子宮內(nèi)膜異位癥患者miR-429與HIF-1α、VEGF水平和臨床分期的相關(guān)性及其診斷效能*

劉佳, 張燕, 陳少麗

深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院婦科(廣東深圳 518109)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是指子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESCs)在子宮內(nèi)膜腺體和細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng)所導(dǎo)致的一種較為常見(jiàn)的婦科疾病,是引起婦女不孕和盆腔疼痛的主要原因之一,其發(fā)病原因至今尚不清楚[1-2]。有研究表明,ESCs增殖、黏附、遷移及侵襲能力增強(qiáng)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織異位生長(zhǎng)和病變,抑制ESCs轉(zhuǎn)移有利于改善EMs[3]。同時(shí)有研究表明,子宮內(nèi)膜移位的原因可能與缺血有關(guān),而缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路激活是引起EMs和血管生成的有效途徑之一[4]。微小核糖核酸(microRNA,miR)主要是一種抑制基因表達(dá)的小型非編碼RNA,其中miR-429是miR-200家屬成員之一[5]。有研究表明,miR-429表達(dá)水平在EMs患者中明顯升高,同時(shí)干擾miR-429表達(dá)水平能影響HIF-1α和VEGF水平,且miR-429 對(duì)ESCs的增殖、遷移和侵襲有一定影響作用[3]。但有關(guān)EMs患者miR-429水平與HIF-1α、VEGF水平及臨床分期的相關(guān)性及其對(duì)EMs的預(yù)測(cè)價(jià)值未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究對(duì)135例EMs患者和80例非EMs健康育齡婦女的上述相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了對(duì)比分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年2月至2023年1月作者單位EMs確診者135例為EMs組,年齡21～46歲,平均(32.67±9.03)歲。參照美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)EMs分期系統(tǒng)(r-AFS)將EMs組分為Ⅰ期(n=23)、Ⅱ期(n=35)、Ⅲ期(n=49)及Ⅳ期(n=28)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有EMs患者均符合2015年《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)手術(shù)組織經(jīng)病理切片確診者;(3)年齡≥18歲;(4)初診者;(5)患者及家屬知情同意者;(6)自愿參與者;(7)近半年來(lái)未用激素類和(或)免疫抑制藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有嚴(yán)重肝、腎功能不全者;(2)精神病者;(3)腫瘤者;(4)妊娠及哺乳者;(5)凝血功能異常者;(6)血液病者;(7)自身免疫性疾病者;(8)伴有代謝性疾病者;(9)不配合者;(10)中途退出者。

同時(shí)選取80例非EMs育齡婦女為對(duì)照組,年齡20～47歲,平均(30.96±8.74)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)≥18歲;(2)孕產(chǎn)≥1次;(3)自愿參與者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)痛經(jīng)者;(2)盆腔炎者;(3)下腹部疼痛者;(4)性交不適者;(5)月經(jīng)異常者。年齡確保兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)同作者醫(yī)院倫理委員辦公室批準(zhǔn)同意{龍華人醫(yī)倫審(研)[2022]第(014)號(hào)}。

1.2 儀器與試劑 HIF-1α、VEGF試劑盒(科順公司,上海),miRNAs提取試劑盒和cDNA合成試劑盒(Takara,日本);SYBR Green Master Mix 試劑盒(Applied Biosystems,美國(guó)); ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(ABI公司,美國(guó));AE275酶免分析儀(愛(ài)康公司,深圳)。

1.3 方法

1.3.1 miRNAs提取 取靜脈血3～4 mL于干燥管中,離心30 min(4℃,3 000 r/min),12 000 r/min離心10 min,然后取上層液采用RNAiso for Small RNA試劑盒進(jìn)行提取,所有操作參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.2 cDNA合成 將提取的miRNAs通過(guò)Mir-XTMmiRNA 第一鏈合成試劑盒在65℃下反轉(zhuǎn)錄10.0 min,所有操作參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.3 miR-429水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)法進(jìn)行血清miR-429水平,測(cè)定,具體操作流程參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 HIF-1α和VEGF水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELSIA)對(duì)HIF-1α和VEGF水平進(jìn)行測(cè)定,具體操作參照儀器和試劑盒說(shuō)明。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-429、HIF-1α及VEGF水平比較 EMs組miR-429、HIF-1α及VEGF水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組miR-429、HIF-1α及VEGF水平比較

2.2 不同臨床分期miR-429、HIF-1α及VEGF水平比較 miR-429、HIF-1α及VEGF水平隨EMs分期的加重而升高,不同臨床分期之間差異明顯(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同臨床分期miR-429、HIF-1α及VEGF水平比較

2.3 EMs患者miR-429水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性 EMs患者miR-429水平升高,HIF-1α和VEGF水平也明顯升高,經(jīng)Pearman相關(guān)性分析,miR-429與HIF-1α和VEGF水平呈明顯正相關(guān)(r=0.525 0,0.483 2,P<0.05);同時(shí)隨EMs臨床分期的加重而miR-429水平升高,經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,miR-429水平與臨床分期呈正相關(guān)(r=0.751 0,P<0.05),見(jiàn)圖1～3。

圖1 EMs患者miR-429與HIF-1α水平相關(guān)性

圖2 EMs患者miR-429與VEGF水平相關(guān)性

圖3 EMs患者miR-429水平與臨床分期相關(guān)性

圖4 血清miR-429水平對(duì)EMs的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4 血清miR-429水平對(duì)EMs的預(yù)測(cè)價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析,血清miR-429預(yù)測(cè)EMs的AUC為0.915(95%CI:0.877～0.953),特異度為72.98%,明顯高于HIF-1α、VEGF檢測(cè)指標(biāo)(Z=2.405,2.756,P<0.05),但明顯低于三者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值,而敏感度基本一致,見(jiàn)表3。

表3 血清miR-429水平對(duì)EMs的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

EMs是育齡婦女常見(jiàn)和多發(fā)的一種雌激素依賴性良性疾病,但其病變部位廣、形態(tài)不一,同時(shí)還具有惡性腫瘤的生物學(xué)特性(如轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、侵襲及復(fù)發(fā)等),可引起女性月經(jīng)異常、痛經(jīng)、盆腔慢性疼痛、異位結(jié)節(jié)及不孕,是導(dǎo)致不孕的常見(jiàn)原因之一,其發(fā)病率為10%～15%,占女性不孕的30%～50%,多發(fā)于30～40歲婦女,且呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響身心健康與生育功能[8-10]。但EMs發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,早期癥狀不明顯,甚至無(wú)癥狀,給早期診斷帶來(lái)一定困難,易發(fā)生漏診,使EMs病情進(jìn)一步惡化[11-12]。因此,研究EMs有關(guān)臨床診斷指標(biāo),對(duì)EMs早期診斷、治療及發(fā)病機(jī)制研究具有重要的意義。

EMs發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚未完全明確。有研究認(rèn)為,子宮內(nèi)膜移位最初的原因可能與缺血、缺氧有關(guān)[13]。miR是一類單鏈非編碼內(nèi)源性小分子RNA,長(zhǎng)度為22～24個(gè)核苷酸,可通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)后發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,從而參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程[14],其中miR-429是miR-200大家族成員之一,是低氧反應(yīng)的miR之一,可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及衰老凋亡而在腫瘤發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用,但表達(dá)水平不一,在多數(shù)腫瘤中,miR-429發(fā)揮抑制性作用,抑制腫瘤的發(fā)生。但也有研究表明,miR-429在一些癌癥中起促進(jìn)作用,如膀胱癌和卵巢癌患者組織和(或)細(xì)胞中miR-429水平明顯上調(diào),其過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移,減少癌細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),EMs患者miR-429水平呈過(guò)度表達(dá),可增強(qiáng)ESCs的增殖、侵襲及遷移能力,干擾 miR-429 表達(dá)后,ESCs增殖、侵襲及遷移能力受到抑制。此外,miR-429過(guò)表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)小檗堿對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[3,15-17]。本研究結(jié)果顯示,EMs患者血清中miR-429水平明顯升高,且與臨床分期呈明顯正相關(guān),這表明miR-429過(guò)表達(dá)與EMs發(fā)病密切相關(guān),這可能與miR-429過(guò)表達(dá)促進(jìn)EMs患者ESCs增殖、侵襲及遷移有關(guān)。

HIF-1α是對(duì)缺氧環(huán)境能及時(shí)產(chǎn)生反應(yīng)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,是促進(jìn)腫瘤新生血管生成的核心因子,在腫瘤侵襲過(guò)程中新生血管形成的環(huán)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用,其作用主要是通過(guò)其靶基因VEGF來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),EMs發(fā)病中最關(guān)鍵的一環(huán)是新生血管生成,而VEGF是人體內(nèi)最強(qiáng)的一種促血管生成因子,又是HIF-1α調(diào)節(jié)的一種最重要的靶基因,能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上,不僅能促使新生血管生成,且在EMs發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示,EMs患者血清中HIF-1α、VEGF水平明顯升高,這說(shuō)明缺氧可能是EMs發(fā)病的一個(gè)誘因,子宮內(nèi)膜組織缺氧,HIF-1α蛋白降解減少,導(dǎo)致其過(guò)表達(dá),從而激活VEGF靶基因轉(zhuǎn)錄,子宮內(nèi)膜遷移、種植到宮腔外其他部位,體積增大,進(jìn)一步加重局部缺氧,進(jìn)而HIF-1α通過(guò)調(diào)控VEGF基因使VEGF呈高表達(dá),從而促使血管生成[20]。同時(shí)結(jié)果顯示,EMs患者miR-429水平與HIF-1α、VEGF水平呈正相關(guān),這說(shuō)明miR-429過(guò)表達(dá)還可能通過(guò)激活HIF-1α/VEGF通路,促使新血管生成而在EMs發(fā)病中發(fā)揮作用有關(guān),具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外,結(jié)果還顯示,miR-429、HIF-1α及VEGF單獨(dú)及三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)EMs診斷均有很高的敏感度,但聯(lián)合檢測(cè)的特異度最高,提示三者聯(lián)合檢測(cè)更有利于EMs診斷和病情評(píng)估,具有更高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述,EMs患者血清中miR-429水平明顯升高,且與HIF-1α、VEGF水平及臨床分期呈明顯正相關(guān)。同時(shí)miR-429、HIF-1α及VEGF三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)EMs患者診斷和病情評(píng)估比單獨(dú)檢測(cè)具有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值,值得臨床推廣應(yīng)用。

利益相關(guān)聲明：本文不涉及任何相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：劉佳負(fù)責(zé)提出研究選題、方案、實(shí)施、采集及數(shù)據(jù)整理和分析;張燕負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、設(shè)計(jì)論文框架、起草論文、修訂論文、終審論文;陳少麗負(fù)責(zé)獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)或材料支持和指導(dǎo)性支持。