響應(yīng)面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝

張文霞 康亞男

山東省德州市陵城區(qū)中醫(yī)院，山東 德州 253500

覆盆子又名樹倭泡、樹莓、掌葉覆盆子，為薔薇科植物華東覆盆子(RubuschingiiHu)的干燥果實(shí)[1]，一般在夏初果實(shí)由綠變綠黃時(shí)采收。覆盆子收載于2020版《中國藥典》，味甘、酸，性溫，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目功效，主要防治陽痿早泄、遺尿尿頻、遺精滑精、目暗昏花[2]。覆盆子含有黃酮、酚酸、萜類等成分[3-4]，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等作用[5-7]，其藥用既有生品，也有鹽制品。據(jù)報(bào)道[8-9]，鞣花酸具有改善腎小管損傷及腎纖維化活性作用，覆盆子鹽炙后補(bǔ)腎固澀作用顯著增強(qiáng)，可能與鹽炙后鞣花酸含量顯著升高有關(guān)。目前，對(duì)鹽炙品中鞣花酸的提取工藝研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以鞣花酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝，以期為鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030C3D Plus高效液相色譜儀(島津公司)；Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(安捷倫科技有限公司)；DF110電子天平(佑科儀器儀表公司)。

1.2 材料 鞣花酸(批號(hào)：111959-201708)購自中國藥品生物制品檢定所；覆盆子購于江西(批號(hào)20200426)，經(jīng)本院藥劑科康亞男主管藥師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽覆盆子中鞣花酸的含量測定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鞣花酸對(duì)照品10.50 mg，置50 mL容量瓶中，加73%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為 0.21 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定鹽覆盆子粉末(過四號(hào)篩)1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入73%甲醇60 mL，稱定重量，回流提取63 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液(15：85)為流動(dòng)相；流速1.0 mL·min-1；柱溫 30 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖如圖1。

A.對(duì)照品；B.供試品圖1 HPLC色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL的容量瓶中，加入73%甲醇定容至刻度。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測定分析，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X計(jì)算回歸方程，得回歸方程Y=2.436X+0.023(r=0.9996)，表明在質(zhì)量濃度0.0021～0.21 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果鞣花酸峰面積RSD為1.41%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取鹽覆盆子供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 內(nèi)進(jìn)樣分析，結(jié)果鞣花酸峰面積RSD為1.83%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取鹽覆盆子，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果鞣花酸平均含量為0.349%，RSD為0.69%，表明所建立的方法重復(fù)性好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取鹽覆盆子0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入鞣花酸對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算回收率。結(jié)果鞣花酸平均加樣回收率為101.24%，RSD為1.68%。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化鞣花酸提取工藝

2.3.1 單因素考察 以鞣花酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)甲醇濃度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)、液料比(10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1)進(jìn)行考察。結(jié)果見圖2，由圖2可知，以70%的甲醇、回流提取60 min，50∶1液料比提取效果最佳。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比為考察因素，利用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)鞣花酸的提取條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表1和表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.3 方差分析 方程回歸分析及方差分析結(jié)果見表3。鞣花酸含量對(duì)甲醇濃度、提取時(shí)間、液料比的回歸方程為：Y=0.35+0.008A+0.009B+0.031C+0.004AB+0.016AC-0.014BC-0.028A2-0.008B2-0.023C2。結(jié)果顯示，在設(shè)定的區(qū)域內(nèi)，所建立的模型達(dá)到極顯著水平(P<0.0001)，其中二次項(xiàng)中A2和C2的P值均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，表明方程擬合較好。

表3 方差分析結(jié)果

2.3.4 響應(yīng)面分析 應(yīng)用 Design-Expert 9.0.4 軟件繪制出所考察指標(biāo)與影響較顯著的3個(gè)自變量的等高線圖，具體如圖3所示。結(jié)果最佳提取工藝為：甲醇濃度73.32%、提取時(shí)間62.87 min、液料比58.76∶1，預(yù)測鞣花酸含量為0.355%。

圖3 不同因素間的響應(yīng)曲面圖

2.2.5 試驗(yàn)驗(yàn)證 考慮到實(shí)際操作的方便可行性，將條件修正為：甲醇濃度73%、提取時(shí)間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，與預(yù)測值無顯著差異，表明方程與實(shí)際情況擬合良好。

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇 研究顯示，鞣花酸藥理作用廣泛，既有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)菌生長等活性，還具有改善腎小管損傷及腎纖維化作用，是覆盆子鹽炙后補(bǔ)腎固澀作用增強(qiáng)的主要相關(guān)活性成分[8-9]。因此，本試驗(yàn)選擇鞣花酸為目標(biāo)成分進(jìn)行工藝優(yōu)化。

3.2 優(yōu)化方法的選擇 響應(yīng)面法是一種通過回歸方程來擬合各因素水平與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，可精準(zhǔn)預(yù)測任一條件組合下的響應(yīng)值并直觀地看出函數(shù)關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化[10]。因此，本試驗(yàn)選擇響應(yīng)面法優(yōu)選鹽覆盆子有效成分鞣花酸的提取工藝。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸水、甲醇-酸水等不同液相條件，結(jié)果顯示，以乙腈-0.2%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)，鞣花酸的峰形及分離度最好，這可能和鞣花酸是多酚二內(nèi)酯結(jié)構(gòu)有關(guān)，加入酸水可抑制其水解，從而改善峰形、增加分離度。

綜上，鞣花酸是覆盆子鹽制后補(bǔ)腎固澀作用增強(qiáng)的主要活性化合物。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的鹽覆盆子中鞣花酸最佳提取工藝為：甲醇濃度73%、提取時(shí)間63 min、液料比60∶1，此條件下鞣花酸含量為0.353%，所建立的方法可為鹽覆盆子有效成分的提取工藝研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供依據(jù)。