苦豆子凝膠薄層色譜鑒別研究

郭鴻雁 李 軍

寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021

為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項(xiàng)的內(nèi)容，參考2020年《中國藥典》中藥及制劑鑒別的薄層色譜法[9]與相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]，本研究優(yōu)化了供試品制備方法、展開劑、點(diǎn)樣量等色譜條件，完成了專屬性和不同溫濕度、不同薄層板的耐用性等方法學(xué)驗(yàn)證，建立了苦豆子凝膠劑的薄層色譜鑒別法，為制定該凝膠劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XP205電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；DHG-9070A恒溫干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；明澈-D 24超純水系統(tǒng)(美國默克密理博有限公司)；200 mm×200 mm薄層色譜雙槽展開缸(上海信儀儀器廠)。

1.2 材料 硅膠G薄層板(青島海洋化工有限司，批號(hào)：20210418)、高效硅膠HSG板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，批號(hào)：20211013)、硅膠G薄層板(青島海勝精細(xì)硅膠化工有限公司，批號(hào)：20210814)，二氯甲烷、甲醇、氨水、乙酸乙酯、冰醋酸、碘化鉀、堿式硝酸鉍鉀等試劑均為分析純，純化水為自制?；倍▔A(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110784-201706)和苦參堿(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-202010)?；倍▔A1.111 mg/mL、苦參堿1.540 mg/mL。中試三批苦豆子凝膠(批號(hào)2022092701、2022112501、2022112502)為委托銀川鳳儀堂生物工程有限公司制備，不加苦豆子總堿的空白凝膠陰性對(duì)照為寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 制劑及原料供試品的制備 分別取三批苦豆子凝膠三支，分別稱取0.2 g加甲醇25 mL溶解過濾，收集濾液，備用；稱取0.1 g苦豆子總堿加甲醇50 mL溶解過濾，收集濾液，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取槐定堿和苦參堿對(duì)照品加甲醇定容至10 mL，制備1.111 mg/mL的槐定堿和1.540 mg/mL苦參堿。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 取自制的不含苦豆子總堿空白凝膠劑，按2.1.1項(xiàng)下制制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 碘化鉍鉀試液制備 取堿式硝酸鉍鉀 0.85 g，加冰醋酸10 mL與水40 mL溶解后，加4%碘化鉀溶液5 mL，加冰醋酸20 mL，用水稀釋至100 mL，搖勻，備用。

不同臨床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率分別為44.0%、68.8%、100.0%和100.0%（圖2B）；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示（表3），臨床分期為Ⅲ和Ⅳ期患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為100.0%，明顯高于Ⅰ和Ⅱ期患者的53.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.003）。Ⅰ和Ⅱ期患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為44.0%與68.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.064）。

2.2 試驗(yàn)方法 參照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)[9]，吸取供試品溶液2～3 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3 薄層色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 展開劑的選擇 吸取苦豆子凝膠和苦豆子總堿供試品、槐定堿和苦參堿對(duì)照品溶液各2 μL分別點(diǎn)于3個(gè)同一硅膠G薄層板上，分別以A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]，B[乙酸乙酯∶乙醇∶氨水(50∶1∶0.5)]，C[三氯甲烷∶甲醇∶石油醚∶氨水(50∶5∶1∶1)]為展開劑，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果顯示，A與C作為展開劑，凝膠和苦豆子總堿供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，效果最佳。B展開效果欠佳。由于三氯甲烷的毒性較大，考慮安全環(huán)保。故選用A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]作為展開劑。結(jié)果如圖1。

1 2 3 41 2 3 41 2 3 41.槐定堿；2.苦豆子總堿供試品；3.苦豆子凝膠供試品；4.苦參堿圖1 不同展開劑考察結(jié)果圖

2.3.2 供試品制備方法的考察 分別按照以下4種方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。①稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入純化水超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液1。②稱取苦豆子凝膠0.2 g，5滴10%CaCl2，搖勻后加入純化水超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液2。③稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入甲醇超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液3。④稱取苦豆子凝膠0.2 g，加入5滴10%CaCl2，搖勻后加入甲醇超聲溶解，定容至25 mL，濾過，得供試品溶液4。結(jié)果表明∶ 4種方法制備的供試品溶液主斑點(diǎn)與對(duì)照品溶液斑點(diǎn)的顏色、位置相同，均有較好的分離度。故供試品溶液制備方法選擇簡單、易操作的第3種。如圖2所示。

1 2 3 4 41 2 5 61.槐定堿；2.苦參堿；3.供試品1；4.供試品2；5.供試品3；6.供試品4圖2 不同供試品制備方法的考察結(jié)果圖

2.3.3 不同點(diǎn)樣量的選擇 選用硅膠G薄層板，取樣品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL分別點(diǎn)樣，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果顯示：對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)樣量在1～6 μL范圍內(nèi)，均能分離，各斑點(diǎn)清晰，其中1～3 μL分離度較好，考慮不同制劑含量差異，故選擇點(diǎn)樣量為2～3 μL。結(jié)果如圖3所示。

1 2 3 4 5 61.對(duì)照品(下是槐定堿、上是苦參堿)；2～6分別為1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL圖3 不同點(diǎn)樣量的考察結(jié)果圖

2.4 苦豆子凝膠薄層色譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性考察 分別吸取2批次的苦豆子凝膠供試品溶液、苦豆子總堿溶液、陰性對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液各3 μL分別點(diǎn)與同一硅膠G薄層板上，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。供試品、苦豆子總堿與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好。而陰性樣品溶液無干擾。說明該薄層色譜鑒別方法專屬性強(qiáng)。結(jié)果如圖4所示。

1 2 3 4 51.混合對(duì)照品(上為苦參堿、下為槐定堿)；2.苦豆子凝膠(批號(hào)22092701)；3.苦豆子凝膠(批號(hào)22112501)；4.苦豆子總堿；5.陰性對(duì)照溶液圖4 苦豆子凝膠薄層色譜鑒別的專屬性考察結(jié)果圖

2.4.2 薄層色譜方法耐用性考察

2.4.2.1 不同廠家硅膠G薄層板的考察 分別在3個(gè)不同生產(chǎn)廠家硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司、煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司)點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果在3個(gè)不同品牌的硅膠G薄層預(yù)制板上，樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。表明不同廠家生產(chǎn)硅膠G薄層板對(duì)薄層色譜鑒別方法無明顯影響。結(jié)果如圖5所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 5A.青島海洋；B.煙臺(tái)江友；C.青島勝海；1.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號(hào)22092701)；4.苦豆子凝膠(批號(hào)22112501)；5.苦豆子凝膠(批號(hào)22112502)圖5 不同廠家硅膠G板薄層色譜圖

2.4.2.2 不同溫度的考察 在同一廠家薄層硅膠G板上點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，在10 ℃、20 ℃、35 ℃ 3個(gè)不同溫度下，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果展開樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好。表明不同溫度的對(duì)薄層鑒別無影響。結(jié)果如圖6所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號(hào)22092701)；4.苦豆子凝膠(批號(hào)22112501)；5.苦豆子凝膠(批號(hào)22112502)圖6 不同溫度的薄層色譜圖

2.4.2.3 不同濕度的考察 在同一廠家薄層硅膠G板上點(diǎn)樣3個(gè)批次供試品及槐定堿和苦參堿對(duì)照品，在32%、58%、88% 3個(gè)不同濕度下，按2.2項(xiàng)下方法考察其對(duì)薄層色譜的影響。結(jié)果展開樣品色譜中在與槐定堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。表明不同濕度對(duì)薄層色譜鑒別方法基本無影響。結(jié)果如圖7所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定堿；2.苦參堿；3.苦豆子凝膠(批號(hào)22092701)；4.苦豆子凝膠(批號(hào)22112501)；5.苦豆子凝膠(批號(hào)22112502)圖7 不同濕度的薄層色譜圖

3 討論

本研究建立苦豆子凝膠薄層鑒別方法，確定以槐定堿和苦參堿為對(duì)照品，以甲醇為溶劑制備供試品溶液，點(diǎn)樣量2～3 μL，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水=50∶6∶1為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視。

苦豆子凝膠劑作為新開發(fā)的用于防治痤瘡的制劑，其主要有效成分為槐定堿和苦參堿，且兩者的含量最高，故薄層色譜鑒別選擇槐定堿和苦參堿為對(duì)照品[14]。薄層色譜鑒別是中藥制劑鑒別的主要方法之一，因其設(shè)備簡單、操作方便而被廣泛應(yīng)用[15]，但易受供試品制備方法、點(diǎn)樣量，展開劑等相關(guān)條件影響[16-17]。因此，本研究優(yōu)化了上述條件，確定了供試品制備用甲醇溶解，點(diǎn)樣量為2～3 μL。由于三氯甲烷毒性較大，考慮實(shí)驗(yàn)人員的安全性和環(huán)保問題[18-19]，改用二氯甲烷，并進(jìn)行了展開劑比例的優(yōu)化調(diào)整，最終以二氯甲烷：甲醇：氨水(50∶6∶1)為展開劑，薄層色譜分離效果最好，且低毒安全，這也符合目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的基本要求[20]。作者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)樣后薄層板再展開之前必須進(jìn)行充分飽和，至少30 min，防止薄層色譜圖產(chǎn)生邊緣效應(yīng)?？赡艿脑蚴浅浞诛柡秃?，使展開缸中的展開劑氣、液、固三相比例適當(dāng)，斑點(diǎn)分離度較好[21]。

為了考察方法的專屬性和耐用性，分別考察了陰性對(duì)照溶液、不同溫度、不同濕度、不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板等對(duì)所建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別方法的影響。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照、不同溫濕度和不同廠家薄層板的3批苦豆子凝膠供試品的色譜圖均與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度好，效果佳，陰性無干擾。

本研究建立的苦豆子凝膠薄層色譜鑒別法操作簡便可行、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，所用試劑安全環(huán)保，是控制苦豆子凝膠制備工藝、產(chǎn)品質(zhì)量的快速檢測方法，為制定苦豆子凝膠劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。