正交試驗(yàn)優(yōu)化消乳增生軟膏的提取工藝研究

羅 川 皮鳳娟 張慶蓮 許 曾 張盛敏

四川省瀘州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 510500

乳腺增生為常見乳腺疾病，又稱“乳腺結(jié)構(gòu)不良”“纖維囊性乳腺病”，屬病理性增生，主要表現(xiàn)為正常乳腺小葉的生理性增生與復(fù)舊不全及乳腺正常結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂[1]。其主要臨床表現(xiàn)為乳房腫塊和脹痛，是一種既非炎癥又非腫瘤的增生性病變[2]，其發(fā)病率占乳腺疾病的首位[3]。消乳增生軟膏為我院協(xié)定處方，原方為散劑，用水調(diào)勻后直接外敷于痛處，起到軟堅(jiān)散結(jié)，活血止痛的效果。本方用藥精煉，但各中藥成分藥效有所差異，因此在對(duì)本復(fù)方的提取工藝研究中不能只以單味藥材的提取工藝作為參照，而應(yīng)考慮本復(fù)方的整體性。本文根據(jù)中藥復(fù)方的整體性，在保留傳統(tǒng)中藥散劑特點(diǎn)的基礎(chǔ)上[4]，分別以有效成分陳皮和芥子中的橙皮苷[5]、芥子硫氰酸鹽含量及干浸膏得率為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)法和正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究，為以后開發(fā)成院內(nèi)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器 FA2004萬分之一電子天平(上海安亭電子儀器廠)，GZX-GF101-3BS-Ⅱ/H電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，CQ-250A-DST超聲清洗儀(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)，ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 材料 芥子硫氰酸鹽對(duì)照品(批號(hào)111702-202107，含量以100%計(jì))、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-202019，含量以95.3%計(jì))均購自中國食品藥品檢定研究院；陳皮(批號(hào)210700791)、芥子(批號(hào)190700581)、肉桂(批號(hào)210701091)等均由成都市康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司提供，山奈(批號(hào)200924-1)和穿破石(批號(hào)190910-1)由瀘州百草堂中藥飲片有限公司提供，胡椒(批號(hào)20070103)由四川國強(qiáng)中藥飲片有限公司提供。上述試藥經(jīng)檢驗(yàn)均為真品，所使用的試劑等級(jí)：乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 吸水率考察 按照處方量稱取藥材共96 g，加入1000 mL水浸泡，分別在10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min測定濾液體積。吸水率=(1000-濾液體積)/1000。測定該處方吸水率為11%。

2.1.2 加水量考察 按照處方量的兩倍準(zhǔn)確稱量藥材(丁香、陳皮、肉桂等)3份，固定浸泡時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為1次，加水量依次為6倍、8倍、10倍，提取7 h，并記錄每小時(shí)揮發(fā)油的體積，揮發(fā)油總體積分別為3.4 mL、2.9 mL、2.5 mL。結(jié)果表明：在加水量為6倍時(shí)所提取到的揮發(fā)油較多。故選擇加水量為6倍。結(jié)果如圖1所示。

圖1 加水量對(duì)揮發(fā)油提取體積的影響圖

2.1.3 浸泡時(shí)間考察 準(zhǔn)確稱量兩倍處方量的藥材(肉桂、陳皮、丁香等)3份，固定提取次數(shù)為一次，加水量為6倍[6]，浸泡時(shí)間分別為1 h[7]、1.5 h，提取7 h，并記錄每小時(shí)揮發(fā)油的體積，揮發(fā)油總體積分別為3 mL、2.8 mL。綜合2.1.1浸泡30 min的結(jié)果，表明：在浸泡時(shí)間為30 min時(shí)所得揮發(fā)油較多，故選擇浸泡時(shí)間為30 min。結(jié)果如圖2所示。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取體積的影響圖

2.1.4 提取時(shí)間考察 結(jié)合2.1.1和2.1.2兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，在提取時(shí)間超過5 h后，揮發(fā)油體積增長緩慢，考慮到生產(chǎn)成本等因素，故選擇最佳提取時(shí)間為5 h。結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取體積的影響圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX-SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：1 mL/L乙腈∶含0.1%磷酸的0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液(20 ∶80)。柱溫：30 ℃。檢測波長0～7 min ∶326 nm。7～15 min ∶283 nm；流速：1 mL/ min[8-10]。進(jìn)樣量10 μL。

A.橙皮苷對(duì)照品溶液；B.芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；D.缺芥子陰性對(duì)照品溶液；E.缺陳皮陰性對(duì)照品溶液圖4 專屬性考察高效液相色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液的制備：取芥子硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加不含0.1%磷酸的流動(dòng)相制成每1 mL含0.22 mg的對(duì)照品貯備液[11]，精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，用不含0.1%磷酸的流動(dòng)相稀釋并定容，即得；橙皮苷對(duì)照品溶液的制備：取適量橙皮苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.52 mg的對(duì)照品貯備液，精密量取對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得。

芥子陰性對(duì)照品溶液的制備：除去芥子以外的其他藥材，按優(yōu)選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。陳皮陰性對(duì)照品溶液的制備：取除去陳皮以外的其他藥材，按優(yōu)選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取正交實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下制備的溶液5 mL，共9份，置于具塞錐形瓶中，水浴蒸干后加入甲醇10 mL，精密稱定，超聲 45 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得[11]。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取2.2.2項(xiàng)下的芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液、橙皮苷對(duì)照品溶液、缺芥子陰性對(duì)照品溶液、缺陳皮陰性對(duì)照品溶液和2.2.3項(xiàng)下的供試品溶液，各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件檢測。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在相同的保留時(shí)間均有出峰，陰性對(duì)照無干擾，如圖4。說明該測定方法專屬性強(qiáng)，無干擾。

2.2.4.2 線性范圍考察 精密量取2.2.2項(xiàng)下的芥子硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液和橙皮苷對(duì)照品貯備液各1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分別置于10 mL容量瓶中，芥子硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液用不含0.1%磷酸的流動(dòng)相，橙皮苷照品貯備液用甲醇稀釋并定容，按2.4.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，得回歸方程分別為：y1=614.14x-49.4，r=0.9999(n=8)，y2=974.1x-28.711，r=0.9999(n=8)。結(jié)果表明：芥子硫氰酸鹽在0.22～1.76 μg內(nèi)，橙皮苷在0.52～4.16 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.2項(xiàng)下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液，分別重復(fù)測定6次，結(jié)果芥子硫氰酸鹽、橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.69%，0.72%，表明該方法精密度良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.2項(xiàng)下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD分別為0.56%，0.78%，結(jié)果表明芥子硫氰酸鹽和橙皮苷對(duì)照品均在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液的RSD值分別1.2%和1.1%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知芥子硫氰酸鹽和橙皮苷含量的樣品2.5 mL，分別取6份，置于具塞錐形瓶中，每份均精密加入濃度為0.5180 mg/mL橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，濃度為0.2208 mg/mL芥子硫氰酸鹽對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件平行操作測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD<3.0%，說明加樣回收率好。

2.2.5 品的含量測定 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和2.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量。

2.3 干浸膏得率的測定 精密量取正交項(xiàng)下制備的提取液每個(gè)25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，再置于105 ℃烘箱中恒重，計(jì)算干浸膏得率[12]。

2.4 正交實(shí)驗(yàn) 考慮本次試驗(yàn)是采用水做溶劑，因此選擇加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為正交實(shí)驗(yàn)的考察因素，將干浸膏得率和藥液中的芥子硫氰酸鹽含量、橙皮苷含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，應(yīng)用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素與水平表見下表1。按照L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，準(zhǔn)確稱取處方量藥材 (陳皮、丁香、肉桂等)，共9份，編為1～9號(hào)。 先按照單因素試驗(yàn)的最佳提取條件，進(jìn)行揮發(fā)油提取，將提取好揮發(fā)油的藥材棄去藥液，留下藥渣待用，向上述藥渣中加入處方中余下藥材，按照表1因素加水進(jìn)行提取，將提取液過濾、冷卻和定容。結(jié)果見表2。

表1 提取工藝的因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5 多指標(biāo)評(píng)分方法建立 實(shí)驗(yàn)以芥子硫氰酸鹽和橙皮苷的含量及干浸膏得率作為權(quán)重系數(shù)依據(jù)，將芥子硫氰酸鹽和橙皮苷的含量權(quán)重系數(shù)分別設(shè)置為0.3，將干浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4。綜合評(píng)分=(各組芥子硫氰酸鹽含量/芥子硫氰酸鹽最高含量×0.3×100)+(各組橙皮苷含量/橙皮苷最高含量×0.3×100)+(各組干浸膏得率/干浸膏最高得率×0.4×100)。

2.6 方差分析結(jié)果 由方差結(jié)果分析可知，各因素影響芥子中芥子硫氰酸鹽及陳皮中橙皮苷提取量的排序B>C>A。結(jié)果表明，加水量A對(duì)橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量和干浸膏得率影響不顯著 (P>0.05)，但提取次數(shù)B和提取時(shí)間C對(duì)橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量和干浸膏得率影響均具有顯著性 (P<0.01)。因此確定最佳提取工藝條件為A1B2C1，即加6倍量水，煎煮2次，每次15 min。結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由于正交實(shí)驗(yàn)中篩選的最佳條件為6倍加水量，提取兩次，每次15 min，做1組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。考慮到本次試驗(yàn)提取時(shí)間短，且提取次數(shù)無顯著性影響，因此在考察提取時(shí)間1 h和1.5 h，從驗(yàn)證結(jié)果來看，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)含量較高，1 h次之，15 min含量最少，但提取1.5 h的比提取1 h的時(shí)間成本高，且多出的有效成分有限，為減少資源浪費(fèi)，最終選擇的最佳提取工藝條件為：加水量6倍，提取2次，每次1 h。結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在此次提取工藝研究實(shí)驗(yàn)中，因需考察兩個(gè)有效成分的含量，故選用合適的高效液相色譜條件比較重要，最初采用的流動(dòng)相條件為乙腈：0.08 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(10∶90)，在此條件下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品的保留時(shí)間長，且存在拖尾現(xiàn)象。后將流動(dòng)相比例調(diào)整為20∶80，保留時(shí)間合適，但也存在拖尾現(xiàn)象，因此向流動(dòng)相中加入0.3%的三乙胺溶液，拖尾現(xiàn)象也未解決。查閱資料后，因芥子硫氰酸鹽顯酸性，故向流動(dòng)相中加入0.1%的磷酸調(diào)整PH，拖尾現(xiàn)象得以解決。也曾考察不同的色譜柱[ZORBAX-SB-C18柱，Speax Bio-C18柱，Eclipse XDB-C18柱，Speax MS-C18柱]，對(duì)峰型和分離度的影響，結(jié)果顯示ZORBAX-SB-C18柱的峰型和分離度最好。研究所確定的色譜條件，可為后續(xù)含芥子和陳皮的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

從單因素結(jié)果來看，當(dāng)加水量在6倍時(shí)，所得的揮發(fā)油含量較高，表明在相同時(shí)間內(nèi)，6倍加水量的揮發(fā)油提取效率最高。此外，在浸泡時(shí)間考察中，浸泡30 min即達(dá)到揮發(fā)油提取的最大值。提取時(shí)間在4～6 h之間呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，在6h時(shí)達(dá)到峰值，但在提取時(shí)間超過5 h后，揮發(fā)油體積增長緩慢，考慮到生產(chǎn)成本等因素，故選擇最佳提取時(shí)間為5 h。由上述結(jié)果可以看出，該處方中所含的揮發(fā)油易于提取，適合大生產(chǎn)。

消乳增生軟膏為我院協(xié)定處方，具有軟堅(jiān)散結(jié)，活血止痛的效果，原方為散劑，存在劑量不準(zhǔn)確，難保存且患者依從性低的缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式對(duì)消乳增生軟膏的提取工藝進(jìn)行研究，確定了消乳增生軟膏的最佳提取工藝，提高了有效成分含量，從驗(yàn)證結(jié)果來看，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)含量較高，1 h次之，15 min含量最少，但提取1.5 h的比提取1 h的時(shí)間成本高，且多出的有效成分有限，為減少資源浪費(fèi)，最終選擇的最佳提取工藝條件為：加水量6倍，提取2次，每次1 h。但本次試驗(yàn)提取方法單一，下一步打算驗(yàn)證其不同提取方法下有效成分的含量變化。