PEAR1 基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關性研究

張云芳，莊杉杉，余 艷，李 錚，吳曉明，聶曉改

（昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，云南 昆明 650051）

缺血性腦卒中是由于多種因素引起的腦血管病變，發(fā)生缺血缺氧并產(chǎn)生組織壞死，最終導致神經(jīng)功能障礙的一組疾病，約占腦卒中的60%～80%[1]。在全球，腦卒中患病率均處于較高水平，隨之而來的死亡率也逐漸引起關注，在歐美國家中，腦卒中是排在冠心病和癌癥之后的第3 位死亡原因。在我國，腦卒中嚴重威脅國民健康，已成為成人致殘甚至死亡的首位病因[2]。缺血性腦卒中致病因素多樣，具體病因尚未明確，發(fā)病機制較為復雜，基因多態(tài)性與疾病相關性成為新的研究熱點，近年來以血小板內(nèi)皮聚集受體1（platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1）基因多態(tài)性位點研究頗受關注。既往有研究發(fā)現(xiàn)，檢測冠心病和缺血性腦卒中患者的血清PEAR1水平，兩類患者的PEAR1水平均升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)PEAR1基因多態(tài)性可影響冠心病患者血小板黏附聚集，導致凝血系統(tǒng)發(fā)生變化，有引發(fā)血栓風險，發(fā)生腦卒中或再次心梗，PEAR1基因多態(tài)性與腦卒中患者用藥及疾病預后相關[3]。然而，有研究者將PEAR1不同基因型與腦梗死發(fā)生復發(fā)不同周期比較，發(fā)現(xiàn)PEAR1基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生及復發(fā)無相關性[4]。PEAR1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者疾病發(fā)生的相關性尚存爭議。

PEAR1是血小板之間相互作用的一種跨膜受體，在血小板和內(nèi)皮細胞中均有表達，其基因由23 個外顯子和22 個內(nèi)含子組成，在血小板活化中起很重要的作用，參與多種血管相關疾病的發(fā)生[5-6]。在缺血性腦卒中患者血清中PEAR1水平升高，提示其與腦卒中發(fā)生可能存在關聯(lián)，PEAR1可能是腦卒中發(fā)生的一個危險因子。本研究通過分析缺血性腦卒中患者PEAR1基因位點多態(tài)性并探討其與疾病發(fā)生的相關性，為缺血性腦卒中發(fā)病機制的進一步研究及疾病治療靶點提供科學依據(jù)及研究方向。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2022 年6 月至至2023 年6 月昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院就診的150 例缺血性腦卒中患者的臨床資料，其中男性95 例，女性55 例，年齡45～80 歲，平均（63.75±9.67）歲。另外收集同期健康人群150 例作為對照組，其中男性88 例，女性62 例，年齡45～80 歲，平均（63.66±8.81）歲。

納入標準：經(jīng)核磁共振彌散成像或者CT 灌注成像（computed tomography perfusion imaging，CTP）檢查確診為缺血性腦卒中。入組患者診斷標準符合中國急性缺血性腦卒中診治指南[7]。排除標準：患有心源性栓塞、心臟疾病、癲癇、腦部創(chuàng)傷、血管畸形、腦腫瘤，腦出血或先天性腦部疾病的患者。該研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2022-127-01），且患者簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器核酸提取儀（西安天隆科技有限公司）、PCR 擴增儀（上海宏石）、電泳儀（美國Bio-rad 公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）、熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.2.2 主要試劑人全血基因DNA 提取試劑盒（西安天隆科技有限公司）、內(nèi)切酶BCCI（美國NEB 公司）、2×TaqPCRMasterMix（北京博邁德生物技術有限公司）、瓊脂糖（北京博邁德生物技術有限公司）、DNA MarkerI（北京博邁德生物技術有限公司）、核酸染料（上海愛必夢生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取采集入組人群EDTA 抗凝靜脈血2mL。用人全血基因DNA 提取試劑盒提取缺血性腦卒中患者及健康體檢者外周血基因組DNA，方法嚴格按照試劑盒的說明書進行，提取產(chǎn)物-20℃保存。

1.3.2 PEAR1 目的基因擴增使用PCR 方法進行目的片段基因擴增，引物片段Forward: 5＇-CAC TAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3＇，Reverse:5＇-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3＇，擴增反應總體積為25 μL，反應體系包括上下游引物各0.5 μL、DNA 模 板5 μL、2 × TaqPCRMasterMix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復35 個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察PCR 擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物片段大小為408 bp。

1.3.3 PEAR1 基因分型PCR-RFLP 方法進行基因分型，取上述擴增成功的產(chǎn)物2 μL，內(nèi)切酶BCCI 1 μL，10×NEBuffer 5 μL，ddH2O 42 μL。放置于37 ℃恒溫箱進行至少1 h 的酶切反應然后終止。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電壓、300 mA 電流穩(wěn)壓電泳40 min，紫外燈下觀察酶切產(chǎn)物并根據(jù)條帶數(shù)分型。酶切后的GG 型純合子片段大小為408 bp 單個條帶，AA 型純合子大小為178 bp、230 bp 2 個條帶，GA 型雜合子大小為408 bp、178 bp、230 bp 3 個條帶，見圖1。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳進行初步檢測后，取部分樣本的PCR 擴增產(chǎn)物和相應引物送北京博邁德生物技術有限公司進行正反2 個方向的測序分析，以進一步驗證目的片段，見圖2～圖3。

圖1 PEAR1 基因凝膠電泳條帶圖Fig.1 PEAR1 gene gel electrophoresis band

圖2 PEAR1 基因AA 基因型測序圖Fig.2 PEAR1 gene AA genotype sequencing

圖3 PEAR1 基因GA 基因型測序圖Fig.3 PEAR1 gene AA genotype sequencing

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件進行分析。計量資料滿足正態(tài)分布時以（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。用卡方檢驗對研究對象的基因型和等位基因頻率進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗。影響因素的篩選采用單因素方差分析（ANOVA）或獨立樣本t檢驗，用Logistic 回歸分析有差異的因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

缺血性腦卒中組的糖尿病、高血壓比例和同型半胱氨酸（HCY）水平、高同型半胱氨酸水平比例較正常對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）2 組的性別、年齡、血脂間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 缺血性腦卒中組和正常對照組一般資料比較[n（%）/ ]Tab.1 Comparison of general data between ischemic stroke group and normal control group[n（%）/ ]

表1 缺血性腦卒中組和正常對照組一般資料比較[n（%）/ ]Tab.1 Comparison of general data between ischemic stroke group and normal control group[n（%）/ ]

*P＜0.05。

2.2 基因型與等位基因頻率分布

統(tǒng)計缺血性腦卒中組和正常對照組的基因型例數(shù)，缺血性腦卒中組和正常對照組等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞ 0.05），基因型在各組間具有群體代表性，見表2。

表2 缺血性腦卒中組和正常對照組的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（n）Tab.2 Hardy-weinberg genetic balance test in ischemic stroke group and normal control group（n）

2.3 PEAR1 基因rs12041331 位點多態(tài)性分析

缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1基因rs12041331G ＞ A 位點基因型分布以及G、A 等位基因頻率，見表3。經(jīng)卡方檢驗顯示，缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1基因rs12041331G ＞A 位點GG、GA、AA 基因型分布以及 G、A 等位基因頻率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 缺血性腦卒中組和正常對照組PEAR1 基因rs12041331G >A 位點基因型分布和等位基因頻率的比較[n（%）]Tab.3 Comparison of genotype distribution and allele frequency of PEAR1 gene rs12041331G>A between ischemic stroke group and normal control group[n（%）]

2.4 缺血性腦卒中發(fā)生影響因素的Logistic 回歸分析

將缺血性腦卒中組和正常對照組組間差異有統(tǒng)計學意義的糖尿病、高血壓、HCY、rs12041331位點GG、GA 和AA 基因型作為自變量，是否發(fā)生缺血性腦卒中（發(fā)生=1，不發(fā)生=0）作為因變量，進行Logistic 回歸分析，結果顯示：糖尿病、高血壓、HCY、rs12041331 位點GA、AA 基因型與缺血性腦卒中相關（P＜0.05），均是危險因素，見表4。

表4 缺血性腦卒中發(fā)生影響因素的Logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of influencing factors of ischemic stroke

3 討論

我國腦卒中患者隨著人口老齡化的到來逐日增多，其中以缺血性腦卒中最為常見，每年新增人數(shù)達200 萬人，其中150 萬患者因腦卒中死亡，而存活患者也不同程度喪失行動能力[8]。由此給家庭帶來巨大的精神和經(jīng)濟壓力，給社會帶來沉重負擔。因此，腦卒中的早期預防和患病后及時治療尤為重要，是我國亟待解決的醫(yī)學問題。目前的防治主要從危險因素進行干預以及進行抗血栓治療，明確缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的可能機制，并進行有效的干預，是防治缺血性腦卒中的重要措施之一。

本研究用PCR-RFLP 方法對研究對象PEAR1基因rs12041331G ＞ A 等位基因多態(tài)性進行檢測和分析。結果顯示，缺血性腦卒中組的糖尿病、高血壓比例較正常對照組高，HCY 水平2 組均升高（HCY 實驗室正常參考范圍0～10 μmol/L），缺血性腦卒中組的HCY 水平高于正常對照組（P＜0.05）。缺血性腦卒中發(fā)生的病因不明確，飲食習慣、吸煙、患有糖尿病、高血壓等疾病以及血清高HCY 水平是目前公認的缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素[9-10]，本研究PEAR1基因rs12041331G ＞A 位點GG、GA、AA 基因型分布以及G、A 等位基因頻率在缺血性腦卒中組和正常對照組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），缺血性腦卒中組的突變基因型和A 等位基因頻率比正常對照組高。Logistic 回歸分析結果顯示糖尿病、高血壓、HCY、PEAR1基因rs12041331 位點GA、AA 基因型與缺血性腦卒中相關，A 等位基因突變是缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素（P＜0.05）。PEAR1基因rs12041331 屬于內(nèi)含子，不參與編碼氨基酸序列，但內(nèi)含子附近區(qū)域變異可影響相關蛋白的表達，從而改變蛋白的功能，相關蛋白可觸發(fā)多種激動劑，使血小板發(fā)生聚集，PEAR1基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生相關，與腦梗死認知功能障礙密切相關，影響腦卒中患者的預后[11]。PEAR1可通過介導PI3K/AKT 和PI3K/PTEN 信號通路影響血管內(nèi)皮細胞增生、新生血管生成和血栓形成，A 等位基因突變可能通過改變激動蛋白的表達影響PEAR1介導的PI3K/AKT 信號通路，進而調(diào)節(jié)血小板的活化和聚集功能[12]。A 等位基因也可能通過影響內(nèi)皮細胞的遷移而影響血栓的形成[13]。PEAR1基因rs12041331 位點SNP 與患者血小板活性增強有關，引起血小板之間發(fā)生聚集，突變型AA 純合子血小板聚集率高于野生型GG 純合子，且突變位點數(shù)越多，相應的血小板聚集率就越高；腦卒中病人使用抗血小板聚集藥物治療后的一段時間，雜合突變型GA 心血管事件發(fā)生率增高[14]。首次發(fā)生缺血性腦卒中后，長期服用阿司匹林的患者中，PEAR1基因純合突變的患者相較于另外2 種基因型患者發(fā)生腦卒中復發(fā)的風險更高，影響患者預后，帶來的危害更為嚴重[15]。PEAR1通過不同的路徑引發(fā)血小板改變、血栓形成，進而導致缺血性腦卒中發(fā)生。

本研究就PEAR1基因與缺血性腦卒中進一步研究提供了依據(jù)。PEAR1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生相關，缺血性腦卒中具有遺傳易感性，為缺血性腦卒中易感人群的篩選、患病風險評估、早期防治干預等提供科學依據(jù)，為疾病的綜合防治提供思路。