化濕潤睛湯通過調(diào)控COX-2、TNF-α 和 IL-6 蛋白改善去勢雄性干眼病大鼠的炎癥反應(yīng)

楊金潤 ，趙歡歡 ，吳志聰 ，余戈蕊 ，馬 嵐 ，陳玉芬 ，解謾伊 ，董 玉

（1）云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，云南 昆明 650021;2）云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

干眼?。╠ry eye disease，DED）是眼球表面淚液膜發(fā)生了質(zhì)和量的異常，并伴隨眼表癥狀的一種多因素疾病[1]。發(fā)病主要原因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺異常等[2-3]。臨床眼表輕癥主要表現(xiàn)為眼部不適，如眼疲勞、異物感、干澀感等，而眼表重癥則會出現(xiàn)視力下降甚至是視物障礙等問題[4-5]。最近一項流行病學(xué)薈萃結(jié)果分析，預(yù)計全球患病率為11.9%，對于有癥狀的疾病，患病率估計為9.12%，其中女性為9.5%，男性為6.8%[6]。由于老年人口的規(guī)模不斷擴大以及信息技術(shù)設(shè)備的廣泛使用影響生活方式的變化，預(yù)計未來DED 患者的數(shù)量將迅速增加[7]。目前DED 不能完全根治，主要以替代療法、對癥治療為主。治療的藥物主要集中在抗炎癥和抗氧化方面，但化學(xué)類藥物的治療局限和副作用是臨床應(yīng)用中難以克服的問題[8]。因此，從我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的角度尋找效果好且副作用小中藥配方治療該病，并且深入研究其相關(guān)的分子機制將是中醫(yī)藥研究的熱點[9]。在長期臨床經(jīng)驗中，云南省榮譽名中醫(yī)蘇藩教授總結(jié)出化濕潤睛湯治療干眼疾病患者，均取得良好療效[10]。然而，關(guān)于化濕潤睛湯治療干眼病的作用機制尚未做出相關(guān)研究。故本實驗制備了去勢雄性干眼病大鼠模型，觀察化濕潤睛湯對去勢雄性干眼病大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 的影響，以期為臨床用藥提供充足的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

1.1.1 主要試劑熒光素鈉眼科檢測試紙、淚液檢測濾紙條購自天津伊諾新康醫(yī)療器械科技有限公司；ELISA 試劑盒（大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蛋白抗體（COX-2、TNF-α、IL-6）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.1.2 主要儀器裂隙燈顯微鏡（YZ3，蘇州六六視覺有限公司）；醫(yī)用低溫保存箱（DW-86L626，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；普通冰箱（BCD-480WBPT 海爾智家股份有限公司）；臺式高速冷凍型微量離心機（CF1524R，北京開源國創(chuàng)科技有限公司）；電泳儀（PowerPacUniversal，美國伯樂公司）。

1.2 實驗動物及分組

60 只6 周齡雄性SD 大鼠，平均體重為（180±210）g。購買于昆明醫(yī)科大學(xué)，許可證為SCXK（滇）K2020-0004。采用熒光素鈉染色方法排除角膜有點染、潰瘍的大鼠，再將60 只角膜無熒光素鈉染色的實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機分為4 組，分別為假手術(shù)組、陰性對照組、陽性對照組、化濕潤睛湯治療組；所有分組各15 只。每組實驗大鼠統(tǒng)一喂養(yǎng)條件，即室內(nèi)溫度為（24±3）℃；室內(nèi)濕度為（56±3）℃；普通飼料喂養(yǎng)；自由飲水和攝食。本研究動物實驗是在云南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室進(jìn)行，經(jīng)過云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的審核和批準(zhǔn)（R-062022G167）。

1.3 實驗藥物

化濕潤睛湯組成：苦杏仁10 g、薏苡仁30 g、豆蔻10 g、生白術(shù)15 g、茯苓15 g、炒柴胡10 g、女貞子15 g、杭芍15 g、枳實10 g、紅花5 g、甘草5 g。此方制備成中藥配方顆粒，按照以上劑量用150 mL 開水沖泡，待藥物冷卻至常溫后取5 mL予以灌胃。藥液濃度為0.93 g/mL。玻璃酸鈉滴眼液購自于參天制藥中國有限公司；生產(chǎn)批號為S1H0027。

1.4 動物模型制備方法

予以體積分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉藥物（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉實驗大鼠，麻醉后大鼠仰臥位固定、暴露并消毒下腹部局部皮膚。切開下腹部，結(jié)扎精索靜脈及輸精管后再切除睪丸及附睪。同法切除另一側(cè)睪丸及附睪。間斷縫合腹部傷口，涂紅霉素預(yù)防感染。此外，造模大鼠予以肌內(nèi)注射青霉素G 0.1 mL，每天1 次，連續(xù)注射3 d。在造模過程中出現(xiàn)大鼠死亡的，按照設(shè)計補齊。術(shù)后1 周進(jìn)行拆線，傷口見一期愈合。假手術(shù)組實驗大鼠切開腹腔而不切除兩側(cè)睪丸及附睪；陰性對照組、陽性治療組、化濕潤睛湯治療組實驗大鼠切開腹腔并切除兩側(cè)睪丸及附睪。造模1 周后，采用FL、BUT、SIT 檢測驗證是否造模成功。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：與假手術(shù)組比較，出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的淚液分泌量減少和淚膜破裂時間縮短，并具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明去勢干眼病大鼠造模成功[11-12]。實驗大鼠造模成功即可入選后續(xù)實驗。

1.5 藥物干預(yù)方式

造模后1 周待腹部傷口基本愈合后開始用藥。假手術(shù)組、陰性對照組予以等量生理鹽水灌胃，1 次/d，同時予以生理鹽水滴雙眼，1 滴/次，3 次/d；陽性對照組予以玻璃酸鈉滴眼液滴雙眼，1 次/滴，3 次/d；化濕潤睛湯治療組予以化濕潤睛湯5 mL 灌胃，1 次/d；持續(xù)用藥8 周后行FL、BUT、SIT 檢測；隨后在全身麻醉的狀態(tài)下行大鼠腹腔動脈取血，并收集大鼠雙側(cè)淚腺組織以備下一步實驗。

1.6 取材方式

實驗大鼠予以腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉藥物（0.2 mL/100 g）麻醉，大鼠麻醉后，腹部消毒、鋪巾，由腹部切口充分暴露腹主動脈位置，進(jìn)行腹主動脈血液采集；采血完成之后，實驗大鼠瀕臨死亡狀態(tài)，予以消毒并間斷縫合傷口。采集血液統(tǒng)一靜置20 min 后進(jìn)行離心、低溫保存。各組實驗大鼠在腹腔動脈采血完成之后，切開內(nèi)外眥，向外牽拉眼球，打開穹窿結(jié)膜，于球后剪斷視神經(jīng)并摘除眼球，可見淚腺包裹部分后部眼球，呈不規(guī)則三角形，取出全部淚腺組織并保存。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方式

1.7.1 FL 檢測將熒光素鈉試紙用生理鹽水蘸濕后輕觸實驗大鼠的角膜，然后在裂隙燈顯微鏡用鈷藍(lán)色彌散光觀察。損傷部位顯示為黃綠色，做拍照記錄。點狀上皮損傷將被染色，計算角膜染色“點”的數(shù)量。FL 染色評分細(xì)則見表1[13]。角膜分為5 個區(qū)，分別為上區(qū)、下區(qū)、中央?yún)^(qū)、鼻側(cè)區(qū)、顳側(cè)區(qū)，這5 個區(qū)得分相加即為染色評分。

表1 FL 評分細(xì)則Tab.1 Scoring rule

1.7.2 BUT 檢測將熒光素鈉試紙用生理鹽水蘸濕后輕觸實驗大鼠的角膜，手動使其瞬目2～3 次后在裂隙燈顯微鏡下用鈷藍(lán)光觀察并記錄淚膜破裂時間。測量3 次取平均值。

1.7.3 SIT 檢測將淚液檢測濾紙條放置大鼠下眼瞼結(jié)膜囊的內(nèi)1/3 處。放置5 min 后取出濾紙，2 min 后測量試紙濕長并記錄。

1.7.4 ELISA 法血清檢測實驗大鼠血液經(jīng)3 000 r/min 低溫高速離心機中離心20 min 后儲存于-80 ℃超低溫冰箱中。檢測時按照ELISA 劑盒中的說明書嚴(yán)格操作，并做結(jié)果計算和分析。

1.7.5 HE 染色取出4%多聚甲醛固定好的淚腺組織，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片等程序，再按照HE 染色法進(jìn)行染色，最后在正置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7.6 免疫組化將淚腺組織切片后放置于60 ℃干燥箱中進(jìn)行烘烤30 min。待切片干燥后依次用二甲苯I 5 mim、二甲苯II 10 min，以及無水乙醇、95%酒精I(xiàn)、95%酒精I(xiàn)I、80%酒精各5 s 進(jìn)行脫蠟。再用PBS 沖洗，洗3 次，每次5 min。沖洗完成后進(jìn)行抗原修復(fù)。沖洗完畢后放置于3%過氧化氫水溶液中10 min 進(jìn)行阻斷，PBS 洗3 次，每次3 min。用5%BSA 牛血清蛋白進(jìn)行封閉，20 min 后在切片上加入一抗并放置冰箱4 ℃孵育過夜。第2 天將過夜切片放于37 ℃溫箱中復(fù)溫1 h，再進(jìn)行PBS 沖洗3 次。沖洗完成后在切片上滴加反應(yīng)增強液后再用PBS 沖洗3 次，滴加二抗，PBS 沖洗3 次。再于切片上滴加DAB 顯色液，置于鏡下觀察切片顏色，待顏色強度合適后再進(jìn)行PBS 沖洗。用蘇木素染色切片2 min 后，用自來水沖洗8 次以上，再用鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗6 次以上，PBS 返藍(lán)20 min，最后進(jìn)行脫水、封片。以上操作完成后放置切片于鏡下觀察并采集圖像。

1.7.7 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗用RIPA 蛋白裂解液提取淚腺組織細(xì)胞蛋白，并用Bio-Rad 法測定蛋白含量。取30 μg 蛋白作SDSPAGE 電泳，成功上樣之后放置配置好的電泳液里進(jìn)行分離，分離成功后再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)完成后將PVDF 膜用TBST 溶液浸泡洗滌3 次。5% 脫脂牛奶浸泡1 h，60 r/min。將PVDF 膜用TBST 液浸洗，洗凈加入一抗，放置搖床慢搖45 min，后直接存放于4 ℃冰箱中過夜。第二日取出放到搖床上慢搖恢復(fù)室溫30 min，用TBST 液浸洗3 次，回收一抗。加入過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗，搖床搖1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。洗凈之后棄去TBST 液進(jìn)行顯影和曝光成像，利用ImageJ 分析軟件進(jìn)行分析。以βactin 作為內(nèi)參，實驗重復(fù)3 次及以上。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)，對方差齊的數(shù)據(jù)的組間比較以及多重比較采用方差分析，方差不齊時采用Welch檢驗及Games-Howell 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗大鼠FL 檢測結(jié)果比較

2.1.1 角膜熒光素鈉染色（1）造模1 周后：假手術(shù)組角膜無大量陽性著染現(xiàn)象；陰性對照組、陽性對照組、化濕潤睛湯治療組角膜陽性著色面積增多；（2）用藥8 周后：陰性對照組陽性著色面積增加；陽性對照組和化濕潤睛湯治療組陽性著色面積相對較少，見圖1。

圖1 各組實驗大鼠造模1 周后與用藥8 周后熒光素鈉染色結(jié)果Fig.1 FL results after 1 week of modeling and 8 weeks of treatment in each group

2.1.2 FL 評分（1）造模1 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組實驗大鼠FL 評分較多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組FL 評分增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組FL 評分較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組實驗大鼠FL 評分結(jié)果比較[（），分]Tab.2 FL scoring results for each group（，Points）

表2 各組實驗大鼠FL 評分結(jié)果比較[（），分]Tab.2 FL scoring results for each group（，Points）

*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.2 各組實驗大鼠BUT 檢測

（1）造模1 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組實驗大鼠淚膜破裂時間縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組淚膜破裂時間縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組淚膜破裂時間延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組實驗大鼠BUT 檢測結(jié)果比較[（），s]Tab.3 BUT test results for each group[（），s]

表3 各組實驗大鼠BUT 檢測結(jié)果比較[（），s]Tab.3 BUT test results for each group[（），s]

*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.3 各組實驗大鼠SIT 檢測

（1）造模1 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組實驗大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；（2）用藥8 周后：與假手術(shù)組比較，陰性對照組淚液分泌量減少（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組和化濕潤睛湯治療組淚液分泌量增多（P＜0.05），見表4。

表4 各組實驗大鼠SIT 檢測結(jié)果比較[（），mm]Tab.4 SIT test results for each group[（），mm]

表4 各組實驗大鼠SIT 檢測結(jié)果比較[（），mm]Tab.4 SIT test results for each group[（），mm]

*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，與陰性對照組比較，#P＜0.05。

2.4 各組實驗大鼠 ELISA 檢測結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，陰性對照組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化不明顯（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平下降（P＜0.05）；與陽性對照組相比，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平下降（P＜ 0.05），見表5。

表5 各組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化結(jié)果比較[（），pg/mL]Tab.5 Levels of COX-2、TNF-α、IL-6 in serum of each group [（），pg/mL]

表5 各組實驗大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6 水平變化結(jié)果比較[（），pg/mL]Tab.5 Levels of COX-2、TNF-α、IL-6 in serum of each group [（），pg/mL]

*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，▲P＜0.05。

2.5 各組實驗大鼠HE 染色

假手術(shù)組實驗大鼠淚腺組織腺泡大小規(guī)則，排列有序，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)內(nèi)見大量的酶原顆粒。與假手術(shù)組比較，陰性對照組淚腺組織腺泡大小變小，結(jié)構(gòu)紊亂，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)酶原顆粒明顯減少，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤。與陰性對照組比較，陽性對照組和組小腺泡萎縮程度明顯改善，大小基本一致，結(jié)構(gòu)較為清晰，排泄大致有序，酶原顆粒數(shù)量增多，其中陽性對照組炎性細(xì)胞浸潤面積無明顯改變，化濕潤睛湯治療組淚腺組織中炎性細(xì)胞浸潤面積明顯改善，見圖2。

圖2 各組實驗大鼠淚腺組織病理形態(tài)情況（HE 染色，×400）Fig.2 Pathological morphology of lacrimal gland tissue in each group（HE，× 400）

2.6 各組實驗大鼠免疫組化檢測

與假手術(shù)組比較，陰性對照組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNFα 和IL-6 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，化濕潤睛湯治療組實驗大鼠淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖3～圖5。

圖3 各組實驗大鼠淚腺組織COX-2 的表達(dá)情況（免疫組化，×400）Fig.3 The expression level of COX-2 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

圖4 各組實驗大鼠淚腺組織TNF-α 的表達(dá)情況（免疫組化，×400）Fig.4 The expression level of TNF-α in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

圖5 各組實驗大鼠淚腺組織IL-6 的表達(dá)情況（免疫組化，×400）Fig.5 The expression level of IL-6 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group（immunohistochemistry，× 400）

2.7 各組實驗大鼠WB 檢測

與假手術(shù)組比較，陰性對照組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；與陰性對照組比較，化濕潤睛湯治療組淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖6、表6。

圖6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α 和IL-6的蛋白表達(dá)情況Fig.6 Protein expression of COX-2，TNF-α，and IL-6 in lacrimal gland tissue of experimental rats in each group

表6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)情況（，n=3）Tab.6 COX2，TNF-α，and IL-6 protein expression in lacrimal gland tissues of experimental rats in each group（，n=3）

表6 各組實驗大鼠淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)情況（，n=3）Tab.6 COX2，TNF-α，and IL-6 protein expression in lacrimal gland tissues of experimental rats in each group（，n=3）

*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05；與陽性藥物治療組比較，▲P＜0.05。

3 討論

干眼病并無明確的中醫(yī)病名，《中醫(yī)藥治療干眼臨床應(yīng)用指南》將干眼病列為“神水將枯，白澀癥，干澀昏花”的范疇[14]。筆者在臨床中發(fā)現(xiàn)干眼病患者中脾胃濕熱證比例較高，脾胃濕熱證主要是由于過食寒涼生冷、辛辣刺激、肥甘厚膩之品，導(dǎo)致脾胃蘊積濕熱，氣機不暢，目竅失養(yǎng)所致。蘇藩教授認(rèn)為脾胃濕熱證白澀癥發(fā)病的主要病機為脾胃濕熱積聚，肝血肝陰不足，清氣不升，目失濡養(yǎng)所致。采用健脾化濕、濡養(yǎng)肝陰的治則，予以化濕潤睛湯治療該疾病。方中苦杏仁宣利肺氣、氣化則濕亦化；白蔻仁芳香化濕，行氣寬中；薏苡仁滲利濕邪；生白術(shù)、茯苓健脾滲濕；以上配藥以祛濕邪、助脾胃之運化。柴胡、白芍、枳實、甘草調(diào)合肝脾；柴胡辛散，疏肝解郁，調(diào)暢氣機、升發(fā)陽氣；白芍酸收，斂肝和營，使陰血歸經(jīng)；二藥合用，共奏疏肝、升陽、斂陰之效。配枳實瀉脾之壅滯；配甘草能伍白芍柔肝緩急。女貞子滋補肝腎，更有明目之效；紅花入心、肝經(jīng)，活血通絡(luò)。以上諸藥相合，共奏健脾化濕、濡養(yǎng)肝陰、潤睛明目之效。

本實驗通過切除雄性大鼠兩側(cè)睪丸及附睪制備去勢干眼病模型，基于2 個方面的考慮：（1）該造模方式操作過程簡單且成功率高；（2）與干眼病的發(fā)病機制以及本實驗選擇的檢測指標(biāo)密切相關(guān)。目前，干眼病具體的發(fā)病機制尚未完全闡述清楚。有研究表明，多因素導(dǎo)致淚膜功能障礙會造成淚腺炎癥的發(fā)生，最終損害眼表上皮結(jié)構(gòu)，促進(jìn)干眼病的病程進(jìn)展[15]。已有研究證實，雄激素調(diào)節(jié)淚腺和瞼板腺的功能，雄激素缺乏可能會促進(jìn)淚腺炎癥、瞼板腺功能障礙，進(jìn)而加重干眼病[16-17]。動物實驗研究提示，雄激素通過減少炎性因子IL-1 和TNF-α 的表達(dá)而產(chǎn)生抗炎作用，可有效地防止淚腺的炎癥反應(yīng)和萎縮[18]。本實驗采用FL、BUT、SIT 檢測方法驗證實驗動物模型，結(jié)果顯示，模型組角膜熒光素鈉陽性染色面積增加、FL 評分上升、淚膜破裂時間縮短以及淚液分泌量減少，與正常組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表示造模成功。用藥8 周后，化濕潤睛湯減少了角膜熒光素鈉陽性染色面積、降低了FL評分、縮短了淚膜破裂時間以及增加了淚液分泌量，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示化濕潤睛湯對去勢干眼病大鼠具有顯著療效。此外，干眼疾病中一系列炎癥反應(yīng)會造成淚腺組織結(jié)構(gòu)損傷和破壞，并出現(xiàn)相應(yīng)的病理形態(tài)學(xué)改變。在本實驗研究中，觀察到模型組淚腺腺泡細(xì)胞萎縮變小、形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，胞質(zhì)內(nèi)酶原顆粒減少，并見大量炎性細(xì)胞浸潤?；瘽駶櫨纳屏藴I腺組織形態(tài)學(xué)變化，并顯著減輕了淚腺組織內(nèi)的炎性浸潤程度。提示化濕潤睛湯對去勢干眼病大鼠淚腺中的炎性反應(yīng)具有一定的改善作用。

多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的免疫炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)干眼病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理因素。環(huán)氧合酶2（COX-2）是一種調(diào)節(jié)人體炎癥的同工酶，在釋放促炎介質(zhì)時表達(dá)[19]。已知COX-2 常表達(dá)于眼部組織[20]。臨床研究顯示，干眼患者的COX-2 的表達(dá)水平以及其產(chǎn)物前列腺素E2（PGE2）增加[21]。COX-2 的過表達(dá)會產(chǎn)生過多的內(nèi)源性PGE2 進(jìn)入到淚液和眼表，在炎癥早期能夠在局部誘導(dǎo)并激活白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞[22-23]。TNF-α 由T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早且最重要的炎癥介質(zhì)[24]。并且與中性粒細(xì)胞相互作用，促進(jìn)多種促炎因子的生成，如誘導(dǎo)炎性細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素，加速炎癥的發(fā)展。IL-6 是一種調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的功能。但I(xiàn)L-6 并不單獨發(fā)揮作用，常與TNF-α 發(fā)生交互性協(xié)同作用。本實驗研究結(jié)果顯示，用藥8 周后，觀察化濕潤濕湯治療組血清中COX-2、TNF-α、IL-6 水平低于模型組（P＜0.05）；此外，觀察化濕潤濕湯治療組淚腺組織中COX-2、TNF-α、IL-6 蛋白水平低于模型組（P＜0.05）。表明化濕潤濕湯可降低血清炎性因子水平、抑制淚腺組織中炎性因子的表達(dá)，提示化濕潤濕湯可能通過下調(diào)炎癥因子COX-2、TNFα 和 IL-6 的表達(dá)，減輕去勢干眼病大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，化濕潤濕湯可改善去勢干眼病淚腺組織的病理形態(tài)學(xué)改變，可減輕去勢干眼病的炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與抑制淚腺組織中炎癥因子COX-2、TNF-α 和IL-6 表達(dá)相關(guān)。