十味板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究探討

魯 毅 劉 梅 段 靖 賈 琳 賈奕揚(yáng) 李燕思

中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥劑科，南京 210002

十味板藍(lán)根顆粒為東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院自制制劑，2003年經(jīng)南京軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部批準(zhǔn)為非標(biāo)準(zhǔn)制劑，2017年再次取得軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號(hào)：總制字(2017)F516007。該制劑由板藍(lán)根、大青葉、金銀花、連翹等十味中藥材組成，其功能主治為疏風(fēng)、發(fā)汗解表、清熱解毒利咽[1]；用于感冒引起的發(fā)熱、惡寒、頭痛、流涕、咽痛等癥[2]，其制劑可能與其抗病毒活性緊密相關(guān)[3]。為了提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文采用薄層色譜法對(duì)(R，S)-告依春、大青葉、黃芩、防風(fēng)進(jìn)行定性鑒別，按顆粒制劑通則進(jìn)行檢查，采用高效液相色譜法測(cè)定對(duì)(R，S)-告依春進(jìn)行含量測(cè)定，完善了十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)保證其質(zhì)量具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫公司)、UV-1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、CPA225D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)、超聲波清洗器、硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)

1.2 試藥 十味板藍(lán)根顆粒(規(guī)格：15 g/袋，東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，批號(hào)190331、190401、190402)，(R，S)-告依春對(duì)照品(批號(hào)111753-201204)、靛玉紅對(duì)照品(批號(hào)110117-200204)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-201318)、防風(fēng)對(duì)照品(批號(hào)120947-201409)、除陰性對(duì)照品由東部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院自制外，其余對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)生物制品研究所。甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 十味板藍(lán)根顆粒(R，S)-告伊春鑒別 取十味板藍(lán)根顆粒1 g，研細(xì)，加80%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，制備供試品溶液[4]；同法制備去板藍(lán)根的陰性對(duì)照品溶液；另取(R，S)-告伊春對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，制備對(duì)照品溶液。參照《中國(guó)藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)作為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品譜圖與對(duì)照藥品譜圖在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖1所示。

2.1.2 十味板藍(lán)根顆粒黃芩苷鑒別 取十味板藍(lán)根顆粒20 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液50 mL，加熱回流30min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?5 mL使溶解，取上清液作為供試品溶液；同法制備黃芩對(duì)照藥材溶液和去黃芩苷的陰性對(duì)照品溶液；另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，制備黃芩苷對(duì)照品溶液，參照《中國(guó)藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59，吸取上述供試品溶液，對(duì)照藥材溶液各4 μL及上述對(duì)照品溶液2，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色。供試品譜圖與對(duì)照藥材譜圖在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對(duì)照品譜圖相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同的暗色斑點(diǎn)。如圖2所示。

1：黃芩苷對(duì)照品；2：黃芩對(duì)照藥材；3：供試品(190401)；4：陰性對(duì)照

2.1.3 十味板藍(lán)根顆粒防風(fēng)鑒別 取十味板藍(lán)根顆粒20 g，研細(xì)后加丙酮50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，制備供試品溶液；同法制備去防風(fēng)的陰性對(duì)照品溶液；另取防風(fēng)對(duì)照藥材1 g，加丙酮20 mL，同法制成防風(fēng)對(duì)照藥材溶液；參照《中國(guó)藥典》2020版薄層色譜法(第四部通則0502)[4]59試驗(yàn)，吸取供試品溶液20 μL、對(duì)照藥材10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)兩次，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品譜圖與對(duì)照藥材譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖3所示。

1.防風(fēng)對(duì)照藥材；2.供試品(190401)；3.陰性對(duì)照

2.2 檢查

2.2.1 粒度的測(cè)定 除另有規(guī)定外，照粒度測(cè)定法，雙篩分法[4]146測(cè)定，3批次十味板蘭根顆粒檢查不能通過(guò)一號(hào)篩與可以通過(guò)五號(hào)篩的總和不超過(guò)15%，均符合規(guī)定。

2.2.2 水分的測(cè)定 照水分測(cè)定法，照《中國(guó)藥典》2020版四部通則0832(烘干法)[4]114-115測(cè)定：3批次十味板蘭根顆粒水分檢查結(jié)果均不超過(guò)8%，符合規(guī)定。

2.2.3 溶化性的測(cè)定 取供試品10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，3批次十味板蘭根顆粒全部溶化，有輕微渾濁，符合規(guī)定。

2.2.4 裝量差異的測(cè)定 照《中國(guó)藥典》2020版四部通則0104顆粒劑項(xiàng)下“裝量差異”檢查法[4]6-7測(cè)定。取每批次十味板藍(lán)根供試品10袋，共30袋。分別稱定每袋內(nèi)容物的重量，與標(biāo)示裝量相比較，裝量差異限度在標(biāo)示裝量的±5%以內(nèi)，超出裝量差異限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍[4]，3批次十味板蘭根顆粒檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.02%磷酸溶液(5∶95，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；在該條件下，理論塔板數(shù)按(R，S)-告依春峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.3.2 溶液的配制 對(duì)照品溶液的制備：取(R，S)-告依春對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。供試品溶液的制備：取十味板藍(lán)根顆粒約15 g，精密稱定，置圓底瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，稱重，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。陰性對(duì)照溶液的制備：依據(jù)十味板藍(lán)根顆粒配方比例，制備缺板藍(lán)根藥材的陰性對(duì)照樣品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，制成陰性對(duì)照溶液[6]。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 按以上色譜條件分別取(R，S)-告依春對(duì)照品溶液、十味板藍(lán)根顆粒供試品溶液、缺板藍(lán)根陰性對(duì)照溶液10 μL進(jìn)樣，陰性對(duì)照色譜中，在(R，S)-告依春相應(yīng)的出峰時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。如圖4所示。

A

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取已配制好的(R，S)-告依春對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。精密稱取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.3.1項(xiàng)下規(guī)定色譜條件測(cè)定(R，S)-告依春峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為：Y=3590X-15.03(r=0.999，n=5)。結(jié)果表明，(R，S)-告依春質(zhì)量在0.040～0.400 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取5份(R，S)-告依春對(duì)照品溶液各10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)量峰面積，結(jié)果RSD為0.20%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取十味板藍(lán)根顆粒(批號(hào)：190401)適量制備供試品溶液，在室溫條件下靜置，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h時(shí)，分別測(cè)定(R，S)-告依春含量。結(jié)果，(R，S)-告依春峰面積的RSD為1.20%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取取十味板藍(lán)根顆粒(批號(hào)：190401)6份，按2.3.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，2.3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定(R，S)-告伊春峰面積。結(jié)果，峰面積平均值為296.43027，RSD為0.60%(n=6)，表明以上方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知(R，S)-告依春含量的十味板藍(lán)根顆粒供試品(批號(hào)：190401；含量：0.791 mg)，每份均加入精密量取的(R，S)-告依春對(duì)照品0.979 mg，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下方法檢測(cè)峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.9 供試品含量測(cè)定 按2.3.2項(xiàng)下方法制備十味板藍(lán)根顆粒供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定3批十味板藍(lán)根顆粒供試品(批號(hào)190331、190401、190402)的(R，S)-告依春平均含量，測(cè)得平均值為0.78 mg。見(jiàn)表2。

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/袋)

3 討論

十味板藍(lán)根顆粒由十味中藥組成，成分復(fù)雜，其中板藍(lán)根味苦、寒，歸心、胃經(jīng)；功效為清熱解毒，涼血利咽，為方中君藥[3]；近年來(lái)越來(lái)越多的研究[7-10]表明板藍(lán)根具有抗內(nèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)、抗菌消炎、耐缺氧及抗疲勞等藥理作用。(R，S)-告依春(C5H7NOS)作為板藍(lán)根中的主要抗病毒成分，2020年版《中國(guó)藥典》中采用HPLC法測(cè)定板藍(lán)根中(R，S)-告依春的含量對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制[4]，國(guó)內(nèi)外一些文獻(xiàn)[11-15]中也收載了類似的定性定量分析方法，故筆者選擇(R，S)-告伊春作為十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制含量測(cè)定指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)建立了十味板藍(lán)根顆粒中(R，S)-告依春、黃芩、防風(fēng)的薄層色譜鑒定方法，以及(R，S)-告依春的高效液相色譜定量測(cè)定方法。方法穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，對(duì)科學(xué)、有效評(píng)價(jià)十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量具有重要意義。

十味板藍(lán)根顆粒在劑型的質(zhì)量控制上應(yīng)符合藥典關(guān)于顆粒制劑的要求。本研究按照2020年版《中國(guó)藥典》(四部)附錄顆粒劑制劑通則的要求制訂檢查，項(xiàng)目包括粒度、水分、溶化性、裝量差異等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3批次十味板藍(lán)根顆粒的檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》(一部)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求[4]480-483，(R，S)-告伊春含量限(幅)度的制訂，根據(jù)3批次十味板藍(lán)根顆粒樣品的實(shí)際測(cè)定結(jié)果，按其平均值的±20%限度。本研究測(cè)定的(R，S)-告伊春含量平均值為0.78 mg/袋，下調(diào)20%為0.62 mg，而本次實(shí)驗(yàn)3批次樣品的(R，S)-告伊春含量均高于該量，因此初步確定十味板藍(lán)根顆粒告伊春含量限度為0.62 mg/袋。

本實(shí)驗(yàn)選用甲醇、70%甲醇、水作為提取溶劑進(jìn)行比較，提取方法及含量測(cè)定方法相同，甲醇作為提取溶劑含量較高，雜質(zhì)峰較少，因此選擇甲醇作為溶劑。提取方法采用超聲提取30 min，加熱回流30 min、60 min、90 min。研究中發(fā)現(xiàn)，加熱回流60 min、90 min時(shí)，提取較完全，因此本研究選用甲醇作為提取溶劑、加熱回流提取60 min。參考文獻(xiàn)[16]選用甲醇-水(7∶93)、流速 1 mL/min 作為流動(dòng)相，分離效果較差，本研究降低甲醇比例，選擇甲醇-水(5∶95)作為流動(dòng)相，(R，S)-告依春與其他組分可完全分離，達(dá)到較佳的結(jié)果。該法簡(jiǎn)便快捷，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，且重現(xiàn)性好，為十味板藍(lán)根顆粒質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究初步建立了十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢查項(xiàng)目均符合相關(guān)要求，色譜特征明顯，含量測(cè)定方法操作方便，專屬性強(qiáng)，含量限度設(shè)定合理，可用于十味板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制。