柴胡皂苷A 對噪音誘發(fā)耳鳴小鼠抑郁的干預作用及機制

張 艷 ，趙浩杰 ，段明志 ，段靜燕 ，楊雪艷

（1）保山市人民醫(yī)院耳鼻喉科;2）腫瘤科；云南 保山 678000;3）保山中醫(yī)藥高等?？茖W校，云南 保山 678000）

耳鳴（Tinnitus）是指無相應的外界生源刺激下，患者卻可以感受到耳內或顱內產生持續(xù)或間斷性聲音的主觀感覺[1]。耳鳴的發(fā)生機理可以分為主觀性耳鳴和客觀性耳鳴。其中，客觀性耳鳴較為少見，是由內部生物源性聲音引起的，可以通過儀器檢測或被其他人聽到，這種耳鳴具有確切的生源，通常與中耳或腦部血管發(fā)育異常等相關；主觀性耳鳴的發(fā)生率較高，是指缺乏相應生源的耳鳴，也是平常所指耳鳴，與中耳炎、噪聲暴露、聽覺通路腫瘤、神經系統(tǒng)疾病等相關[2]。耳鳴的患病率較高，國外數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示成年人中約有10.1%的人患有耳鳴[3]，而在我國成年人中約有11.4%的人患有耳鳴，且患病率隨著年齡的增加而升高[4]。耳鳴可能導致患者出現(xiàn)注意力不集中、失眠、焦慮、易怒、抑郁、恐懼等嚴重的精神癥狀，甚至可能會引起自殺。這些負面情緒會進一步使患者對耳鳴更加敏感，形成惡性循環(huán)，導致患者出現(xiàn)精神和行為異常[5]。目前臨床尚無有效治療耳鳴的藥物，因此探究耳鳴的發(fā)病機制對治療耳鳴有重要意義。噪聲是世界上公認的危害之一，其可通過損傷聽覺系統(tǒng)等多個系統(tǒng)影響人的聽覺和記憶能力等多方面的功能[6]。柴胡的主要有效成分之一是柴胡皂苷A（saikosaponin A，SSA），其具有多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用。近年對SSA 的研究主要集中在抗癲癇、抗抑郁和抗炎等研究，而癲癇和抑郁的發(fā)病與炎癥因子密切相關[7]，體內研究發(fā)現(xiàn)SSA 可通過抑制核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路發(fā)揮較強的抗炎活性[8]，但目前關于SSA能否通過影響炎癥因子對耳鳴小鼠發(fā)揮治療作用鮮有報道，因此本研究從實踐角度出發(fā)，用噪音誘導耳鳴小鼠模型探究，探究SSA 對耳鳴小鼠的干預作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物7～8 周齡，50 只聽力正常的C57BL/6 雄性小鼠，體質量18～20 g，動物均購自成都達碩實驗動物實驗公司，許可證號為：SCXK（川）2013-0024。小鼠均分籠飼養(yǎng)于統(tǒng)一的動物房內，溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h/12 h 晝夜交替，自由攝食飲水。本研究經保山市人民醫(yī)院動物倫理委員會審批通過（20220012）。

1.1.2 試劑和儀器柴胡皂苷A（SSA 化學結構見圖1，質量分數(shù) ＞ 98%，批號：130301，美國Sigma-Aldrich 公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α 抗體（美國Cell signaling technology 公司）；驚跳反射實驗系統(tǒng)（美國Med Associates 公司）；音響（HARMAN International 公司）；視頻行為學分析系統(tǒng)（美國HAVARD APPARAUTUS panlab 公司）；超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）。

圖1 SSA 化學結構Fig.1 SSA chemical structure

1.2 方法

1.2.1 分組和模型制備[9]將50 只小鼠隨機分為對照組（Control 組）10 只和造模組40 只。將造模組40 只小鼠制備噪音誘發(fā)耳鳴小鼠模型，將造模組小鼠均置于標準隔音室內，采用100 dB SPL 的寬頻帶噪聲（broadband noise，BBN）進行噪聲單次暴露2 h；為了避免實驗動物在暴露期間相互影響入耳聲強以及相互撕咬，將小鼠分別放置在長4.5 cm、寬4.5 cm、高8 cm 的鐵絲籠內，在不影響聲音傳播的同時小鼠能自由活動。將音響放在籠子前方進行實驗。造模成功標準：出現(xiàn)頭部搖晃、耳朵抖動、耳朵摩擦等耳鳴行為。Control 組小鼠置于相同的金屬籠中，并于標準隔音室內放置2 h，但關閉揚聲器。實驗結束各組小鼠均分籠飼養(yǎng)并進行后續(xù)檢測。

造模成功后將40 只小鼠隨機分為4 組，即噪音誘發(fā)耳鳴小鼠模型組（BBN 組）、BBN 組基礎上分別灌胃10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg 的柴胡皂苷A 干預，分別設為SSA-L 組、SSA-M 組和SSAH 組，每組10 只。Control 組和BBN 組小鼠均灌胃等量的生理鹽水。各組小鼠均每次灌胃1 次，連續(xù)灌胃28 d。

1.2.2 耳鳴行為學檢測各組小鼠分別于噪聲暴露2 h 后3 d、14 d、28 d 時進行耳鳴行為學測定。在進行前間隙抑制聽覺驚跳反應（gap prepulse inhibition of acoustic startle response，GPIAS）實驗之前，需要先讓小鼠在透明盒子中適應10 min。實驗過程中，將每只小鼠放置在一個透明盒子中，并將盒子放置在靈敏的壓電傳感器上。通過檢測小鼠肌肉動作幅度的波形，自動計算出相應的波幅，以進行實驗。GPIAS 實驗包括30 次有間隙試驗（gap 試驗）和30 次無前間隙試驗（no gap 試驗）采用隨機配對法消除有前間隙試驗和無前間隙試驗偏差。耳鳴行為學檢測以GPIAS 抑制率作為檢測指標，即

1.2.3 焦慮抑郁樣行為評估[10]每只小鼠于給藥后1 d，分別采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗來評估各組小鼠的焦慮抑郁情緒。實驗前1 h 將測試小鼠單籠單只放置于測試室內以適應環(huán)境，全部行為測定結束后將小鼠放回原始籠中。

（1）曠場實驗：制備5 個相同大小、內壁及底部均為白色的礦場箱，長寬均為45 cm，高為30 cm。將礦場儀器放于燈的正下方，面向箱壁將小鼠放于不同的礦場箱內中央與周圍區(qū)交界處，讓小鼠在礦場內自由活動10 min。取出測定后的小鼠放回籠內，將小鼠的排泄物清理干凈。礦場箱底部為25 個正方形，中間9 個正方形為中央區(qū)，采用視頻行為學系統(tǒng)采集并記錄小鼠進入中央區(qū)時間及在中央區(qū)距離。

（2）高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮由2 條開放臂、2 條閉合臂和1 個聯(lián)合4 條臂的中央區(qū)平臺組成，形狀呈十字形，各面均為白色。每個臂和平臺的距離為50 cm。為確保亮度相等，高架被置于燈的正下方，避免陰影。在測試中，將小鼠背對實驗員放置在中央區(qū)，面對其中一條開放臂。然后，讓小鼠在高架內自由活動5 min。測試結束后，將小鼠放回籠子中，并清理高架上的分泌物。在進行下一輪測試前，使用酒精擦拭干凈高架各部分。記錄小鼠進入開放臂次數(shù)及在開放臂的時間。

（3）強迫游泳實驗：進行小鼠強迫游泳測試時，需要使用直徑為16 cm、高為30 cm 的2 個玻璃燒杯，并在每個杯子加入溫度為28 ℃的水，深度達20 cm。然后將小鼠放置在其中1 個燒杯內，確保小鼠可以直立在水中，但尾巴不觸及杯底。觀察小鼠是否漂浮或擺動，并保持其頭部浮在水面，僅單下肢微顫狀態(tài)。借助手動計數(shù)器，在5 min 內記錄小鼠的不動時間。測試結束后將小鼠擦拭干凈后放回籠中。

1.2.4 ABR 閾值測定各組小鼠于藥物干預結束后36 h 測定聽力。進行小鼠ABR 閾值測試時，先在麻醉狀態(tài)下將記錄電極放置于顱頂皮下、參考電極放置在右耳乳突部皮膚下，接地電極放置在左耳同一位置。然后使用耳機依次刺激click 聲、8 kHz、16 kHz 和32 kHz 的純音，從70 dB 開始每降低10 dB，并在閾值附近改為5 dB 遞減。測定前五個波中最后一個消失的波確定閾值，并將被消失時的聲強數(shù)值與上一個仍有波的聲強數(shù)值取平均值作為閾值。在測定過程中要保持小鼠體溫并確保其舒適度。

1.2.5 RT-qPCR 檢測小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達3%戊巴比妥鈉腹腔注射30 mg/kg 麻醉小鼠，斷頭處死小鼠，取聽覺皮層組織研磨，加入1 mL TRIzol 裂解液裂解，提取裂解后細胞和組織中總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進行。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉錄為cDNA。瞬時離心各引物（引物序列見表1），在引物中加入去離子水并制成100 μmol/L 的液體，稀釋引物終濃度為10 μmol/L。按照以下條件擴增引物，預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 10 min；共30 個循環(huán)。用2-△△CT法分析表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 Western blot 檢測小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達麻醉并處死小鼠，取聽覺皮層組織，提取組織中總蛋白，用BCA 法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2 μg/mL，將蛋白溶液置于熱水中煮沸10 min，后保存在-20 ℃冰箱中。將30 μg 的蛋白樣品用200 V電壓電泳，通過電轉的方式將SDS-PAGE 分離膠中的蛋白質轉移到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，將一抗IL-6、TNF-α、IL-1β（1∶1 000）加入到PVDF 膜上，4 ℃孵育過夜；將PVDF 膜沖洗干凈后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光液加入到細胞中，曝光顯影后用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)使用Graphpad priam 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，并用均數(shù)±標準差（）表示計量資料。針對不同組間的數(shù)據(jù)，采用單因素方差（oneway ANOVA）分析來進行統(tǒng)計學比較。同時使用LSD-t檢驗來比較組間兩兩比較的差異。根據(jù)實驗結果，若P＜0.05，則表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠耳鳴行為學比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠在噪聲暴露2 h后3 d、14 d 和28 d 時GPIAS%值降低（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠在噪聲暴露2 h 后3 d、14 d 和28 d 時GPIAS%值升高，且呈劑量依賴（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠噪聲暴露2 h 后不同時間節(jié)點中GPIAS%值比較（，n=10）Tab.2 Comparison of GPIAS% values at different time points after 2-hour noise exposure in each group of mice（，n=10）

表2 各組小鼠噪聲暴露2 h 后不同時間節(jié)點中GPIAS%值比較（，n=10）Tab.2 Comparison of GPIAS% values at different time points after 2-hour noise exposure in each group of mice（，n=10）

*P＜0.05；與Control組相比，▲P＜0.05；與BBN組相比，#P＜ 0.05；與SSA-L組相比，△P＜0.05；與SSA-M組相比，☆P ＜0.05。

2.2 各組小鼠進入中央區(qū)時間和進入中央區(qū)距離比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠進入中央區(qū)時間和進入中央區(qū)距離均縮短（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組 和SSA-H 組小鼠進入中央區(qū)時間和進入中央區(qū)距離均增加，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠進入中央區(qū)時間和進入中央區(qū)距離比較Fig.2 Comparison of the time and distance of mice entering the central region in each group

2.3 各組小鼠進入開放臂次數(shù)及進入開放臂的時間比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠進入開放臂次數(shù)和時間均減少（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSAL 組、SSA-M 組和SSA-H 組小鼠進入開放臂次數(shù)和時間均增加，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠進入開放臂次數(shù)及進入開放臂的時間比較Fig.3 Comparison of the number of times and time of mice entering the open arm in each group

2.4 各組小鼠強迫游泳實驗不動時間比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠不動時間增加（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSAM 組和SSA-H 組小鼠不動時間均減少，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠強迫游泳實驗不動時間比較Fig.4 Comparison of immobility time in forced swimming experiments of mice in each group

2.5 各組小鼠ABR 閾值改變比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR閾值均降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值改變Fig.5 Changes in ABR threshold of mice in each group under Click and 8，16，and 32 kHz sound stimulation

2.6 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達均降低，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達比較Fig.6 IL-6 and TNF in the auditory cortex of mice in each group-α And IL-1 β MRNA expression comparison

2.7 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達比較

和Control 組相比，BBN 組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達均升高（P＜0.05）；和BBN 組相比，SSA-L 組、SSA-M 組和SSA-H組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達均降低，且呈劑量依賴（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β 蛋白表達比較Fig.7 IL-6 and TNF in the auditory cortex of mice in each group-α、IL-1 β Comparison of protein expression

3 討論

耳鳴是由多種因素共同作用的一種疾病，其患病率較高，目前臨床的治療方案效果不顯著且治愈率較低，嚴重影響患者的心理健康和生活質量[11]。目前，噪聲已成為導致青少年和大學生出現(xiàn)耳鳴的常見因素之一。寬頻白噪聲是人們日常生活中接觸最多的一種噪聲類型，因其以較均勻分布的能量播放所有頻率而備受關注。利用噪聲誘導耳鳴動物模型結合GPIAS 檢測方式，可更有效地模擬人類耳鳴，降低訓練時間成本，同時不對動物造成損傷，因此該方法可相對可靠地反應動物是否出現(xiàn)耳鳴行為[12]。本研究中采用了100 dB SPL 白噪聲環(huán)境中單次暴露2 h 后，發(fā)現(xiàn)了小鼠在3 d、14 d 和28 d 時間節(jié)點時GPIAS%值較Control組均降低，提示造模成功。100 dB SPL 寬頻噪聲誘發(fā)的耳鳴行為更顯著，可在毛細胞和聽覺中樞上產生明顯變化，從造模角度證明這類噪聲有利于構建穩(wěn)定、便捷的耳鳴動物模型，同時可有效節(jié)約時間。唐薇等[13]研究證實，100 dB SPL 寬頻帶白噪聲可能更適合高效、便捷地構建噪聲性耳鳴動物模型，且噪聲可能通過上調GAP-43 表達介導耳鳴的發(fā)生發(fā)展。

作為中國傳統(tǒng)中藥材之一，柴胡歷史悠久，并可根據(jù)形狀分為南柴胡和北柴胡。其具有多種功效，如和解少陽、疏肝解郁、熱血入室等。柴胡主要藥理活性成分包括柴胡皂苷A、B、C、D，其中柴胡皂苷A 具有較好的抗癲癇、抗抑郁和抗炎作用[14]。近年來發(fā)現(xiàn)[15]，盡管耳鳴的發(fā)病率較高，但只有少數(shù)患者（不到20%）會對其適應不良而嚴重影響生活質量，導致焦慮和抑郁等精神情緒障礙。本研究通過曠場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗來評估小鼠的焦慮抑郁情緒，結果發(fā)現(xiàn)耳鳴小鼠有明顯的抑郁行為、且聽力受到明顯損傷，柴胡皂苷A 干預后發(fā)現(xiàn)，小鼠的GPIAS%值、進入中央區(qū)時間、進入中央區(qū)距離、進入開放臂次數(shù)和時間均增加，小鼠不動時間及在Click 和8、16、32 kHz 聲刺激下ABR 閾值均減少，提示柴胡皂苷A 可明顯改善耳鳴小鼠的抑郁行為，保護耳鳴小鼠聽力。研究發(fā)現(xiàn)[16]，柴胡皂苷A 可以抑制利血平誘導的抑郁小鼠表現(xiàn)出的怠倦和上瞼下垂的現(xiàn)象。吳啟洋等[17]在強迫游泳實驗和懸尾實驗中發(fā)現(xiàn)，SSA 可以明顯改善表現(xiàn)絕望行為的抑郁小鼠，從而緩解其抑郁癥狀。

炎癥是一種免疫反應，通常是身體對傷害或感染的反應，其可導致身體產生一系列化學物質，包括炎癥因子，如細胞因子、趨化因子和炎癥介質。這些炎癥因子會引發(fā)免疫反應，促使白細胞和其他免疫細胞進入炎癥部位，以清除病原體或修復受損組織。近年來研究發(fā)現(xiàn)[18]，炎癥因子與耳鳴的發(fā)病機制可能存在一定的關聯(lián)。炎癥反應可以引發(fā)神經炎癥，導致神經元的損傷或異常興奮，可能會引起耳鳴的發(fā)生。此外，一些研究表明，炎癥因子的產生和釋放可能與聽覺系統(tǒng)的功能失調相關。Tetteh 等[19]在對一項慢性耳鳴患者的研究發(fā)現(xiàn)，放松訓練可顯著減少患者的焦慮抑郁和耳鳴，這些癥狀的減輕和血清中TNF-α、IL-6 等減少密切相關。目前，對于柴胡皂苷A 治療抑郁的機制研究主要關注于其對神經炎癥的抑制以及對腦源性神經營養(yǎng)因子、神經遞質和神經內分泌的調節(jié)。在抑郁過程中，抗炎性細胞因子和前炎性細胞因子都對其產生影響。其中，前炎性細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，在抑郁發(fā)病中起著重要的作用。研究表明[20]，SSA 可通過抑制海馬區(qū)IL-1β、IL-6、TNF-α 等表達發(fā)揮抗抑郁作用，表明SSA 抗抑郁的機制可能是通過介導圍絕經期海馬的神經炎癥介導的。本研究結果顯示，耳鳴小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達均升高，提示耳鳴小鼠存在神經炎癥，和上述研究結果一致；經過柴胡皂苷A 干預后發(fā)現(xiàn)，耳鳴小鼠聽覺皮層中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達均降低，提示柴胡皂苷A 可抑制耳鳴小鼠神經炎癥，進而改善耳鳴小鼠抑郁行為。

綜上所述，柴胡皂苷A 可改善耳鳴小鼠抑郁行為，對耳鳴發(fā)揮治療作用，其可能和抑制耳鳴小鼠聽覺皮層炎癥因子密切相關。由于時間和成本等因素，本研究未能給予陽性藥物進行干預，僅設置了和對照組比較，使文章的結果可能存在一定的局限性，在今后的研究中會增加相關的陽性對照分組，從而為臨床治療提供更真實有效的實驗依據(jù)。