多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝

湯泮泮 葉興蓉 陸雪萍 李 龍 謝佳穎 馮莉萍 陳 旭 任 萍 陸禮和

云南省藥物研究所云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 651000

草烏甲素是從天然植物中提取分離純化得到的生物堿，具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)作用，臨床用于治療風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎等[1]，與非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥相比，草烏甲素的安全性較好[2-3]。從2005版、2010版、2015版、2020版《中國(guó)藥典》二部均收載了草烏甲素原料及其制劑[4-7]，隨著草烏甲素制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，草烏甲素市場(chǎng)需求較旺盛，作為草烏甲素提取用原料藥材需求量也不斷增加。

目前草烏甲素只能從烏頭屬植物中分離得到，如滇西烏頭(AconitumbulleyanummDiels)、粗莖烏頭(AconitumcrassicauleW.T.Wang)[8]、長(zhǎng)緣烏頭(AconitummgeorgeiComber)[9]和直緣烏頭(AconitumtranssectumDiels)[10]等，其中直緣烏頭主要為工業(yè)生產(chǎn)草烏甲素的原料[11]。沈勇等[12-14]采用甲醇滲漉，張紅彬[15]采用堿浸泡和石油醚回流提取，付彬彬[16]采用閃式提取草烏甲素，提取過程中堿性溶劑、有毒有害試劑回收利用較難把控，限制了工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用HPLC法建立了乙醇滲漉液中草烏甲素含量測(cè)定方法[17-18]，以草烏甲素轉(zhuǎn)移率和干膏率作為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)[19]優(yōu)化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝，為后續(xù)草烏甲素純化研究提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒有限公司)；ME204/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SK-8200HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 草烏甲素對(duì)照品(批號(hào)：100530-202103，含量以99.2%計(jì))購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙醇為食品級(jí)，三乙胺、磷酸、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，純凈水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備，其余試劑為分析純。

直緣烏頭藥材(購(gòu)于云南玉龍縣)，經(jīng)云南省藥物研究所正高級(jí)工程師蘇鈦鑒定為毛茛科直緣烏頭AconitumtranssectumDiels的干燥根，草烏甲素含量為0.18%(根據(jù)文獻(xiàn)[11]自測(cè))，批號(hào)：2020414。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液制備 取試驗(yàn)工藝中的滲漉液1 mL，加相應(yīng)70%乙醇，并定容至10 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取草烏甲素對(duì)照品10 mg，置于50 mL量瓶中，80%乙醇溶解定容至刻度，搖勻，分別精密吸取4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL于10 mL量瓶中，80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得(每1 mL分別含0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg、0.14 mg、0.16 mg草烏甲素)。

A 對(duì)照品 B.供試品1 草烏甲素圖1 草烏甲素HPLC色譜圖

2.2 指標(biāo)成分的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Ecosil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；0.2%三乙胺水溶液[用磷酸調(diào)節(jié)pH值(3.1±0.1)]-乙腈(60∶40)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=13751X+19.1(R2=0.9995)，在0.08～0.16 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

教育資源是指為教學(xué)有效開展提供的各種可被利用的條件，通常包括教材、案例、影視、圖片、課件等，也包括教師資源、教具、基礎(chǔ)設(shè)施及相關(guān)教育政策等內(nèi)容。通俗來講，是指一切可以幫助學(xué)生達(dá)成學(xué)習(xí)目標(biāo)的物化了的、顯性或隱性的、可以為學(xué)生學(xué)習(xí)服務(wù)的教學(xué)組成要素。

2.2.3 精密度考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下草烏甲素對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積的RSD值為2.1%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其峰面積RSD值為2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量RSD值為2.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量同一批滲漉液，平行取樣6次，每份1 mL，精密加入等量草烏甲素對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算草烏甲素的平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.7%。

2.3 干膏的測(cè)定 精密量取25 mL滲漉液至干燥恒重的蒸發(fā)皿，80 ℃水浴蒸干。常壓105 ℃干燥至恒重，置干燥器冷卻30 min，迅速稱定重量，計(jì)算干膏重量。

2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 草烏甲素轉(zhuǎn)移率越高，提取效果越好，可作為考察提取效果的主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為 0.6，同時(shí)，干膏得率越小，說明雜質(zhì)少，干膏得率可作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為 0.4，因此以干膏得率和草烏甲素轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)滲漉工藝進(jìn)行綜合評(píng)分[11-12]。

干膏得率=滲漉液總體積×干膏重量/(取樣體積×原藥材重量)

滲漉綜合評(píng)分=干膏得率/最大干膏得率×40+草烏甲素轉(zhuǎn)移率/最大草烏甲素轉(zhuǎn)移率×60

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 粉碎度考察 取藥材適量，粉碎，分別過4 mm、10 mm、24 mm、50 mm目篩各20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝柱，加入5倍量80%乙醇，滲漉流速1 mL/min，浸泡時(shí)間16 h，搖勻，直接取滲漉液0.45 μm微孔濾膜過濾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粉碎度10目篩時(shí)草烏甲素含有量最高及耗時(shí)較短，故選擇其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量一定乙醇濃度濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，裝柱，加入5倍量相應(yīng)乙醇濃度進(jìn)行滲漉，滲漉流速1 mL/min，考察50%、65%、80%、95%乙醇濃度對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表1，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綜合評(píng)分先升高再降低，80%乙醇時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，選乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%乙醇作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)滲漉效果的影響

2.5.3 浸泡時(shí)間 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝柱，加入5倍量相應(yīng)乙醇濃度進(jìn)行滲漉，滲漉流速1 mL/min，考察浸泡時(shí)間4 h、8 h、16 h、24 h對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表2，浸泡時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著浸泡時(shí)間的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，浸泡時(shí)間16 h時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故固定浸泡時(shí)間為8 h、16 h、24 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

表2 浸泡時(shí)間對(duì)滲漉效果的影響

2.5.4 乙醇用量 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，裝柱，滲漉流速1 mL/min，考察乙醇用量5倍、7倍、9倍、12倍、17倍對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表3，乙醇用量對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著乙醇用量的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，乙醇用量15倍時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故固定乙醇用量為10倍、15倍、20倍作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

表3 乙醇用量對(duì)滲漉效果的影響

表4 滲漉流速對(duì)滲漉效果的影響

2.5.5 滲漉流速 取藥材粉碎過10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，加入12倍80%乙醇進(jìn)行滲漉，考察滲漉流速0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表3，滲漉流速對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著滲漉流速的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，滲漉流速1 mL/min時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故滲漉流速為1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min 作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取藥材粉碎過10目篩20 g，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、乙醇用量(B)、滲漉流速 (C)、浸泡時(shí)間 (D)為影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表5。

表5 因素水平

表6 滲漉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 (n=2)

即各因素最優(yōu)水平分別為A1、B2、C2、D2。方差分析(表7)結(jié)果顯示，因素A的F值為26.168，大于F0.05(2，2)=19.00，說明A(乙醇體積分?jǐn)?shù))對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著性影響(P<0.05)，結(jié)合直觀分析顯示的A1水平較好，因此A因素選取A1水平，即滲漉提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。而B(乙醇用量)的F值為0.510、C(滲漉流速)F值為0.353均小于F0.05(2，2)=19.00，表明B和C因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無顯著性影響(P>0.05)。正交試驗(yàn)結(jié)果中綜合評(píng)分顯示，滲漉工藝為A1B2C2D2的評(píng)分最高，A因素為A1水平，與方差分析結(jié)果一致；B、C、D因素為 B2、C2、D2均取各水平的中間值，從滲漉效率和節(jié)約溶劑角度考慮也較為合理。綜上，通過正交試驗(yàn)初步選擇滲漉工藝條件為A1B1C2D2，即70%乙醇(3倍藥材量)浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉(7倍藥材量)，滲漉流速2 mL/min。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.7 滲漉工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取藥材粉碎過10目篩20 g，平行3份，加入70%乙醇(3倍藥材量)浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉(7倍藥材量)，滲漉流速2 mL/min，計(jì)算草烏甲素轉(zhuǎn)移率和干膏得率，結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，草烏甲素平均轉(zhuǎn)移率為97.94%，RSD為0.66%；干膏平均得率為45.73%，RSD為 0.72%；平均綜合評(píng)分值為97.94%；結(jié)果表明，3次試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)綜合評(píng)分96%～97%之間，RSD值為0.66%，表明該提取工藝參數(shù) A1B1C2D2穩(wěn)定、科學(xué)、可行。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

3 討論

草烏甲素在臨床上廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求較旺盛，提升草烏甲素的提取效率，是一項(xiàng)重要的研究工作。預(yù)實(shí)驗(yàn)曾對(duì)滲漉法和回流法提取進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲漉法的草烏甲素轉(zhuǎn)移率高，故選擇滲漉法。本文先對(duì)滲漉提取中粉碎度、浸泡時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、流速進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉流速、浸泡時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。在粉碎粒度考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)過細(xì)時(shí)，未能達(dá)到滲漉提取效果，耗時(shí)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移率較低，故直緣烏頭在滲漉提取過程中不宜粉碎過細(xì)，避免滲漉過程中發(fā)生堵塞柱筒現(xiàn)象，影響滲漉效果。最終，采用最佳滲漉工藝為最粗粉加70%乙醇(3倍藥材量)浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉(7倍藥材量)，滲漉流速2 mL/min進(jìn)行提取，耗時(shí)短，綜合評(píng)分較高。該方法簡(jiǎn)便穩(wěn)定、重復(fù)性好，為草烏甲素的進(jìn)一步分離純化與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。