MiR-184通過調節(jié)FOXO3促進卵巢癌細胞增殖能力*

李少儒, 戶瑞麗, 秦海霞

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科(河南新鄉(xiāng) 453100)

卵巢癌是我國女性生殖系統(tǒng)腫瘤病死率居于首位的惡性腫瘤之一[1]。由于卵巢癌臨床特征不明顯,在多數(shù)情況下,患者卵巢癌被確診時其腫瘤分期已達到Ⅲ期或Ⅳ期,治療效果極差,通過手術治療后易復發(fā),危害著患者身心健康[2]。輔助化療是中晚期卵巢癌及卵巢癌術后的主要治療策略。由于藥物的價格、耐受性等限制,使卵巢癌的治療受到限制。因此深入了解卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展機制,尋找新的分子靶點,并明確藥物的耐藥機制和增加化療敏感性對于改善卵巢癌患者預后是意義重大的。MicroRNA可通過降解靶mRNA 或抑制其翻譯,從而調控基因的表達,并調節(jié)細胞生長和組織分化等[3-4]。數(shù)據(jù)表明,MicroRNA在腫瘤發(fā)生中起重要作用。MicroRNA 作為致癌基因或腫瘤抑制基因[5]。與正常組織相比,癌癥組織中MicroRNA譜的改變表明特定MicroRNA可能代表新的診斷和預后標志物[6]。最近的研究表明,在多種癌細胞中miR-184的表達異常,并且miR-184可通過調控靶基因或信號通路促進細胞增殖[7-9]。FOXO3是細胞內重要的轉錄因子,參與調控細胞的增殖、分化、新陳代謝等多個方面,并且對癌細胞的增殖、分化和轉移起關鍵作用。然而,關于miR-184是否參與促進卵巢癌細胞增殖,在卵巢癌的發(fā)展中發(fā)揮何種作用,以及是否調控卵巢癌細胞中FOXO3基因的表達目前尚不清楚。因此本研究旨在探討miR-184通過調節(jié)FOXO3促進卵巢癌細胞增殖能力的影響,為探討其在卵巢癌發(fā)生以及發(fā)展過程中的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年8月至2020年10月期間于我院就診的21例卵巢癌患者的癌組織及對應癌旁組織標本?；颊吣挲g39～61(48.5±6.2)歲。所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)卵巢癌,既往病史無特殊,入組前3個月未進行任何治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(LHGJ20200525),所有患者和家屬均告知并簽署知情同意書。

1.2 細胞和主要試劑 人源卵巢癌細胞株SKOV3和人卵巢上皮細胞IOSE80購自中科院上海細胞庫;RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(貨號:SH30251)、胎牛血清(FBS,貨號:SH30084)、0.25%的胰酶消化液(貨號SH30042)及10×磷酸鹽緩沖液(PBS,貨號:SH30156)購買至Sigma公司;CyclinD1、p27kip1、FOXO3和β-actin抗體由Abcam公司提供;TaqMan? MicroRAN Reverse Transcription試劑盒(貨號:4366596)、TaqMan? Universal PCR Mas-ter Mix(貨號:4324018)由ABI公司提供;miR-184 mimics、mimics對照物、miR-184 inhibitor和inhibitor對照物由上海生工生物有限公司提供;miR-184 mimics正義鏈:UACGCAUACGAAUCAGUAG,反義鏈:CUACUGAUUCGUAUGCGUA;mimics對照物正義鏈:UUCACGGAUCGUAACUGCU,反義鏈:AGCAGUUACGAUCCGUGAA;miR-184 inhibitor正義鏈:AGGCAACAAAGUGAGACGU,反義鏈:ACGUCUCACUUUGUUGCCU;inhibitor對照物正義鏈UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU,反義鏈: ACCCUUAUCAGUUCUCCGUCCA。Lipo-fectamine? 2000 Transfection Reagent(貨號:11668027)和TRIzol試劑(貨號:15596-026)由Invitrogen公司提供;噻唑藍(MTT,貨號:M2128)購買于Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵巢癌細胞的培養(yǎng)及轉染 (1)細胞復蘇:從液氮罐中取出的人源卵巢癌細胞SKOV3,37℃水浴鍋融化,隨后4℃ 、300 r/min離心3 min,棄去上清液,加入將細胞重懸(1 mL RPMI -1640培養(yǎng)液(含10% FBS)),置于培養(yǎng)皿中,放入 CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),當生長至細胞密度為70%～80%時,對其進行傳代培養(yǎng)。(2)細胞轉染:取對數(shù)生長期SKOV3細胞,將SKOV3細胞調整為2×106個/mL的密度,接種與6孔板中,于培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)24 h,當細胞密度融合至70%～80%時進行轉染,轉染過程參考Lipo-fectamine? 2000 轉染試劑說明書進行操作。分別將miR-184 mimics、mimics對照物、miR-184 inhibitor和inhibitor對照物轉染至SKOV3細胞中,轉染完成后于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖能力 細胞轉染24,48和72 h后,MTT法檢測細胞增殖能力。具體過程如下:轉染后在不同時間點(24、48和72 h)分別收集細胞于96孔板,加入20 μL MTT溶液,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h,棄上清液后再加入120 μL二甲基亞砜,診斷裂解10 min。待沉淀完全溶解后,采用酶標儀在490 nm波長處測定OD值?？v坐標為測得的OD值,橫坐標為時間,進行細胞增殖曲線的繪制。檢測miR-184 mimics和miR-184 inhibitor對卵巢癌細胞增殖活力的影響。

1.3.3 Q-PCR檢測miR-184在細胞和組織中的表達水平 細胞中的RNA使用TRIzol進行提取。提起后的RNA進行反轉錄。反轉錄過程按照試劑盒說明書操作,獲得cDNA樣品。將獲得的cDNA濃度調整為50 ng/μL,采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進行熒光定量PCR擴增。以U6為內參基因,以相對定量2-ΔΔCt分析組織和細胞中miR-184相對表達水平?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.3.4 QPCR檢測FOXO3、cyclinD1和p27 mRNA的表達 TRIzol法分別提取細胞中的RNA,并反轉錄為cDNA,將獲得的cDNA濃度調整為50 ng/μL,采用SYBR premix Ex Taq試劑盒進行熒光定量PCR擴增。以β-actin為內參基因,以相對定量2-ΔΔCt分析細胞中FOXO3、cyclinD1和p27 mRNA相對表達水平?；蛞镄蛄幸姳?。

1.4 統(tǒng)計學方法 試驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 20.0和Microsoft Office Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析,并使用GraphPad Prism 7.0制圖,差異比較通過one-way ANOVA分析評估,數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織和細胞中miR-184的表達水平 如圖1A所示,與癌旁組織相比,卵巢癌組織中miR-184表達顯著升高;如圖1B所示,與IOSE80組相比,SKOV3細胞中miR-184表達顯著升高。

注: A: miR-184在卵巢癌組織和癌旁組織的表達水平; B:miR-184在人卵巢上皮細胞IOSE80和人卵巢癌細胞SKOV3中的表達水平;*P<0.05

2.2 人卵巢癌細胞SKOV3中FOXO3、cyclin D1和p27 mRNA的表達水平 如圖2所示,與IOSE80細胞相比,SKOV3細胞中FOXO3和p27 mRNA表達水平顯著降低,而cyclin D1 mRNA表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注: A:人卵巢癌細胞SKOV3中FOXO3 mRNA的表達水平; B:人卵巢癌細胞SKOV3中cyclin D1 mRNA的表達水平; C:人卵巢癌細胞SKOV3中p27 mRNA的表達水平;*P<0.05

2.3 轉染miR-184 minmic和miR-184 inhibitor對人卵巢癌細胞SKOV3中miR-184表達的影響 如圖3所示,與SKOV3組、NC-mimic組和NC-inhibitor組相比,miR-184 mimic組細胞中miR-184表達顯著升高,而miR-184 inhibitor組細胞中miR-184表達顯著降低,且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:*與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

2.4 miR-184 對人卵巢癌細胞SKOV3增殖活性的影響 如圖4所示,轉染miR-184 mimic組細胞比轉染miR-184 inhibitor組細胞增殖活性更高。結果表明miR-184能夠促進人卵巢癌細胞SKOV3的增殖活性(P<0.05)。

注: *與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

2.5 miR-184對人卵巢癌細胞SKOV3中FOXO3、cyclin D1和p27 mRNA表達的影響 如圖5所示,在過表達miR-184后,SKOV3細胞的cyclin D1 mRNA表達量顯著升高,而FOXO3和p27 mRNA表達量則顯著降低(P<0.05)。與此相反,當抑制miR-184的表達后,SKOV3細胞的cyclin D1 mRNA表達量顯著降低,而FOXO3和p27 mRNA表達量則顯著升高(P<0.05)。

注:A:FOXO3 mRNA表達;B:cyclin D1 mRNA表達;C:p27 mRNA表達。*與SKOV3組比較P<0.05; #與NC組比較P<0.05

3 討論

卵巢癌是嚴重威脅廣大女性身心健康的惡性生殖系統(tǒng)腫瘤之一,5年生存率僅為30%左右[10]。卵巢癌發(fā)病隱匿,確診時多已為中晚期,且病情發(fā)展迅速,致死率居高不下[11]。目前,卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展分子機制尚不清除,且缺乏高效的治療靶點。因此,探索卵巢癌治療的新靶點是迫切需要的。

MicroRNA是一類廣泛存在于動植物體內的長度為21～25nt的非編碼RNA,通過與目的基因mRNA的3′-URT區(qū)域堿基互補配對而調節(jié)目的基因的表達。MicroRNA是多種生物過程的重要調節(jié)因子,包括增殖、分化、遷移和凋亡,并在不同組織中差異表達[12]。最近研究表明,miR-184的異常表達與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在相關性[5,7,13]。馮強[14]研究發(fā)現(xiàn)在腎癌患者中腎癌組織中miR-184的表達水平低于癌旁組織,其細胞實驗結果表明miR-184的表達升高會抑制癌細胞的增殖能力,表明miR-184可能作為腎癌細胞的抑癌因子。Li等[5]研究表明,卵巢癌細胞中miR-184 mRNA表達顯著升高。Cui等[15]研究表明,在神經(jīng)膠質瘤中miR-184表達顯著升高,并且miR-184的表達水平隨神經(jīng)膠質瘤級別的增加而升高。本實驗通過檢測人卵巢癌組織、正常卵巢組織、人卵巢癌細胞SKOV3和人卵巢上皮細胞IOSE80,結果表明:miR-184在卵巢癌組織和人卵巢癌細胞SKOV3表達水平顯著升高。過表達miR-184后,人卵巢癌細胞SKOV3增殖能力顯著提高,而抑制miR-184表達后,人卵巢癌細胞SKOV3增殖能力顯著降低。這表明miR-184在促進卵巢癌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。

叉頭轉錄因子FOXO家族包括FOXO1、FOXO3a和FOXO4,是ATK蛋白激酶的主要靶蛋白,在細胞的增殖和凋亡過程中起著重要作用[16]。FOXO家族分子能夠直接通過調控與細胞周期調控相關的基因p27kip1和cyclin D1的轉錄而調控細胞的增殖[17]。最近一些研究表明,在不同惡性程度的腫瘤中FOXO3的表達水平和蛋白水平均出現(xiàn)顯著降低現(xiàn)象[12,18-19]。陳莉萍等[20]研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌組織中FOXO3的mRNA水平和蛋白水平顯著降低。Cui等[15]也研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質瘤中FOXO3的蛋白表達顯著降低。上述研究結果都顯示FOXO3蛋白的表達異常與惡性腫瘤的發(fā)生存在相關性。本研究結果表明,FOXO3a和p27 mRNA表達水平在SKOV3細胞中顯著降低,而cyclin D1 mRNA表達水平則顯著降低。此外,過表達miR-184后,SKOV3細胞的cyclin D1 mRNA表達水平顯著升高,而FOXO3和p27 mRNA表達水平則顯著降低;而抑制miR-184后則與此相反。上述結果表明,miR-184可能通過調控FOXO3而影響與細胞周期調控相關的基因p27kip1和cyclin D1的轉錄從而促進卵巢癌細胞的增殖。

綜上所述,上調miR-184促進卵巢癌細胞的增殖能力是調節(jié)FOXO3從而影響其下游與細胞周期調控相關的靶基因從而影響細胞增殖能力的變化。實驗結果表明,miR-184可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,可為治療卵巢癌提高潛在的靶點。

利益相關聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：李少儒設計了這項研究,分析了數(shù)據(jù),進行了實驗并撰寫了論文。戶瑞麗設計了這項研究并分析了數(shù)據(jù)以及進行了試驗。秦海霞整理了數(shù)據(jù)。