí)TVC仍處于一級(jí)鮮度,并且貯藏期內(nèi)CPX-G組TVC始終低于CK組,這是因?yàn)榇罂诤邝|魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為巴氏葡萄球菌,屬革蘭氏陽性菌,細(xì)胞壁外的酸性環(huán)境與相對(duì)親水性的細(xì)胞表面,有利于羧甲基殼聚糖的滲入,在羧甲基殼聚糖的作用下,巴氏葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖受到極大抑制,所以CPX-G組的TVC值相較于CK組增加的更為緩慢[32-33]。由此可見,復(fù)合膜抑制TVC上升的效果明顯。

圖7 大口黑鱸貯藏過程中TVC的變化Fig.7 Changes in TVC during storage of Micropterus salmoides

2.4.5 肌動(dòng)球蛋白含量的變化

肌動(dòng)球蛋白是構(gòu)成肌原纖維蛋白的重要組成部分,在一定程度上可以表征魚肉蛋白質(zhì)的變性程度。大口黑鱸貯藏過程中肌動(dòng)球蛋白含量的變化情況如圖8所示。2組魚肉的肌動(dòng)球蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),上升的原因可能是肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白在ATP的作用下產(chǎn)生聚合,形成了大分子質(zhì)量的分子聚集沉淀起來,這與高萌等[34]的研究結(jié)果相似。貯藏期內(nèi),肌動(dòng)球蛋白含量總體呈下降趨勢(shì),到第10天,CK組魚肉由初始值33.1 mg/g下降至27.09 mg/g,下降了18.16%,而CPX-G組下降了12.05%,說明相較于CPX-G組,CK組魚肉肌動(dòng)球蛋白的變性更加嚴(yán)重,這是因?yàn)閺?fù)合膜使肌動(dòng)球蛋白的組織結(jié)構(gòu)更加緊密, 改善了肌動(dòng)球蛋白的性能, 防止肌動(dòng)球蛋白發(fā)生變性。

圖8 大口黑鱸貯藏過程中肌動(dòng)球蛋白含量的變化Fig.8 Changes in actin content in Micropterus salmoides during storage

2.4.6 巰基含量的變化

—SH是肌原纖維蛋白中最具活性的功能基團(tuán),可反映魚肉蛋白質(zhì)變性聚合的程度,其含量越高,說明魚肉蛋白質(zhì)變性聚合程度越低,品質(zhì)越好[35]。大口黑鱸貯藏過程中—SH含量的變化情況如圖9所示。2組魚肉的—SH含量均呈下降的趨勢(shì),這是因?yàn)轸~肉蛋白質(zhì)發(fā)生氧化時(shí), 蛋白內(nèi)部的巰基會(huì)因活性巰基的不穩(wěn)定性形成二硫鍵(—S—S—), 伴隨時(shí)間的延長(zhǎng),肌動(dòng)球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 巰基位置也隨之發(fā)生改變, 使巰基暴露于蛋白質(zhì)外部, 氧化形成了—S—S—,因而隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)兩組魚肉的—SH含量均逐漸降低[36],這也與于林[37]的研究結(jié)論相似。CK組—SH含量下降速度較快,至第10天已由初始值5.98×10-5mol/g降低至3.8×10-5mol/g,下降了36.45%,而CPX-G組僅下降了23.75%,這說明普魯蘭多糖復(fù)合膜能夠有效減緩—SH的氧化變性的趨勢(shì)。此外,貯藏期內(nèi)CPX-G組的—SH含量始終高于CK組,這是由于復(fù)合膜的包裹作用有效的阻礙了外界的氧氣,抑制了——SH的自動(dòng)氧化,降低了蛋白質(zhì)的變性程度,進(jìn)而影響了—SH含量的變化。結(jié)合圖7發(fā)現(xiàn),大口黑鱸魚—SH含量的變化趨勢(shì)與肌動(dòng)球蛋白相似,這可能與—SH氧化產(chǎn)生的—S—S—使肌動(dòng)球蛋白發(fā)生重鏈聚合,降低其鹽溶性有關(guān)[38]。相比于對(duì)照組,經(jīng)涂膜的大口黑鱸魚—SH含量的變化更慢,品質(zhì)更高。

圖9 大口黑鱸貯藏過程中巰基含量的變化Fig.9 Changes in sulfhydryl content during storage of Micropterus salmoides

2.4.7 Ca2+-ATP酶活性的變化

Ca2+-ATP酶活性是評(píng)估魚肉肌原纖維蛋白變性程度的指標(biāo),活性越低表明魚肉蛋白質(zhì)變性越嚴(yán)重,魚肉品質(zhì)越差。大口黑鱸貯藏過程中Ca2+-ATP酶活性的變化見圖10。新鮮魚肉的Ca2+-ATP酶活性為4.3 μmol Pi/(mg pro·h),隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)兩組魚肉的Ca2+-ATP酶活性均逐漸下降,這可能與巰基發(fā)生氧化和蛋白交聯(lián)有關(guān)[39]。其中,CK組下降速度較快,至貯藏結(jié)束Ca2+-ATP酶活性降低至2.8 μmol Pi/(mg pro·h),下降了34.88%,而CPX-G組下降了25.35%。CPX-G組下降幅度較小是因?yàn)閺?fù)合膜中的普魯蘭多糖與膠原蛋白具有抗氧化能力以及抑制微生物破壞蛋白的能力,從而抑制了蛋白質(zhì)的變性,減緩了Ca2+-ATP酶活性的下降趨勢(shì);也可能是由于普魯蘭多糖、羧甲基殼聚糖與黃原膠含有的羥基改變了蛋白質(zhì)分子內(nèi)自由水的結(jié)構(gòu),抑制了蛋白質(zhì)的聚集和變性的程度[40],進(jìn)而使CPX-G組Ca2+-ATP酶活性的下降速度降低。再結(jié)合圖8,發(fā)現(xiàn)Ca2+-ATP酶活性的下降趨勢(shì)與—SH相似,這是由于復(fù)合膜對(duì)魚肉的包裹作用,使得—SH的氧化程度降低,抑制了微生物破壞蛋白質(zhì)的能力,進(jìn)而降低了Ca2+-ATP酶活性下降的趨勢(shì)[35]。綜上可得,復(fù)合膜可有效延緩大口黑鱸魚Ca2+-ATP酶活性的下降,在保持魚肉品質(zhì)方面效果更佳。

圖10 大口黑鱸貯藏過程中Ca2+-ATP酶活性的變化Fig.10 Changes in Ca2+-ATPase activity during storage of Micropterus salmoides

2.4.8 WHC的變化

WHC能直接反映魚肉抑制水分流失的能力,是評(píng)價(jià)魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。大口黑鱸貯藏過程中持水力的變化見圖11。

圖11 大口黑鱸貯藏過程中持水力的變化Fig.11 Changes in water holding capacity during storage of Micropterus salmoides

2組魚肉的WHC均呈下降的趨勢(shì),下降的原因可能是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),大口黑鱸魚肌肉的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被冰晶破壞[35]。CK組魚肉WHC下降速度較快,貯藏至第10天由初始值85.55%下降至76.02%,下降了11.14%,而CPX-G組僅下降了7.81%,且在貯藏期內(nèi)CPX-G組WHC始終高于CK組。CK組WHC下降速度較CPX-G組更快是因?yàn)轸~肉肌原纖維蛋白在微凍過程中溶解性下降、疏水基團(tuán)暴露,造成蛋白與水分子之間的相互作用減弱,導(dǎo)致持水力下降速度加快,而CPX-G組膜液中的黃原膠可與魚肉蛋白發(fā)生共凝膠作用, 使魚肉蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密, 增強(qiáng)了體系截留水分的能力,從而使CPX-G組WHC的下降速度變緩[41]。綜上可見,復(fù)合膜在抑制魚體內(nèi)水分流失方面效果明顯。

3 結(jié)論

普魯蘭多糖復(fù)合膜的最佳制備條件為m(普魯蘭多糖)∶m(羧甲基殼聚糖)∶m(黃原膠)=2∶2∶1,膜液質(zhì)量濃度為1.4 g/100 mL,超聲時(shí)間為15 min。將復(fù)合膜應(yīng)用在大口黑鱸魚的保鮮上,發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜能顯著抑制魚肉肌動(dòng)球蛋白、總巰基、Ca2+-ATP酶活性及WHC的降低,有效延緩TVB-N、K值、TVC與pH值的增加。說明普魯蘭多糖/羧甲基殼聚糖/黃原膠/膠原蛋白復(fù)合膜對(duì)大口黑鱸魚具有良好的保鮮效果,維持魚肉品質(zhì)、延長(zhǎng)保質(zhì)期效果明顯。