黃連總生物堿通過(guò)調(diào)控CaMKII減輕局灶性腦缺血(MCAO)大鼠神經(jīng)功能損傷的研究

李向陽(yáng) 張曉敏 梁廣霞 王 琳 付衛(wèi)旭 牛憲立

1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院腫瘤科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系，廣東 珠海 519041

腦血管疾病是因?yàn)槟X部血液循環(huán)故障引起的，造成對(duì)腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴(yán)重危害了人們健康，臨床上主要表現(xiàn)為急性腦血管病，急性腦血管病可分為出血性、缺血性兩種，其中缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70%～80%[1]。Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaM KinaseⅡ)在腦中含量十分豐富且對(duì)中樞正常神經(jīng)元活動(dòng)至關(guān)重要。短暫腦缺血即可誘發(fā)缺血敏感組織該酶活性顯著抑制，再灌注后其活性逐漸恢復(fù)[2]。大量研究[3]表明，Ca2+/CaM Ⅱ活性抑制與缺血性遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)關(guān)系密切。黃連(CoptischinensisFranch)為傳統(tǒng)中藥，黃連素是黃連的主要成分，具有廣泛的藥理作用[4-5]。有研究[6-7]表明，在個(gè)體和細(xì)胞水平上都可以保護(hù)和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細(xì)胞。黃連可以顯著改善大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)功能，減小腦梗死灶體積，具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用[8-10]。因此，本研究通過(guò)建立大鼠MCAO模型，檢測(cè)黃連對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型中CaMKII含量的影響，探討黃連保護(hù)缺血性腦損傷的作用機(jī)制，為黃連在腦缺血疾病上的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年SD雄性大鼠，6月齡，體重約220 g，由珠海市百試通生物科技公司提供(許可證號(hào)：SCXK[粵](méi)2020-0051)。

1.2 腦缺血模型的制備 大鼠麻醉前禁食8 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛0.35 mL/100 g進(jìn)行麻醉后，依據(jù)參考文獻(xiàn)[15]，對(duì)大鼠頸部總動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，構(gòu)建腦缺血模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分 依照Longa 5等制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，從而根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇符合要求的模型大鼠。依照Longa的5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1～4分為有效模型，1分為提尾時(shí)不能完全伸展前爪，2分行走時(shí)向左右側(cè)旋轉(zhuǎn)，3分為行走時(shí)向左右側(cè)傾倒，4分不能自由行走。積分越高說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 Longa 5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將50只的SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。黃連總生物堿(低濃度 2.5 g/L、中濃度5.0 g/L和高濃度10.0 g/L)治療組、模型組、假手術(shù)組，治療組用黃連總生物堿灌胃，對(duì)照組和假手術(shù)組用等量生理鹽水灌胃。按照人與大鼠等效劑量關(guān)系折算，每只大鼠1 d灌胃兩次，每次2 mL，連續(xù)灌胃7 d。在最后1次給藥12 h之后，對(duì)大鼠進(jìn)行頸椎脫臼法處死，取腦并標(biāo)記保存。

1.5 TTC染色 在-20 ℃冰箱中取出鼠腦組織，切成2 mm厚度，依次放入十二孔板中，注入2%TTC染液，避光37 ℃恒溫孵育20 min，抽出染色液，4%的多聚甲醛固定24 h，通過(guò)Imdge-Pro Plus軟件測(cè)量，正常大腦染成鮮紅色，缺血組織出現(xiàn)蒼白色。梗死體積(%)=梗死體積/對(duì)側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6 酶聯(lián)免疫 吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè) CaMKII的含量組織樣品在PBS中勻漿后取上清液，CaMKII的含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)。根據(jù)CaMKII檢測(cè)試劑盒的操作步驟，封閉后在37 ℃孵箱中孵化1 h。往每孔里加入90 μL的酶作用底物，沖洗、孵育、顯色。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。各步驟均嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.7 測(cè)定SOD活力及MDA含量 按上述方法制備組織勻漿，嚴(yán)格按照SOD檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，得到各孔OD值。

1.8 肝組織病理學(xué)觀察 將取得的大鼠腦組織用4%多聚甲醛固定12 h、常規(guī)脫水、石蠟浸蠟包埋、定形后制作石蠟切片。按照HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，固定封片后置于光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)元病理學(xué)變化情況及拍照采圖。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比較 對(duì)SD大鼠MCAO模型構(gòu)建完成后，以Longa的5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，與假手組相比，模型組評(píng)分和腦梗死體積明顯升高，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)黃連治療后神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積都有明顯的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Longa法評(píng)分和腦梗死體積比較結(jié)果

2.2 大鼠腦組織勻漿上清液CaMKII的含量測(cè)定 對(duì)酶標(biāo)儀檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，如下表3、圖1所示，其中表3是標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋液的吸光度值及濃度值，圖1是標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋液的曲線圖，X代表濃度值，Y代表吸光度值，該圖的曲線方程為方程：y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，其中A=5.48892，B=-1.33598，C=6.85143，D=0.08579，r2=0.99982。測(cè)出待測(cè)樣品的吸光度值，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或者標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和待測(cè)樣品的吸光度值，計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線圖

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋液的Logistic曲線的數(shù)據(jù)

表4 各組大鼠腦組織勻漿上清液CaMKII的含量的結(jié)果

表5 各組大鼠腦組織勻漿上清液SOD、MDA的含量的結(jié)果

對(duì)照組的CaMKII的含量(3.547±0.021)ng/mL與假手術(shù)組(0.526±0.034)ng/mL相比顯著升高(P<0.01)；治療組中Ca2+/CaMKII的活性[高濃度(0.720±0.044)ng/mL、中濃度(0.863±0.045)ng/mL、低濃度(1.543±0.170)ng/mL]與對(duì)照組(3.547±0.021)ng/mL相比明顯降低(P<0.05)，而且黃連總生物堿降低CaMKII的含量具有劑量依賴性，其劑量越高，降低效果越明顯，與假手術(shù)組的值越接近。

2.3 各組大鼠腦組織勻漿上清液SOD、MDA的含量水平比較 模型組與與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織損傷程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黃連治療后，低、中、高劑量組氧化因子SOD水平升高，MDA水平降低。

2.4 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果 假手術(shù)組腦神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無(wú)明顯異常病變。模型組大鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞間隙增大，有明顯水腫，胞體腫脹變形，胞質(zhì)中空泡增多，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，核仁變淺或溶解缺失，呈現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。不同劑量的黃連治療組處理后，各組神經(jīng)元的病變均有明顯的改善，且隨著劑量的增大，改善效果越明顯，神經(jīng)元細(xì)胞較為規(guī)則，排列較為有序，水腫減輕。如圖2所示。

3 討論

腦部血液循環(huán)障礙引起的腦血管性疾病，從而造成腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴(yán)重危害了人們的健康[16]。腦缺氧缺血所引起的損傷除發(fā)生在缺血期外，更可能發(fā)生在缺血組織再灌注時(shí)。后者是由于氧的重新供應(yīng)，導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生而引起的[17]。缺氧缺血性腦損傷時(shí)，由于氧自由基的大量產(chǎn)生等導(dǎo)致細(xì)胞膜Ca2+通道開(kāi)放，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常升高，進(jìn)一步干擾了線粒體氧化磷酸化過(guò)程，且大量激活鈣依賴性酶類使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)又產(chǎn)生大量氧自由基，加重細(xì)胞損害，從而引起海馬細(xì)胞的損傷與凋亡。另外被激活的血小板其Ca2+亦增加，可形成微血栓。過(guò)量的自由基攻擊位于細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸從而引起脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，并進(jìn)一步形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物。測(cè)定MDA含量能夠反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映缺血對(duì)細(xì)胞造成的損傷[18-19]。

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，是Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能的酶成員，在神經(jīng)組織廣泛分布，參與調(diào)節(jié)突觸的轉(zhuǎn)送過(guò)程，形成長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (LTP)，是介導(dǎo)記憶和學(xué)習(xí)的關(guān)鍵物質(zhì)。其次，CaMKⅡ還持有調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄等功能。在腦缺血損傷的病理過(guò)程中，CaMKⅡ起著格外重要的作用[20-21]。在短暫性腦缺血時(shí)，由于鈣離子超載，導(dǎo)致CaMKⅡ含量和磷酸化水平異常升高，致使神經(jīng)組織受到損傷[22-23]。有研究[24-26]表明黃連總生物堿在個(gè)體和細(xì)胞水平均可保護(hù)和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細(xì)胞。從結(jié)果可以看出模型組的CaMKII的含量與假手術(shù)組相比顯著升高(P<0.01)；治療組中Ca2+/CaMKII的含量與模型組相比明顯降低(P<0.05)，且具有一定劑量依賴性。黃連總生物堿可以通過(guò)降低局灶性腦缺血大鼠模型中CaMKII含量的作用，CaMKII含量異常升高導(dǎo)致的一系列神經(jīng)損傷的效果，其機(jī)制可能與增加血清SOD活性及降低MDA含量有關(guān)。

綜上所述，黃連總生物堿通過(guò)調(diào)控CaMKII可減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的損傷和對(duì)腦梗死體積有明顯地改善作用，減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與腦缺血過(guò)程促進(jìn)了CaMKII的表達(dá)，黃連總生物堿可能調(diào)控了CaMKII的表達(dá)從而減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。