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    滸苔多糖降解菌的篩選及其產(chǎn)物對黃豆種子萌發(fā)及生長的影響

    2023-12-07 15:31:20任召珍叢懿潔于佳弘張玲俐
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年22期
    關(guān)鍵詞:芽長黃豆培養(yǎng)液

    耿 建,任召珍,叢懿潔,于佳弘,張玲俐

    (1. 威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東 威海 264300;2. 海洋經(jīng)濟(jì)藻類開發(fā)與利用工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 威海 264300)

    0 引言

    全球氣溫上升、海水富營養(yǎng)化,導(dǎo)致滸苔在溫度合適時(shí)迅速生長繁殖。2007 年以來,中國黃海連續(xù)15 年暴發(fā)以滸苔為肇事藻種的綠潮災(zāi)害,對該海域和沿岸地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、濱海景觀、旅游和海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響。滸苔是歸屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬的一種大型藻類,滸苔在全球范圍內(nèi)有20 余亞種,分布較為廣泛。研究表明,滸苔細(xì)胞壁的主要成分是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的滸苔多糖[1],滸苔多糖作為滸苔的主要活性成分,具有多種生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等,但是由于分子量比較大,滸苔多糖具有溶解性差、生物利用率低等缺陷,極大地限制了滸苔多糖資源的高值化開發(fā)和利用。滸苔多糖的化學(xué)組成較為復(fù)雜,齊曉輝[2]研究了來源于緣管滸苔、青島綠潮滸苔及廈門條滸苔的滸苔多糖的化學(xué)組成。研究發(fā)現(xiàn),綠潮滸苔多糖主要由鼠李糖構(gòu)成,含有少量的半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸;廈門條滸苔多糖則主要由阿拉伯糖和半乳糖組成;此外,還含有少量的鼠李糖和微量的巖藻糖、木糖、甘露糖和葡萄糖等成分;青島綠潮滸苔多糖則主要由鼠李糖組成,含有少量的葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和甘露糖[3-5]。試驗(yàn)所用滸苔取自青島綠潮滸苔,從滸苔的附生菌中篩選出能夠高效降解滸苔多糖的菌株,研究了滸苔降解產(chǎn)物對黃豆種子萌發(fā)及生長的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 材料來源

    滸苔,采自山東乳山銀灘區(qū)域;黃豆,普通市售黃豆種子。

    1.1.2 培養(yǎng)基制備

    (1) 富集培養(yǎng)基(g/100 mL)。滸苔10 g,硫酸銨0.5 g,氯化鈉1.5 g,維氏鹽溶液5 mL,pH 值7.0~7.5。(維氏鹽溶液:K2HPO4·3H2O 6.50 g,Mg-SO4·7H2O 2.50 g,NaCl 2.50 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g,MnSO4·H2O 0.04 g,蒸餾水1 000 mL。)

    (2) 分離培養(yǎng)基(g/100 mL)。蛋白胨0.5 g,酵母粉0.1 g,硫酸銨0.5 g,氯化鈉1.5 g,維氏鹽溶液5 mL,瓊脂1.5 g,pH 值7.0~7.5。

    (3) 篩選培養(yǎng)基(g/100 mL)。滸苔多糖1.5 g,硫酸銨0.5 g,氯化鈉1.5 g,維氏鹽溶液5 mL,瓊脂1.5 g,pH 值7.0~7.5。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 滸苔多糖提取

    準(zhǔn)確稱取100 g 干燥的滸苔進(jìn)行超微粉碎過篩,加入1 L 體積比1∶1 的二氯甲烷和丙酮混合溶液,抽濾后于65 ℃下干燥,使用3 L 蒸餾水熱水提取7 h,離心,取上清液。加入蛋白酶K 于37 ℃條件下反應(yīng)24 h,100 ℃下煮10 min,離心,取上清液。向上清液中加入 4 倍體積的95%的乙醇,置于4 ℃冰箱冷藏。將沉淀的滸苔多糖用丙酮洗滌,使用乙醇洗滌,最后進(jìn)行烘干,研磨。

    1.2.2 菌株篩選

    (1) 滸苔降解菌株富集。稱取10 g 新鮮滸苔,置于裝有90 mL 富集培養(yǎng)基的三角燒瓶中,于30 ℃條件下以轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng),觀察培養(yǎng)液渾濁度及滸苔降解情況,培養(yǎng)3 d 后取10 mL 培養(yǎng)液于新的富集培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至渾濁。

    (2) 菌株分離與篩選。將富集后的菌液梯度稀釋后涂布與分離培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48 h。選取菌落形態(tài)不同的菌進(jìn)行純化后點(diǎn)種與篩選培養(yǎng)基中,于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h。利用高碘酸透明圈法篩選滸苔多糖降解菌。

    1.2.3 菌株鑒定

    (1) 形態(tài)學(xué)鑒定。采用平板劃線法將菌株接種到LB 固體培養(yǎng)基中,于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài);將其進(jìn)行革蘭氏染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

    (2) 分子生物學(xué)鑒定。采用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA,采用通用引物,上游引物7F(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'),下游引物1540R(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'),以菌液DNA 為模板,進(jìn)行PCR 反應(yīng)。將上述的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收后,送至上海生工生物工程股份有限公司測序,使用NCBI 在線軟件BLAST 與已知微生物的16S rDNA 進(jìn)行相似性分析。

    1.2.4 大豆種子萌發(fā)及生長測定

    (1) 滸苔多糖降解液制備。將菌株接種于含有1.5%滸苔多糖的培養(yǎng)液中,于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h,然后用0.22 μm 濾膜過濾除菌,去除菌株菌體,得到滸苔多糖降解液。

    (2) 試驗(yàn)分組。試驗(yàn)采取隨機(jī)組設(shè)計(jì),每組30 粒種子,重復(fù)3 次,設(shè)計(jì)9 個(gè)處理。處理1:滸苔多糖發(fā)酵液原液;處理2:滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋100 倍;處理3:滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋500 倍;處理4:滸苔多糖發(fā)酵液清水稀釋1 000 倍;處理5:1.5%的滸苔多糖液;處理6:1.5%的滸苔多糖液清水稀釋100 倍;處理7:1.5%的滸苔多糖液清水稀釋500 倍;處理8:1.5%的滸苔多糖液清水稀釋1 000 倍;處理9:清水對照。

    (3) 種子生物特性測定。將種子放入清水中浸泡過夜,挑選大小相似的種子隨機(jī)分9 組,放入墊有紗布的托盤中,每天噴灑處理液2 次,48 h 后計(jì)算發(fā)芽率,5 d 后測量種子芽長及干質(zhì)量。

    1.2.5 數(shù)據(jù)處理

    采用Microsoft excel 對檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的篩選

    滸苔附生菌經(jīng)過富集后,在分離培養(yǎng)基中得到8 株不同的菌株,將其點(diǎn)種與篩選培養(yǎng)基中,只得到2 個(gè)菌株,經(jīng)過高碘酸透明圈法篩選只有1 株菌株出現(xiàn)了明顯的透明圈,且透明圈直徑超過2 cm。

    2.2 菌株鑒定

    2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

    在LB 固體培養(yǎng)基上可觀察到,菌落呈乳白色,不透明,圓形邊緣有缺刻,直徑大概1 mm,表面光滑濕潤。經(jīng)革蘭氏染色可以看出該菌株為革蘭氏陽性細(xì)菌,形態(tài)呈弧狀,單個(gè)排列。

    2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

    經(jīng)過PCR 擴(kuò)增后,菌株16SrDNA長度為1 450 bp,經(jīng)過blast 對比發(fā)現(xiàn)該菌株與Vibrio diabolicus 相似度達(dá)到99.66%,推測該菌株為Vibrio diabolicus(魔鬼弧菌)。

    2.3 滸苔多糖降解產(chǎn)物對黃豆種子萌發(fā)及生長的影響

    2.3.1 不同滸苔多糖降解液對種子萌發(fā)的影響

    滸苔多糖降解產(chǎn)物對黃豆種子發(fā)芽率的影響見圖1。

    圖1 滸苔多糖降解產(chǎn)物對黃豆種子發(fā)芽率的影響

    由圖1 可知,處理1 和處理5 其發(fā)芽率較處理9(對照組) 低8.9%,其他處理組黃豆種子發(fā)芽率與對照組比沒有顯著差別。說明高濃度滸苔多糖培養(yǎng)液不利于黃豆種子發(fā)芽,低濃度的滸苔多糖對種子發(fā)芽率影響不大。

    2.3.2 不同滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響

    滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響見圖2。

    圖2 滸苔多糖降解液對黃豆種子芽長增長的影響

    由圖2 可知,處理6 的芽長較處理9(對照組)長8.0%,處理組2 的芽長較處理9(對照組) 長4.8%。說明適宜濃度的滸苔多糖和滸苔多糖降解液均能夠促進(jìn)黃豆種子芽的生長,滸苔多糖降解后促進(jìn)作用更加明顯。

    2.3.3 不同滸苔多糖降解液對種子生長量的影響

    對種子生長量的影響見圖3。

    圖3 滸苔多糖降解液對種子生長量的影響

    由圖3 可知,處理7 的種子干質(zhì)量較處理9(對照組) 增長22.7%,處理6 的種子干質(zhì)量較處理9(對照組) 增長18.2%。處理組1~4 的種子干質(zhì)量與處理9(對照組) 差距不明顯。說明滸苔多糖不能被黃豆種子很好地利用,但被降解后的滸苔多糖能夠被黃豆種子較好地吸收利用。

    3 結(jié)論

    滸苔這一藻類資源非常豐富,滸苔中滸苔多糖的含量高達(dá)50%,滸苔多糖具有降血糖、提高免疫力、抗腫瘤等多種生物活性,由于其多糖分子量較大,滸苔多糖在應(yīng)用方面受到了極大的限制。將大分子的滸苔多糖降解為低分子量的寡糖是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前,將大分子的滸苔多糖降解為小分子的糖的方法主要有物理法、化學(xué)法、酶法?;瘜W(xué)法降解滸苔多糖,高玉杰等人[4]利用三氟乙酸(TFA)對滸苔多糖進(jìn)行降解,用于制備低分子量的滸苔多糖。有研究利用TFA 和硝酸對滸苔多糖進(jìn)行降解,并對降解的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。物理法降解滸苔多糖,由于物理法降解多糖的條件較為劇烈,可能會對寡糖的結(jié)構(gòu)造成破壞。Li Bing 等人[5]利用微波輔助的方法降解滸苔多糖,由于微波作用的非特異性,降解得到的產(chǎn)物分子量分布差異較大,從3.1 kU 到446.5 kU 均有分布。酶降解法是利用酶作為一種特殊的生物催化劑,具有較強(qiáng)的底物和產(chǎn)物專一性,可選擇性酶解特定的糖苷鍵得到特定寡聚糖,還不造成環(huán)境污染,因此尋找一種活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)的海藻多糖降解酶成為了目前滸苔利用性研究的熱點(diǎn)。試驗(yàn)從滸苔附生菌中篩選出一株能夠高效降解滸苔多糖的菌株,經(jīng)分子學(xué)鑒定推測該菌株為Vibrio diabolicus。通過不同濃度的滸苔多糖降解液處理黃豆種子發(fā)現(xiàn)適宜濃度滸苔多糖降解液對促進(jìn)黃豆種子生長有明顯作用,而對種子萌發(fā)作用不明顯。高濃度滸苔多糖培養(yǎng)液會抑制黃豆種子萌發(fā)及生長,所以在滸苔多糖降解液的應(yīng)用中應(yīng)注意濃度適宜。

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