• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    環(huán)β-1,2-葡聚糖-姜黃素包合物的體外益生特性研究

    2023-12-08 03:03:16吳傳超梁瑞雨張洪濤高敏杰朱莉詹曉北
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年22期
    關(guān)鍵詞:桿菌屬雙歧乙酸

    吳傳超,梁瑞雨,張洪濤,高敏杰,朱莉,詹曉北

    (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

    環(huán)β-1,2-葡聚糖(cyclosophoraose, Cys)是由根瘤菌屬和土壤農(nóng)桿菌屬等微生物合成環(huán)狀低聚糖,由β-1,2連接的D-吡喃葡萄糖單元組成[1]。Cys具有良好的水溶性(Cys為250 g/L;環(huán)糊精為18 g/L),且聚合度較環(huán)糊精聚合度大(Cys為17~25;環(huán)糊精為6~8),環(huán)狀空腔直徑更大(Cys為1.30 nm;環(huán)糊精為0.85 nm)[2]。Cys最重要的功能特性是由于其具有適應(yīng)性的疏水三維腔,能夠與廣泛的客體分子形成非共價(jià)包合物。這些主-客體體系的包合物通過氫鍵、范德華相互作用和靜電吸引等各種相互作用發(fā)生[3]。相比于環(huán)糊精,單位體積的Cys可以包合更多的物質(zhì)、攜帶更大的分子[4],使得Cys在食品、藥物遞送系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用中顯示出巨大的應(yīng)用前景[5]。

    姜黃素(curcumin, Cur)是一種從干燥的姜黃根莖中提取的傳統(tǒng)多酚,被稱為黃金營(yíng)養(yǎng)品[6]。Cur具有多種促進(jìn)結(jié)腸健康作用的膳食多酚而備受關(guān)注[7]。但其在水溶液中的溶解度較差(0.6 μg/mL)且穩(wěn)定性低,在到達(dá)結(jié)腸之前會(huì)在消化道發(fā)生降解或代謝,限制其商業(yè)應(yīng)用[8]。因此,增加Cur水溶性從而提高其生物利用度顯得尤為重要。Cur結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)芳香環(huán),攜帶多個(gè)羥基,可以與糖形成綴合物[9]。雖然已有報(bào)道環(huán)糊精與Cur形成絡(luò)合物以提高其水溶解度[10],但其強(qiáng)結(jié)合力和較低的水膨脹能力可能會(huì)給環(huán)糊精作為Cur的高效遞送系統(tǒng)帶來內(nèi)在缺陷。因此選擇更合適載體來改善其溶解度,保護(hù)其在胃中的不利條件并保持其在結(jié)腸中的釋放調(diào)節(jié)腸道菌群顯得尤為重要[7]。

    研究表明,腸道微生物對(duì)人類健康起著重要作用,包括維持腸道屏障的完整性、增強(qiáng)人體免疫力、抑制腸道病原體和維護(hù)腸道生態(tài)平衡[11]。因此,保持腸道微生物的多樣性和動(dòng)態(tài)平衡對(duì)宿主健康至關(guān)重要。益生元是一些不被宿主消化吸收,能夠選擇性促進(jìn)體內(nèi)有益生菌代謝和增殖,能夠幫助宿主改善機(jī)體健康[12]。一些膳食纖維,特別是抗性低聚糖(低聚果糖)(fructo oligosaccharide, FOS)被公認(rèn)為理想益生元[13]。此外,越來越多的研究[7-8]還證明了酚類物質(zhì)與腸道微生物群之間的相互作用,表明它們是益生元的候選化合物。酚類物質(zhì)通過選擇性地刺激結(jié)腸中有益細(xì)菌的生長(zhǎng)或活性和抑制潛在的致病性細(xì)菌來調(diào)節(jié)微生物多樣性,對(duì)宿主產(chǎn)生有價(jià)值的影響。相反,腸道微生物也可以調(diào)節(jié)酚類化合物的活性。這種相互作用可以調(diào)節(jié)酚類物質(zhì)的代謝和生物利用度,將其轉(zhuǎn)化為有利代謝物[12]。益生元經(jīng)過腸道微生物發(fā)酵后主要代謝物是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),主要成分是乙酸、丙酸和丁酸等,它們對(duì)于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用[11]。因此,我們假設(shè)結(jié)合Cur可能是Cys/Cur對(duì)健康益處的關(guān)鍵因素。Cys是腸道遠(yuǎn)端束結(jié)合Cur的載體,在遠(yuǎn)端束發(fā)生潛在的微生物轉(zhuǎn)化。然而,Cys中結(jié)合Cur的釋放及其對(duì)Cys/Cur益生特性的影響尚不清楚。

    鑒于上述情況,首先探究Cys/Cur對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬體外發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),比較FOS、Cys和Cys/Cur對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬常見腸道益生菌益生活性的影響,評(píng)價(jià)其對(duì)不同雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力。在此基礎(chǔ)上,通過體外模擬胃腸道消化和健康人糞便發(fā)酵進(jìn)一步探究Cys/Cur潛在益生特性。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

    動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium.animals)ZJTZ1M2、短雙歧桿菌(Bifidobacterium.breve)FWX346、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium.adolescentis)FHNFQ41M3、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus.acidophilu)LA28、干酪乳桿菌(Lactobacillus.casei)FJSSZ4L6、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus.rhamnosus)FFJLY7L1來自江南大學(xué)(中國(guó)無錫)食品微生物菌種保藏中心。

    1.2 試劑與培養(yǎng)基成分

    人工胃液和人工腸液,南京新帆生物科技有限公司;薄層色譜板[(thin-layer chromatography, TLC),硅膠60],綠百草科技有限公司;微孔濾膜,南通海之星實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;姜黃素,中國(guó)中大公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Cys和Cys/Cur參考WU等[14]的方法,由本實(shí)驗(yàn)室合成。

    MRS培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0、牛肉提取物10.0、酵母提取物5.0、葡萄糖3.0、K2HPO42.0、乙酸鈉5.0、MgSO40.2、MnSO40.2、CaCl20.45、檸檬酸銨2.0、L-半胱氨酸0.5、吐溫80 1 mL,pH 6.5;腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2.0、酵母提取物2.0、NaHCO32.0、NaCl 0.1、KH2PO40.04、K2HPO40.04、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5、牛膽鹽0.5、CaCl20.01、MgSO40.01、血紅素0.025、刃天青0.001、維生素K 0.002、吐溫80 2 mL。

    1.3 儀器與設(shè)備

    HYQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;安捷倫-1260高效液相色譜儀、7890A氣相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;SBA-40生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 體外模擬Cys及Cys/Cur的唾液、胃液和小腸液消化

    參考SHI等[15]的方法在體外模擬Cys和Cys/Cur消化。將100 mL人工唾液加入到100 mL 樣品溶液(Cys溶液或超純水溶液)(0.5 mg/mL)和100 mL超純水溶液中。唾液消化在37 ℃(100 r/min)的搖床培養(yǎng)箱中進(jìn)行。分別在0、15、30 min時(shí)取5 mL樣品,然后煮沸10 min使唾液淀粉酶失活。剩余唾液消化液進(jìn)一步用于模擬胃消化。

    仿生胃腸反應(yīng)器(biomimetic gastrointestinal reactor,BGR)是本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一種新型體外消化模型,本研究中只使用了胃和小腸反應(yīng)器[12]。剩余的唾液消化液(Cys或超純水溶液)及Cys/Cur溶液通過蠕動(dòng)泵輸送到BGR胃反應(yīng)器中等量的人工胃液中。模擬胃消化液pH值控制在3.0。分別在0、0.5、1、2 h下取胃消化液5 mL,煮沸10 min。剩余的胃消化液 (Cys、Cys/Cur溶液或超純水溶液)通過蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移到BGR小腸反應(yīng)器中,然后與等體積的人工小腸液結(jié)合。模擬腸道消化液pH值控制在7.0。隨后,分別在0、1、2、4 h收集小腸消化液(5 mL)煮沸后進(jìn)一步分析。從每個(gè)消化階段提取樣品,用蒽酮-硫酸法和DNS比色法測(cè)定Cys消化液中的總糖和還原糖的含量。

    1.4.2.檢測(cè)Cys降解和Cys/Cur釋放Cur的方法

    薄層色譜法測(cè)定了Cys的模擬消化過程。樣品(2 μL)置于薄層板上,以V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(水)=5∶5∶9為流動(dòng)相,直至展開至適當(dāng)位置。在薄層色譜板上噴上地衣酚試劑(3,5二羥基甲苯900 mg+無水乙醇375 mL+蒸餾水25 mL+濃硫酸50 mL),色譜后在105 ℃下加熱5 min顯色。每個(gè)模擬消化階段的Cys/Cur釋放的Cur檢測(cè)方法參考WU等[14]的方法,Cur的釋放率按照公式(1)計(jì)算:

    (1)

    1.4.3 雙歧桿菌屬和乳桿菌屬體外靜態(tài)培養(yǎng)方法

    體外分批發(fā)酵系統(tǒng)在嚴(yán)格的厭氧條件下進(jìn)行單個(gè)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬菌株的培養(yǎng)。通過在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)來活化細(xì)菌菌株。將FOS、Cys和Cys/Cur分別作為碳源(3 g/L)取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖,不含葡萄糖的MRS作為空白組(Blank組)。將種子液以10%的接種比接種于厭氧管中,然后轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h,并在0、8、16、24 h分別取樣(5 mL),測(cè)定發(fā)酵液的OD600值、pH值、乙酸和乳酸濃度來評(píng)價(jià)益生活性。

    1.4.4 利用人糞便微生物菌群體外發(fā)酵

    用無菌糞便收集管采集4名健康志愿者(2男2女,年齡20~25歲)的糞便,將這4份新鮮的糞便在厭氧環(huán)境下等量混合后,用無菌PBS稀釋,得到糞便勻漿10 mg/mL。在無菌條件下通過4層紗布過濾去除殘?jiān)?將糞便勻漿接種到不同組的腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照組(Blank組)為腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(無碳源),實(shí)驗(yàn)組分別以FOS(陽性對(duì)照組)、Cys和Cys/Cur為碳源添加到腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,質(zhì)量濃度均為5 mg/mL。37 ℃孵育24 h,在0、8、16、24 h分別采集樣品進(jìn)一步分析。

    1.4.5 短鏈脂肪酸和乳酸的測(cè)定

    短鏈脂肪酸濃度的測(cè)量采用GAO等[16]的方法。取離心后的發(fā)酵上清液(1 mL),添加終濃度為1 mmol/L的2-甲基丁酸作為內(nèi)標(biāo),再向其中添加250 μL濃鹽酸和1 mL乙醚,振蕩混勻。收集有機(jī)層,使用有機(jī)濾膜過濾后備用。取樣品0.5 μL注入氣相系統(tǒng),采用HP-INOWAX 色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和火焰離子化檢測(cè)器。乳酸濃度使用生物傳感分析儀測(cè)量。

    1.4.6 糞便菌群組成的檢測(cè)方法

    用CTAB/SDS法提取基因組DNA,稀釋至1 ng/μL。在稀釋基因組DNA的基礎(chǔ)上選擇特異性引物,用PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V3~V4區(qū)。得到的PCR產(chǎn)物被純化。測(cè)序文庫(kù)使用NEBNext?UltraTMIIDNA Library Prep Kit生成,并用Qubit和Q-PCR進(jìn)行定量。最后,在Illumina NovaSeq平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[8]。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    使用Origin 2022軟件進(jìn)行制圖,所有實(shí)驗(yàn)在3個(gè)生物重復(fù)中進(jìn)行。采用單因素方差分析和Duncan′s檢驗(yàn)(mean±SD,n=3),用SPSS 19.0軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Cys和Cys/Cur體外消化實(shí)驗(yàn)

    如附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),Cys的總糖和還原糖含量在不同的消化時(shí)間沒有顯著變化。因此,消化液不會(huì)降解Cys,也不會(huì)導(dǎo)致還原糖含量的增加(P<0.05)。如附圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),Cys降解不顯著,說明Cys對(duì)胃腸道的水解條件和消化酶反應(yīng)穩(wěn)定。從而使它們成為有益的結(jié)腸細(xì)菌可用的、更持久的潛在碳源,還可以作為理想的包埋載體材料來承受胃腸道上部的惡劣環(huán)境。

    A-B.animals ZJTZ1M2;B-B.breve FWX346;C-B.adolescentis FHNFQ41M3;D-L.acidophilu LA28;E-L.casei FJSSZ4L6;F-L.rhamnosus FFJLY7L1圖1 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬發(fā)酵生物量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on biomass of Bifidobacterium and Lactobacillus fermentation注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

    如附圖2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),在胃腸道消化過程中,Cys/Cur逐漸分解,釋放出Cur,最終的釋放率為(88±1.8)%。說明Cys/Cur成功地保護(hù)了被包裹的Cur免受暴露于胃消化條件下的消化。這一現(xiàn)象歸因于Cys的存在,可以提供界面層和能量屏障,保護(hù)Cur不被胃蛋白酶消化。在通過模擬腸道的過程中,Cys/Cur包合物中的Cur逐漸釋放。此外,在模擬腸液中,包埋材料聚集并形成團(tuán)塊。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因?yàn)榘衔锉灰让覆糠炙?pH值和離子強(qiáng)度的改變改變了包合材料之間的靜電相互作用[17]。因此,包埋Cur的Cys可以潛在地?cái)y帶和穩(wěn)定Cur,提高其生物利用度。

    A-B.animals ZJTZ1M2;B-B.breve FWX346;C-B.adolescentis FHNFQ41M3;D-L.acidophilu LA28;E-L.casei FJSSZ4L6;F-L.rhamnosus FFJLY7L1圖2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬發(fā)酵pH值影響Fig.2 Effects of different carbon sources on pH value of Bifidobacterium and Lactobacillus fermentation

    2.2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬活性的影響

    2.2.1 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)的影響

    不同種屬的益生菌對(duì)碳源的吸收利用與酶系及轉(zhuǎn)運(yùn)能力有很大差異,因此對(duì)不同碳源的利用率會(huì)有很大的不同[18]。與Blank組相比,在發(fā)酵24 h后,不同碳源組(FOS、Cys和Cys/Cur)可以不同程度地促進(jìn)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)(圖1)。以Cys/Cur為碳源的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的生物量在0~8 h期間內(nèi)顯著增加(P<0.05),在8~24 h生物量增速放緩(P>0.05),在發(fā)酵24 h時(shí),Cys/Cur組對(duì)B.animals、B.breve、B.adolescentis、L.acidophilus、L.casei和L.rhamnosus的OD600值分別為1.184±0.018、1.129±0.026、1.152±0.023、0.902±0.024、0.946±0.025和1.042±0.020。在Cys/Cur組中,與雙歧桿菌屬相比,Cys/Cur對(duì)于乳桿菌屬的增殖作用稍弱,這可能是由于利用碳源的能力取決于其底物偏好性和酶對(duì)復(fù)雜碳源的水解催化能力。此外,乳桿菌屬對(duì)多酚更敏感,低濃度的多酚容易起到抑制生長(zhǎng)的作用[19]。發(fā)酵24 h時(shí),Cys組在雙歧桿菌屬上的生物量顯著低于FOS組(P<0.05),可能的原因是隨著寡糖的聚合度和分子質(zhì)量的增加,其發(fā)酵性降低,需要較長(zhǎng)的發(fā)酵周期[20]。但發(fā)酵24 h后,Cys/Cur組在相同益生菌上的生物量顯著高于Cys和FOS組(P<0.05),可能的原因是結(jié)合的多酚可以通過雙歧桿菌屬和乳桿菌屬中的相關(guān)酶促反應(yīng)從包埋基質(zhì)中釋放成游離形式從而被益生菌修飾成比母體Cur更具益生活性的代謝產(chǎn)物[21]。這些結(jié)果證實(shí)了Cys中結(jié)合Cur可以更好的促進(jìn)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)。

    2.2.2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬培養(yǎng)基pH值的影響

    結(jié)腸的pH值下降程度還可以作為發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)[22]。如圖2所示,在發(fā)酵的24 h 期間,Blank組中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的pH值幾乎沒有變化(P>0.05),始終維持在(6.02±0.02)~(5.78±0.02)。發(fā)酵時(shí)間從0~24 h,FOS、Cys和Cys/Cur組的pH 值均先顯著下降(P<0.05)后趨于穩(wěn)定,變化趨勢(shì)與ΔOD600一致。發(fā)酵結(jié)束時(shí),以Cys/Cur為碳源對(duì)培養(yǎng)基pH的影響最大,各組pH值分別下降至4.72±0.02、4.81±0.02、4.67±0.05、4.89±0.02、4.81±0.04和4.88±0.05,FOS和Cys組的變化相似。以上結(jié)果表明,FOS、Cys和Cys/Cur組可以為雙歧桿菌屬和乳桿菌屬利用發(fā)酵產(chǎn)酸,但同一種益生菌對(duì)不同底物的嗜好性,因而代謝形成酸類物質(zhì)的量不同,致使發(fā)酵的pH值也不同。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被分解,益生菌的生長(zhǎng)變緩和代謝水平下降,培養(yǎng)基中pH便趨于穩(wěn)定。由于乳桿菌屬在生長(zhǎng)量增加量普遍低于雙歧桿菌屬,導(dǎo)致乳桿菌屬培養(yǎng)基的pH值弱于雙歧桿菌屬,表明乳桿菌屬代謝產(chǎn)酸能力要弱于雙歧桿菌屬。此外,還有一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn),Cys和Cys/Cur在0~4 h時(shí)具有相似的益生元特性,可能是在發(fā)酵初期缺乏足夠的多酚釋放來影響細(xì)菌的益生元特性。

    2.2.3 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬產(chǎn)乙酸和乳酸的影響

    如圖3所示,發(fā)酵結(jié)束時(shí),不同底物對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的促乙酸及乳酸產(chǎn)生效果的差異顯著。6株益生菌在體外發(fā)酵Cys/Cur過程中產(chǎn)生乙酸濃度分別是(61.11±5.01)、(59.04±2.41)、(57.45±4.46)、(53.63±2.01)、(50.36±4.21)和(52.62±3.01) mmol/L,乳酸質(zhì)量濃度分別是(3.23±0.01)、(3.22±0.03)、(3.30±0.02)、(2.92±0.05)、(3.15±0.03)、(3.48±0.02)mg/mL,顯著高于其他組(P<0.05),此外雙歧桿菌屬產(chǎn)生的乙酸總體略高于乳桿菌屬。

    2.3 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群的影響

    2.3.1 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群發(fā)酵pH及SCFAs生成的影響

    本研究中,在發(fā)酵0、8、16、24 h后測(cè)定pH和SCFAs濃度(圖4)。益生元可通過降低結(jié)腸的pH值抑制病原體的生長(zhǎng)[22]。圖4-A表明,在無碳源添加(Blank組)的情況下,發(fā)酵液的pH值略微下降,以FOS、Cys和Cys/Cur為碳源進(jìn)行糞菌發(fā)酵,各組發(fā)酵液的pH值均明顯降低,這與單菌發(fā)酵的結(jié)果相一致。其中Cys/Cur組發(fā)酵pH值由7.49±0.11下降至4.32±0.12,顯著低于其他組(P<0.05)。這些結(jié)果表明,FOS、Cys和Cys/Cur發(fā)酵可能產(chǎn)生大量的SCFAs[23]。

    A-pH值;B-乙酸;C-丙酸;D-丁酸;E-總短鏈脂肪酸;F-乳酸圖4 不同碳源與糞菌發(fā)酵對(duì)pH和SCFAs濃度的影響Fig.4 Effects of different carbon sources during fecal fermentation on pH and SCFAs concentration in vitro

    由圖4-B可知,發(fā)酵結(jié)束時(shí),各組的乙酸生成量在SCFAs中均占主導(dǎo)地位。乙酸有助于保持腸道環(huán)境穩(wěn)定,并滋養(yǎng)結(jié)腸中的其他有益細(xì)菌[24]。FOS、Cys和Cys/Cur組的乙酸濃度分別為(22.48±1.6)、(24.29±1.6)和(30.13±2.01)mmol/L均顯著高于Blank組[(8.98±2.4)mmol/L]。此外,Cys/Cur組產(chǎn)生的乙酸顯著高于FOS和Cys組(P<0.05)。丙酸具有抑制膽固醇的合成、減少脂肪貯存、抗癌和抗炎癥的特性[25]。由圖4-C所示,FOS、Cys和Cys/Cur組在糞便發(fā)酵24 h后所產(chǎn)生的丙酸濃度分別為(5.21±1.2)、(4.16±1.5)、(6.74±1.3)mmol/L,均顯著高于Blank組[(3.47±0.8)mmol/L],并且Cys/Cur組產(chǎn)生的丙酸顯著高于FOS和Cys組(P<0.05)。而丁酸可以保持結(jié)腸細(xì)胞穩(wěn)定,預(yù)防或抑制癌癥的發(fā)生[23]。由圖4-D可知,在發(fā)酵24 h后,Cys和Cys/Cur組產(chǎn)生的丁酸濃度分別為(1.01±0.2) mmol/L和(1.44±0.2) mmol/L,低于FOS組[(1.77±0.5) mmol/L]。乳酸對(duì)免疫系統(tǒng)也有好處,它可以作為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子。Cys/Cur組產(chǎn)生的乳酸質(zhì)量濃度為(1.61±0.03)mg/mL(圖4-F)。以上研究結(jié)果表明Blank組相比,FOS、Cys和Cys/Cur組能夠增加SCFAs的產(chǎn)生。同時(shí),Cys和Cys/Cur對(duì)腸道菌群產(chǎn)SCFAs的產(chǎn)量和比例不同,因?yàn)镃ys和Cys/Cur在結(jié)構(gòu)上存在差異,所以它們?cè)谀c道菌群中有不同的酵解途徑,進(jìn)而對(duì)腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物產(chǎn)生不同的影響。

    2.3.2 不同碳源對(duì)健康人腸道微生物菌群的影響

    基于細(xì)菌豐富度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))比較,與Cys組相比,Cys/Cur組的Chao1指數(shù)略有下降,但差異不顯著(P>0.05),但是Simpson和Shannon指數(shù)均高于Cys組(圖5-A)。因此,與Cys組相比,Cys/Cur組可顯著增加腸道微生物的多樣性,這可能與多酚的釋放和代謝密切相關(guān)[26]?;诩訖?quán)的UniFrac距離進(jìn)行了主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(圖5-B),各組的菌群結(jié)構(gòu)各成一簇,有明顯差異。結(jié)果表明腸道微生物菌群對(duì)不同碳源的響應(yīng)機(jī)制不同。但是腸道微生物在代謝中的作用是復(fù)雜的,為了進(jìn)一步研究Cys/Cur釋放的結(jié)合多酚對(duì)微生物組成的可能影響,必須在門和屬水平上進(jìn)行研究。

    A-腸道菌群α多樣性;B-PCoA;C-門水平;D-屬水平圖5 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群組成的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on gut microbiota composition of healthy human

    在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在各組中均占90%以上(圖5-C)。由于這些結(jié)果與人體腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)一致,體外糞便發(fā)酵試驗(yàn)可以很好地模擬人體腸道菌群[9]。與Cys組相比,Cys/Cur組放線菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度增加,變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。放線菌門則以雙歧桿菌為代表;厚壁菌門的大多數(shù)成員都是有益菌,如乳酸桿菌;變形菌門中多數(shù)細(xì)菌對(duì)人體具有致病性,如大腸桿菌、沙門氏菌等。發(fā)酵24 h后,FOS、Cys和Cys/Cur組中擬桿菌門的相對(duì)豐度低于Blank組,這可能與發(fā)酵pH值較低有關(guān)。先前的研究結(jié)果表明[7],酸性條件可以抑制酸敏感擬桿菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致發(fā)酵24 h后擬桿菌門豐度降低。在屬的水平上(圖5-D),發(fā)酵24 h后,與FOS和Cys組相比,Cys/Cur組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等益生菌屬顯著增加(P<0.05),顯著抑制了乳球菌屬、鏈球菌屬和克雷伯桿菌屬等條件致病菌的生長(zhǎng)(P<0.05)。此外,與Blank組相比,Cys組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬增殖,克雷伯桿菌屬減少。綜上所述,Cys對(duì)Cur的包封具有互惠互利的作用,Cys不僅可以作為合適的包埋載體,還可以作為益生元影響腸道菌群的豐度和組成。Cys/Cur組中包合的Cur也可以影響腸道微生物群的豐度和組成,同時(shí)也對(duì)腸道屏障功能有積極影響[9]。

    通過線性判別分析,以確定各組腸道菌群中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物?;诰€性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)評(píng)分大于4分,得到的直方圖和分支圖如圖6所示。總體水平分析顯示,Cys/Cur與Blank組間有18個(gè)分類操作單元(operational taxonomic units, OTUs)顯著差異,Cys/Cur與FOS組間有22個(gè)OTUs顯著差異,Cys/Cur與Cys組間共有15個(gè)OTUs顯著差異(圖6-A)。結(jié)果表明,在Cys組中,富集了多種致病菌,如大腸桿菌志賀菌。但是在Cys/Cur組顯著富集很多益生菌,如雙歧桿菌屬、乳桿菌屬。雙歧桿菌屬負(fù)責(zé)將Cys/Cur中的Cur生物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的酚類代謝產(chǎn)物[9],同時(shí)Cur及其位于腸道的生物活性代謝產(chǎn)物影響腸道微生物群的豐度和組成。因此,從致病腸道菌群到有益腸道菌群的改變可能有助于改善腸道健康和相關(guān)疾病。綜上所述,Cys/Cur調(diào)控改變了腸道菌群組成,促進(jìn)了有益菌群的增殖和抑制了有害菌的生長(zhǎng),具有一定的益生功能。

    A-不同碳源組的線性判別分析得分分布直方圖; B-不同碳源組的線性判別分析得分分布分支圖圖6 不同碳源糞便體外發(fā)酵24 h微生物群落的線性判別分析Fig.6 The LEfSe analysis of gut microbiota communities after in vitro 24 h fecal fermentation with different carbon sources

    3 結(jié)論

    本研究通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn)表明Cys對(duì)模擬唾液、胃液和小腸液具有抗消化性,可以順利到達(dá)結(jié)腸。在模擬胃腸道消化的過程中,Cys/Cur包合物中的Cur逐漸釋放,最終釋放率達(dá)到(88±1.8)%。在消化的基礎(chǔ)上研究Blank、FOS、Cys和Cys/Cur組與特定腸道益生菌株的增殖效果及乙酸和乳酸濃度進(jìn)行分析,結(jié)果表明,不同底物對(duì)模式益生菌表現(xiàn)為不同程度的益生元效應(yīng),其中以Cys/Cur組益生效果最好。其次通過健康人糞便的體外發(fā)酵進(jìn)一步驗(yàn)證了不同碳源的益生特性,與Cys和FOS組相比,Cys/Cur在24 h顯著增強(qiáng)了乙酸、丙酸和乳酸的產(chǎn)量,其濃度分別達(dá)到(30.13±2.01)、(6.74±1.3)mmol/L和(1.61±0.03) mg/mL。與Cys和FOS組相比,Cys/Cur組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等有益菌增殖,乳球菌、鏈球菌屬和克雷伯桿菌屬等潛在致病菌的相對(duì)豐度顯著減少。與Blank組相比,Cys組的乙酸濃度顯著提高,達(dá)到(24.29±1.6) mmol/L,Cys組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等關(guān)鍵細(xì)菌種類豐度增加,克雷伯桿菌屬等致病菌的相對(duì)豐度顯著減少。綜上,Cys/Cur調(diào)控改變了腸道菌群組成,促進(jìn)了有益菌群的增殖和抑制了有害菌的生長(zhǎng),具有雙重的益生功能。但離真正推廣到食品領(lǐng)域中還有很長(zhǎng)距離,接下來應(yīng)從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手,為Cys/Cur在食品中應(yīng)用提供更加充分?jǐn)?shù)據(jù)和理論支持。

    猜你喜歡
    桿菌屬雙歧乙酸
    潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群分布特征分析
    乙醇和乙酸常見考點(diǎn)例忻
    養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間生態(tài)位特性
    DMAC水溶液乙酸吸附分離過程
    乙酸仲丁酯的催化合成及分析
    雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合多潘立酮治療新生兒喂養(yǎng)不耐受40例
    類芽孢桿菌屬β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中可溶性重組表達(dá)的優(yōu)化
    Vitek-2 Compact和MALDI TOF MS對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌鑒定能力評(píng)估
    2-(N-甲氧基)亞氨基-2-苯基乙酸異松蒎酯的合成及表征
    產(chǎn)細(xì)菌素雙歧桿菌的篩選及其分泌條件研究
    91九色精品人成在线观看| 国产黄频视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 欧美变态另类bdsm刘玥| 黄片小视频在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 9色porny在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品av久久久久免费| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产精品一区二区蜜桃av | 电影成人av| 999精品在线视频| 五月天丁香电影| 国产高清videossex| 99香蕉大伊视频| 成人免费观看视频高清| 精品乱码久久久久久99久播| 天天影视国产精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 一级a爱视频在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲国产欧美网| 男女高潮啪啪啪动态图| 青草久久国产| 高清黄色对白视频在线免费看| 51午夜福利影视在线观看| 国产在线免费精品| 成年动漫av网址| 999久久久精品免费观看国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 婷婷丁香在线五月| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品成人在线| 亚洲av日韩在线播放| 国产不卡一卡二| 国产日韩欧美在线精品| 男人舔女人的私密视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| www日本在线高清视频| 黄片播放在线免费| 成人三级做爰电影| av片东京热男人的天堂| 麻豆国产av国片精品| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产在线观看jvid| 大型黄色视频在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 亚洲av片天天在线观看| 日韩免费av在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 女人精品久久久久毛片| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本a在线网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 另类亚洲欧美激情| 久久亚洲精品不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜视频精品福利| 亚洲欧美激情在线| 欧美激情久久久久久爽电影 | 两人在一起打扑克的视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 女性生殖器流出的白浆| 考比视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av一本久久久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 在线天堂中文资源库| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲专区字幕在线| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美久久黑人一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲视频免费观看视频| 成年动漫av网址| 国产野战对白在线观看| 9热在线视频观看99| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看免费午夜福利视频| 美女主播在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 老司机午夜福利在线观看视频 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品国产av在线观看| 色在线成人网| 精品国产亚洲在线| 午夜两性在线视频| www日本在线高清视频| 欧美性长视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 亚洲天堂av无毛| 久久久久国内视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久精品人妻al黑| 国产欧美日韩一区二区三| 成年动漫av网址| 国产又色又爽无遮挡免费看| 啦啦啦免费观看视频1| 悠悠久久av| 久久久久久久国产电影| 国产亚洲一区二区精品| 激情在线观看视频在线高清 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 在线 av 中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色丝袜av网址大全| 桃花免费在线播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲视频免费观看视频| 久热这里只有精品99| 精品一品国产午夜福利视频| 丝袜喷水一区| 老熟女久久久| 好男人电影高清在线观看| 久久久久久久国产电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产高清视频在线播放一区| 黄色 视频免费看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 老司机靠b影院| 亚洲专区国产一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| www日本在线高清视频| 国产精品久久久久成人av| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品1区2区在线观看. | 国产亚洲av高清不卡| 亚洲专区字幕在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| www日本在线高清视频| 欧美性长视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级毛片电影观看| 国产精品欧美亚洲77777| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产成人影院久久av| 人妻 亚洲 视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 老司机午夜十八禁免费视频| 青草久久国产| 欧美乱妇无乱码| 69av精品久久久久久 | 久久久久视频综合| 国产黄频视频在线观看| 操出白浆在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲免费av在线视频| 免费观看av网站的网址| 99精国产麻豆久久婷婷| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩欧美三级三区| 日本黄色日本黄色录像| 欧美黑人欧美精品刺激| 五月开心婷婷网| 99精国产麻豆久久婷婷| 天堂动漫精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 五月开心婷婷网| 一二三四社区在线视频社区8| 国产淫语在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 国产野战对白在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲欧美色中文字幕在线| 动漫黄色视频在线观看| 久热爱精品视频在线9| 欧美成人午夜精品| 又紧又爽又黄一区二区| 婷婷成人精品国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人国产一区最新在线观看| www日本在线高清视频| 国产视频一区二区在线看| 成年版毛片免费区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 51午夜福利影视在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品.久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品一二三| 国产91精品成人一区二区三区 | av片东京热男人的天堂| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 青草久久国产| 黄色 视频免费看| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久人妻av系列| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 天天添夜夜摸| 老鸭窝网址在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 热99re8久久精品国产| av福利片在线| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜成年电影在线免费观看| 国产av国产精品国产| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 丰满饥渴人妻一区二区三| 老司机在亚洲福利影院| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一级黄色大片毛片| 一级毛片精品| 亚洲av成人一区二区三| 久久国产精品影院| 另类精品久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 18禁国产床啪视频网站| netflix在线观看网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 在线观看免费视频网站a站| 18禁国产床啪视频网站| 女人久久www免费人成看片| 老司机影院毛片| 国产精品成人在线| 免费观看a级毛片全部| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久精品区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 制服人妻中文乱码| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人影院久久av| 亚洲 欧美一区二区三区| a级毛片黄视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲精品自拍成人| 桃花免费在线播放| 一本色道久久久久久精品综合| 精品第一国产精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99国产精品一区二区三区| av不卡在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 超碰成人久久| 飞空精品影院首页| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美在线黄色| 亚洲久久久国产精品| 露出奶头的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产精品免费大片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久精品94久久精品| av天堂久久9| 脱女人内裤的视频| 男女午夜视频在线观看| avwww免费| 国产高清激情床上av| 黄色视频不卡| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美在线一区亚洲| 久久久久国内视频| 午夜老司机福利片| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产在线视频一区二区| 大陆偷拍与自拍| 香蕉丝袜av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 麻豆国产av国片精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美中文综合在线视频| 91老司机精品| 亚洲专区中文字幕在线| 嫩草影视91久久| 国产不卡av网站在线观看| 嫩草影视91久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 美女午夜性视频免费| 在线永久观看黄色视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品一区二区三卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品免费久久久久久久清纯 | 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产高清国产精品国产三级| 丰满少妇做爰视频| 老汉色∧v一级毛片| 男女无遮挡免费网站观看| 五月开心婷婷网| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品自拍成人| 在线av久久热| 日本av手机在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品影院久久| 一进一出好大好爽视频| 国产福利在线免费观看视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 精品少妇久久久久久888优播| 岛国在线观看网站| 婷婷成人精品国产| 另类亚洲欧美激情| 露出奶头的视频| 十八禁人妻一区二区| 久久久久视频综合| 中文字幕高清在线视频| 丝袜美足系列| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| avwww免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品成人免费网站| 老司机福利观看| √禁漫天堂资源中文www| 成人国产av品久久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费高清在线观看日韩| 亚洲五月婷婷丁香| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品av麻豆狂野| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久av网站| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产xxxxx性猛交| av网站免费在线观看视频| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲精品美女久久av网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费日韩欧美在线观看| av欧美777| 91国产中文字幕| 日日夜夜操网爽| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品 国内视频| 久久热在线av| 男人舔女人的私密视频| 黄频高清免费视频| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品国产区一区二| 精品国产乱码久久久久久男人| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品久久久久久精品电影小说| 18禁国产床啪视频网站| av福利片在线| 无限看片的www在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品成人在线| 丰满少妇做爰视频| 成年动漫av网址| 午夜精品久久久久久毛片777| 不卡av一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 老司机午夜十八禁免费视频| 激情在线观看视频在线高清 | 黄片小视频在线播放| 午夜老司机福利片| 99国产精品一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一夜夜www| 久久久久久久久免费视频了| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 99国产精品99久久久久| 两个人免费观看高清视频| 一进一出抽搐动态| 色老头精品视频在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 大码成人一级视频| 国产高清视频在线播放一区| 夜夜爽天天搞| 99精品在免费线老司机午夜| 十八禁高潮呻吟视频| 一区二区三区精品91| 午夜免费鲁丝| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久免费观看电影| 成人黄色视频免费在线看| 免费在线观看日本一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成年人黄色毛片网站| 五月天丁香电影| 久久久国产精品麻豆| svipshipincom国产片| 好男人电影高清在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜久久久在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 欧美激情 高清一区二区三区| 91国产中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 妹子高潮喷水视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲 欧美一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩大码丰满熟妇| 大片电影免费在线观看免费| 国产不卡av网站在线观看| 久热这里只有精品99| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 99精品在免费线老司机午夜| 午夜福利乱码中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 窝窝影院91人妻| 日韩视频在线欧美| 一进一出抽搐动态| 欧美激情久久久久久爽电影 | 99re6热这里在线精品视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄片播放在线免费| 免费少妇av软件| 国产极品粉嫩免费观看在线| a级毛片黄视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久狼人影院| 亚洲免费av在线视频| 婷婷成人精品国产| 亚洲精华国产精华精| 搡老熟女国产l中国老女人| 热99久久久久精品小说推荐| 成人三级做爰电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 老司机影院毛片| 国产成人av激情在线播放| 一区福利在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 母亲3免费完整高清在线观看| 国产在视频线精品| 色94色欧美一区二区| av国产精品久久久久影院| 考比视频在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 美女视频免费永久观看网站| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲一区中文字幕在线| 视频区欧美日本亚洲| 日本av手机在线免费观看| 久热这里只有精品99| e午夜精品久久久久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 热99久久久久精品小说推荐| 性少妇av在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩大码丰满熟妇| 丰满少妇做爰视频| 亚洲第一av免费看| 在线观看免费午夜福利视频| 色老头精品视频在线观看| av在线播放免费不卡| 日本av免费视频播放| av不卡在线播放| 91精品三级在线观看| av网站在线播放免费| 韩国精品一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av日韩在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 多毛熟女@视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久久国产成人免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男女下面插进去视频免费观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 青青草视频在线视频观看| av在线播放免费不卡| 99热网站在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 免费在线观看完整版高清| 成人18禁在线播放| avwww免费| 一级片'在线观看视频| 亚洲成人免费av在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲 国产 在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美成狂野欧美在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 国产黄色免费在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精华国产精华精| 国产精品国产高清国产av | 亚洲黑人精品在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 老司机影院毛片| 在线观看舔阴道视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 丁香六月欧美| 久久久国产精品麻豆| netflix在线观看网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成人精品一区二区免费| 免费高清在线观看日韩| 丝袜美足系列| 久久国产精品大桥未久av| 精品国内亚洲2022精品成人 | 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲伊人久久精品综合| 99国产极品粉嫩在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成人国产一区最新在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜视频精品福利| 一区二区av电影网| 色在线成人网| 高清av免费在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲视频免费观看视频| 9色porny在线观看| 十八禁网站免费在线| 丁香六月欧美| videosex国产| 色播在线永久视频| 国产在线视频一区二区| 国产99久久九九免费精品| 亚洲中文av在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91老司机精品| 99国产精品免费福利视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 1024香蕉在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 黄色视频不卡| 亚洲午夜理论影院| 18禁美女被吸乳视频| www日本在线高清视频| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜激情av网站| 18在线观看网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 最新的欧美精品一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 久久这里只有精品19| 免费黄频网站在线观看国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品免费大片| 国产精品免费一区二区三区在线 | 久久午夜亚洲精品久久| 热re99久久精品国产66热6| 视频区图区小说|