蜜制枇杷葉炮制工藝研究

何晶晶 蔣貴瑜 駱沁羽 劉紹歡，3*

1.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學 天然藥物優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)LindL.的干燥葉[1]，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘氣、胃熱嘔逆及煩熱口渴等癥[2]。枇杷葉不同炮制方法對其功效及作用部位差異較為明顯[3]。研究發(fā)現(xiàn)，枇杷葉水提物有抗炎、祛斑等作用[4-5]，其葉浸液具有抗炎和鎮(zhèn)痛的潛力[6]。枇杷葉三萜酸能有效減輕小鼠內(nèi)臟中心性肥胖、脂異常和炎癥反應等[7]。

查閱文獻[8-10]發(fā)現(xiàn)，少見關于枇杷葉不同切制規(guī)格、不同料蜜比進行炮制工藝優(yōu)化相關研究。故本實驗從切制規(guī)格、料蜜比入手，優(yōu)化蜜炙枇杷葉最佳炮制工藝，為枇杷葉炮制品的優(yōu)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FA2204N電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；SX-10-12箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司)；UV-2700紫外分光光度計(島津儀器有限公司)；Ultimate3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)等。

1.2 材料 乙醇(純度95%，批號20200309，國藥集團化學試劑有限公司)；亞硝酸鈉(批號20150115，重慶江川化工有限公司)；硝酸鋁(批號20140421，天津市科密歐化學試劑有限公司)；蘆丁(純度≥98%，批號180604，廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司)；齊墩果酸(純度91.1%，批號110709-201808，中國食品藥品檢定研究院)；熊果酸(純度99.9%，批號110742-201823，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(批號20200924，天津市科密歐化學試劑有限公司)；甲醇(批號20201111，天津市科密歐化學試劑有限公司)等。乙腈、甲醇為色譜純，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝流程圖 如圖1所示。

圖1 炮制工藝優(yōu)化流程圖

2.2 樣品的制備 實驗用枇杷葉由筆者采集，由貴州醫(yī)科大學劉紹歡老師鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)LindL.的葉。枇杷葉采摘后，對其進行清洗，刷去絨毛，晾曬至表面水分干燥，切成2～3 mm的細絲(編號為Y0～Y7)、5～10 mm 的寬絲(編號Y10～Y17)、10～15 mm的段(編號Y20～Y27)3種規(guī)格。分別取熟蜜，加適量水稀釋，加入枇杷葉細絲/寬絲/段內(nèi)拌勻，悶潤至透，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至不粘手為度，取出晾涼；干燥粉碎后備用。見表1。

表1 枇杷葉樣品信息表

2.3 水分、灰分、浸出物測定

2.3.1 水分測定 參照2020年版《中國藥典》四部[1]水分測定法(通則0832)項下的烘干法。由表2可知：蜜炙枇杷葉水分符合2020年版《中國藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項下規(guī)定；相同料蜜比、不同切制規(guī)格中切段的水分值最高；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，水分值隨著料蜜比的增加而降低；生品水分值最高。

表2 不同炮制工藝枇杷葉水分測定結(jié)果

2.3.2 總灰分、酸不溶性灰分測定 參照2020 年版《中國藥典》第四部灰分測定法(通則2302)項下的總灰分、酸不溶性灰分測定法進行。由表3可知：結(jié)果顯示不同炮制工藝枇杷葉Y(1～4、11～13、21～24)總灰分超過《中國藥典》一部炙枇杷葉【檢查】項下限度要求，超出的原因可能與產(chǎn)地、加工方法、貯藏條件有關[11]。枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，細絲、寬絲、段的總灰分值相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，總灰分值隨著料蜜比的增加而降低；生品總灰分值最高。不同炮制工藝枇杷葉酸不溶性灰分值無明顯變化。

表3 不同炮制工藝枇杷葉總灰分、酸不溶灰分測定結(jié)果

2.3.3 浸出物測定 參照2020年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法進行操作。由表4可知：蜜炙枇杷葉醇溶性浸出物符合2020年版《中國藥典》一部炙枇杷葉【浸出物】項下規(guī)定；枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，浸出物值相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，浸出物值隨著料蜜比的增加而增加；生品浸出物值最低。

表4 不同炮制工藝枇杷葉醇溶性浸出物測定結(jié)果

2.4 UV-Vis法測定總黃酮含量

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品6.50 mg至25 mL容量瓶，加入80%乙醇制成濃度為254.8 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4.2 供試品溶液的制備 分別稱取樣品粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇15 mL，在40 ℃下提取1 h，放冷，稱重，加80%乙醇補足重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.4.3 顯色條件 分別取對照品、供試品溶液 1 mL，加入蒸餾水4 mL，搖勻，加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉4 mL，搖勻，靜置15 min，在510 nm處測定吸光度[12]。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系考察 取適量蘆丁對照品溶液于10 mL容量瓶中分別配成0 μg/mL、25.48 μg/mL、38.22 μg/mL、50.96 μg/mL、63.70 μg/mL、76.44 μg/mL 6種不同濃度，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，以蒸餾水作為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得到線性回歸方程：Y=0.0101X-0.0053，R2=0.9997。結(jié)果表明，蘆丁在0～76.44 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.4.2 精密度試驗 精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，連續(xù)測定6次，記錄吸光度并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3 重復性試驗 精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為2.39%，表明方法重復性良好。

2.4.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，分別于顯色后的0 min、10 min、20 min、30 min、40 min測定吸光度并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為2.87%，表明樣品在40 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4.5 加樣回收試驗 取已知總黃酮含量為8.7692 mg/g的藥材粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入濃度為2.1952 mg/mL蘆丁溶液1 mL，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并計算回收率。結(jié)果顯示加樣回收率均值為101.77%，RSD為1.93%，表明該方法準確度較高。

2.4.5 總黃酮含量測定 精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.4.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下的顯色條件進行顯色，測定吸光度并代入回歸方程計算總黃酮含量。由表5可知：生品總黃酮含量最高。枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，切段的總黃酮含量略高；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，總黃酮含量隨著料蜜比的增加而降低。

表5 不同炮制工藝枇杷葉總黃酮含量測定結(jié)果

2.5 HPLC法測定齊墩果酸、熊果酸含量

2.5.1 對照品溶液的制備 取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，置于同一容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度線，配置成濃度為50.47 μg/mL、206.29 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.5 g，置于150 mL錐形瓶中，加入95%乙醇25 mL，稱重，超聲30 min，再次稱重，補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，再過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.5.3 色譜條件 采用Shim-Pack GIS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-甲醇(B)-0.5%醋酸銨(C) (67∶12∶21)；流速為1 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為 23 ℃；進樣量為10 μL。

2.5.4 方法學考察

2.5.4.1 系統(tǒng)適用性考察 精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(圖2)，結(jié)果說明方法專屬性良好、分離度良好。

(a)對照品溶液

2.5.4.2 線性關系考察 取適量的齊墩果酸、熊果酸對照品分別配制成0 μg/mL、5.2327 μg/mL、8.7212 μg/mL、14.5354 μg/mL、24.2256 μg/mL、40.3760 μg/mL、50.4700 μg/mL與0 μg/mL、21.3885 μg/mL、35.6475 μg/mL、59.4125 μg/mL、99.0209 μg/mL、165.0348 μg/mL、206.2935 μg/mL 7種不同濃度。按“2.5.3”項下的色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，得到線性回歸方程：Y(齊墩果酸)=0.0815X+0.0005，R2=0.9999；Y(熊果酸)=0.0724X-0.0265，R2=0.9999。結(jié)果表明齊墩果酸、熊果酸分別在0～50.4700 μg/mL、0～206.2935 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5.4.3 精密度試驗 取上述兩種對照品混合溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值分別為1.6%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.4 重復性試驗 精密稱取樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值分別為1.49%、1.41%，表明方法重復性良好。

2.5.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品粉末0.5 g，按“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，記錄峰面積并計算RSD值，結(jié)果顯示RSD值為0.99%、0.46%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4.6 加樣回收試驗 取已知齊墩果酸、熊果酸含量的枇杷葉藥材粉末9份，每份0.25 g，加入對照品混合溶液后，制備成供試品溶液(第1～3份，加入已知含量的50%；第4～6份加入已知含量的100%；第7～9份加入已知含量的150%)，按“2.5.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率均值分別為98.18%(RSD=1.93%)、98.75%(RSD=2.20%)，表明該方法準確度較高。

2.5.5 齊墩果酸、熊果酸含量測定 由表6可知：枇杷葉不同切制規(guī)格、相同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量相近；相同切制規(guī)格、不同料蜜比，齊墩果酸、熊果酸含量隨著料蜜比的增加而降低；生品齊墩果酸、熊果酸含量最高。

表6 不同炮制工藝枇杷葉齊墩果酸、熊果酸含量測定結(jié)果

2.6 炮制工藝指標優(yōu)化 以齊墩果酸、熊果酸、總黃酮、醇溶性浸出物等含量及外觀性狀評分為評價指標，采用單因素考察對蜜炙枇杷葉工藝進行全面評價。

2.6.1 外觀形狀評價標準參照 2020 年版《中國藥典》第一部炙枇杷葉【性狀】項下規(guī)定，確定性狀評分標準。見表7。

2.6.2 內(nèi)在指標評價標準 根據(jù)評價指標的重要程度，將指標分為3個層次，按齊墩果酸=熊果酸>總黃酮>浸出物=水分=總灰分=酸不溶性灰分>外觀性狀的優(yōu)先順序，利用yaahp v10.3應用軟件構(gòu)建各指標成對比較的優(yōu)先判斷矩陣，給予齊墩果酸、熊果酸的權(quán)重均為0.2918，給予醇溶性浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分的權(quán)重均為0.0607，分別給予總黃酮含量的權(quán)重為0.1462、外觀性狀為0.0274，并對矩陣進行歸一化處理，計算出一致性比(CR)=0.0161<0.10，表明該指標成對比較的優(yōu)先判斷矩陣具有滿意的一致性，求得的權(quán)重系數(shù)有效。

將以上得到權(quán)重的各指標加權(quán)綜合評分，得出綜合評分OD=(0.2918A/Amax+0.2918B/Bmax+0.1462C/Cmax+0.0607D/Dmax+0.0607E/Emax+0.0607F/Fmax+0.0607G/Gmax+0.0274H/Hmax)×100。見表8。其中A～H分別表示齊墩果酸含量、熊果酸含量、總黃酮含量、浸出物值、水分值、總灰分值、酸不溶性灰分值及外觀性狀得分。其中Amax-Hmax分別表示上述各數(shù)值的最大值，綜合評分越高表示樣品質(zhì)量越好。

2.6.3 料蜜比考察 基于上述結(jié)論可知，切段炮制品的水分值、總黃酮含量高于細絲、寬絲，其余指標相近，故稱取切制成段后枇杷葉7份，每份100 g，在不同料蜜比(料蜜比分別為100∶5、100∶10、100∶20、100∶40、100∶60、100∶80、100∶100)下按照前述炮制要求進行炮制、測定；考察不同料蜜比下對綜合評分的影響，結(jié)果顯示(圖2)料蜜比=100∶10時炮制品綜合評分最高。

2.6.4 切制規(guī)格考察 稱取生枇杷葉3份，每份100 g，切制成不同規(guī)格(細絲、寬絲、段)，在料蜜比為100∶10時按照前述炮制要求進行炮制、測定；考察不同切制規(guī)格下對綜合評分的影響，結(jié)果顯示(圖3)切制成段的炮制品綜合評分最高。

3 結(jié)論與討論

枇杷葉中的三萜類成分具有鎮(zhèn)咳、抗炎等作用[13-14]，研究[15-16]發(fā)現(xiàn)在不同炮制品中總?cè)坪坑休^大差異，其中蜜炙品總?cè)坪孔罡撸引R墩果酸和熊果酸(五環(huán)三萜類化合物)性質(zhì)穩(wěn)定、含量較大。

實驗通過對3種提取溶劑(95%乙醇、無水乙醇、甲醇)進行考察，發(fā)現(xiàn)95%乙醇更穩(wěn)定，故選擇95%乙醇作為供試品的提取溶劑；通過對3種不同色譜柱(Shim-Pack GIST、Shim-Pack GIS、Diamonsil)在不同檢測波長、柱溫、流速、進樣量條件下進行考察，根據(jù)峰數(shù)目、基線平穩(wěn)度、信號響應值、分離度，確定色譜柱為Shim-Pack GIS C18，檢測波長為210 nm，柱溫為23 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

齊墩果酸和熊果酸互為同分異構(gòu)體，均為弱酸性五環(huán)三萜類化合物，兩者極其相似，故在同時含有齊墩果酸和熊果酸的植物中很難分離兩者[17]。2020年版《中國藥典》中所用流動相含有醋酸銨鹽，而通過查閱相關文獻[18]發(fā)現(xiàn)，水相是醋酸銨時，峰型和分離度都得到提高和改善，但其在210 nm處存在紫外吸收，從而使基線呈現(xiàn)波浪狀，影響成分檢查的結(jié)果，故將流動相進行混勻后使用。

本實驗過程中相同切制規(guī)格、不同料蜜比樣品的水分值、灰分值、總黃酮含量、齊墩果酸和熊果酸含量隨著料蜜比的增加而呈現(xiàn)降低趨勢，浸出物值隨著料蜜比的增加呈現(xiàn)上升趨勢；通過單因素考察分析結(jié)果可知枇杷葉最適宜切制規(guī)格為段，最佳料蜜比為100∶10。