HPLC法測(cè)定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量

唐佳齊 何 艷 王 慶 黃 琴 楊 霞 張 輝

湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000

抗骨髓炎片收載在《中國(guó)藥典》2020年版一部中，由金銀花、蒲公英、紫花地丁、半枝蓮、白頭翁和白花蛇舌草組成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、散瘀消腫之功效，用于熱毒血瘀所致附骨疽及骨髓炎等癥[1]。抗骨髓炎片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅測(cè)定綠原酸的含量作為質(zhì)控指標(biāo)，相關(guān)文獻(xiàn)也僅有薄層掃描測(cè)定綠原酸[2]或HPLC測(cè)定白頭翁皂苷B4[3]的含量，質(zhì)控指標(biāo)單一，難以有效控制制劑質(zhì)量。方中金銀花清熱解毒、消炎退腫，蒲公英解熱涼血，兩者主要活性成分為綠原酸[4-5]；紫花地丁清熱解毒，治癰疽疔腫，其主要活性成分為秦皮乙素[6]。為此，為了更加全面地控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量，此法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為有效控制該制劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，XSE-205電子天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)，DZKW-D電熱恒溫水浴鍋(北京市永明醫(yī)療儀器有限公司)，KQ-500DE超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201817，含量：96.8%)、秦皮乙素對(duì)照品(批號(hào)：110741-201708，含量：99.9%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院?？构撬柩灼?萊陽(yáng)市江波制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：2111253、2203022、2203052)，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑、試藥均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈- 0.1%磷酸(9∶91)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，進(jìn)樣量10 μL。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，綠原酸、秦皮乙素與其他色譜峰分離較好(分離度>1.5)，且陰性樣品無(wú)干擾(如圖1)。

A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺金銀花、蒲公英陰性樣品；D.缺紫花地?。?.綠原酸；2.秦皮乙素

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品綠原酸、秦皮乙素7.47 mg、6.28 mg，各置20 mL量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度。分別精密量取 4 mL、1 mL 置10 mL量瓶中，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(綠原酸144.6 μg·mL-1、秦皮乙素31.37 μg·mL-1)。

2.3 供試品溶液的制備 取抗骨髓炎片20片，除去糖衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.8 g，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱(chēng)定重量，超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷至室溫，再稱(chēng)定重量，減失的重量用70%甲醇補(bǔ)足，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取按處方工藝制成不含蒲公英和金銀花、不含紫花地丁的陰性樣品，取適量研細(xì)，按“2.3”項(xiàng)下方法制成缺蒲公英和金銀花、缺紫花地丁的陰性樣品溶液。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸和秦皮乙素的峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。綠原酸、秦皮乙素分別在14.46～144.6 μg·mL-1、3.137～31.37 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=29.97X+0.0071(r=0.9999)、Y=28.59X-0.6687(r=0.9999)。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用70%甲醇稀釋2倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.15%、0.18% ，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(批號(hào)：2111253)溶液10 μL，分別在0 h、3 h、5 h、7 h、10 h、12 h依次進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.43%、0.95% ，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品(批號(hào)：2111253)6份，照“2.3”項(xiàng)下制備，得6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)綠原酸、秦皮乙素含量分別為 4.927 mg·g-1、1.079 mg·g-1，RSD分別為0.37%(n=6)、1.73%(n=6)，表明該方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：2111253)6份，精密稱(chēng)取0.4 g，置具塞錐形瓶中，按1∶1的比例分別加入綠原酸、秦皮乙素對(duì)照品溶液(0.3833 mg·mL-1綠原酸 5mL、0.4076 mg·mL-1秦皮乙素1 mL )，用70%甲醇補(bǔ)足至50 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸、秦皮乙素平均回收率分別為98.65%(RSD= 0.75%)、96.51%(RSD= 1.58%)，結(jié)果準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

表1 綠原酸、秦皮乙素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 含量測(cè)定 取3個(gè)批次的抗骨髓炎片樣品，除去糖衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.8 g，按“2.3”項(xiàng)下方法各平行制備2份供試品溶液，分別吸取10 μL，進(jìn)樣測(cè)定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算含量。見(jiàn)表2。

表2 樣品中2種成分含量測(cè)定的結(jié)果(mg·g-1，n=2)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～400 nm對(duì)綠原酸、秦皮乙素對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在327 nm、秦皮乙素在345 nm具有最大吸收，綜合考慮故本文選用327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件優(yōu)化 依據(jù)文獻(xiàn)[7-8]方法，本文比較了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，綠原酸和秦皮乙素的分離效果較好，當(dāng)增加磷酸濃度時(shí)，2個(gè)成分色譜峰峰形無(wú)明顯變化，故選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。再考察了不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB C18、SHIMADU Shim-pack-C18、Thermo Hypersil Gold-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、不同儀器(Agilent 1260、SHIMADU LC-20AT )對(duì)2個(gè)成分測(cè)定時(shí)分離效果的影響，結(jié)果均能實(shí)現(xiàn)較好的分離。

3.3 供試品制備方法的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)采用不同溶劑(乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇)進(jìn)行超聲和加熱回流提取，結(jié)果顯示，采用70%甲醇超聲提取時(shí)，綠原酸和秦皮乙素提取率高，且峰形較佳，超聲提取能明顯縮短提取時(shí)間；再考察了超聲提取30 min、40 min、50 min、60 min，結(jié)果超聲提取40 min時(shí)，綠原酸和秦皮乙素基本提取完全，故選擇超聲提取40 min。

綜上所述，本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定抗骨髓片中2種有效成分的含量，涵蓋了制劑中的君藥和臣藥，方法簡(jiǎn)單易行、專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確度高，為更為全面地控制抗骨髓炎片的質(zhì)量和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。