基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討鐵皮石斛抗炎性衰老的作用

石苒羲 ，楊 濤 ，程 慶 ，趙梁辰 ，郭嘉暉 ，王利梅

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院;2）第一臨床醫(yī)學(xué)院;3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，云南 昆明 650500）

衰老是生物體不可逆轉(zhuǎn)的自然進(jìn)程，隨年齡增長(zhǎng)各系統(tǒng)功能出現(xiàn)退行性改變，其中便有免疫功能的退化[1]，使免疫細(xì)胞分化、增殖能力下降，出現(xiàn)表型改變和功能缺陷，促炎因子產(chǎn)生增加，血清中炎癥介質(zhì)水平升高[2-4]。2000 年，F(xiàn)ranceschi[5]第一次提出“炎性衰老”的概念，隨著年齡的增長(zhǎng)體內(nèi)各組織發(fā)生相關(guān)低度炎性反應(yīng)，被稱為炎性衰老[2，4]。在炎性衰老過(guò)程中有兩個(gè)重要的炎性因子IL-6 和IL-10[6-7]。IL-6 作為介導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成員[7-8]，通過(guò)促炎作用對(duì)機(jī)體造成影響，引起衰老帶來(lái)的如老年性癡呆、代謝紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化等年齡相關(guān)的健康問(wèn)題[9]，它的水平對(duì)多種疾病的診斷和嚴(yán)重程度判斷具有預(yù)測(cè)價(jià)值[8，10]，能作為炎癥感染的嚴(yán)重程度、預(yù)后判斷及老年人炎性衰老的預(yù)測(cè)指標(biāo)[6，11-12]。IL-10 是公認(rèn)的免疫抑制因子，具有很強(qiáng)的抗炎作用，可以抑制單核巨噬細(xì)胞的增殖和活性，使炎癥因子的合成與釋放得到有效抑制[13]，可以阻斷各種炎癥通路[14]，在慢性炎癥的發(fā)展過(guò)程中能起到一定的延緩作用，對(duì)減輕機(jī)體的炎癥損傷具有重要意義。老年小鼠對(duì)肺炎鏈球菌的先天免疫應(yīng)答與炎癥加劇中有數(shù)據(jù)表明，炎癥加劇與IL-10 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)減弱有關(guān)，具體表現(xiàn)在IL-10 濃度的降低[15]。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬草本植物，有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫等藥理作用，能夠有效防止亞健康，有延緩衰老的效果[16-18]。鐵皮石斛是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)免疫功能有增強(qiáng)的作用，能降低TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞炎癥[19-21]。衰老時(shí)體內(nèi)細(xì)胞因子改變使機(jī)體處于慢性低度炎性狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、減少炎癥反應(yīng)可達(dá)到抗炎性衰老的目的。石斛具有優(yōu)越的藥理作用，具有無(wú)毒、無(wú)致突變、無(wú)遺傳毒性的“三無(wú)”作用。石斛具有提高免疫、抗衰老的功效，但作用機(jī)制尚未被闡明。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)結(jié)合情況，預(yù)測(cè)石斛抗衰老的潛在機(jī)制，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為石斛抗衰老的后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 石斛抗炎性衰老網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 石斛主要成分檢索及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用ETCM 檢索石斛主要成分，通過(guò)Pubchem 查詢化合物SMILES 號(hào)，用SMILES 號(hào)在Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，獲得石斛主要成分作用靶點(diǎn)。將成分靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 中，構(gòu)建主要成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 石斛與衰老大鼠作用靶點(diǎn)篩選從Rat Genome Database（https://rgd.mcw.edu/）網(wǎng)站下載SD 衰老大鼠基因。將石斛主要成分作用靶點(diǎn)和衰老大鼠基因進(jìn)行交集，利用Venny 網(wǎng)站輸入二者信息，得到石斛主要成分作用于衰老大鼠的靶點(diǎn)。

1.1.3 蛋白-蛋白交聯(lián)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入交集基因，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件，根據(jù)Degree 值作圖。

1.1.4 靶點(diǎn)GO 和KEGG 富集通路分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集通路分析，得到富集信息。選擇P≤ 0.01 且位靠前列的20 條顯著通路，用富集的名字、GeneRatio、FDR、count 值通過(guò)微生信平臺(tái)構(gòu)建富集氣泡圖。

1.2 石斛活性成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用Cytoscape 軟件中Centiscape2.2 對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，主要參考 Betweenness、Closeness 和Degree 值選取靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件中cytoNCA 對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，degree ＞100，并參考相關(guān)文獻(xiàn)。從ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)下載主要藥物活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，保存為MOL2 格式，從UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)找到相應(yīng)蛋白并在AlphaFold Protein Structure Database 網(wǎng)站下載靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式，用pymol 對(duì)大分子進(jìn)行前處理。利用Autodock 軟件去水、加氫，對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)對(duì)接數(shù)值評(píng)價(jià)其活性，并利用pymol 進(jìn)行可視化展示。

1.3 石斛抗炎性衰老的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD 大鼠30 只，20 月齡，體重（300±20）g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，使用許可證號(hào)SYXK（滇）K2015-0002。經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：KMMU20220834。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配制鐵皮石斛粉末（含30%石斛多糖），陜西西安百川生物科技有限公司購(gòu)買，將蒸餾水與石斛粉末按1∶1 配制為溶液，4 ℃冰箱保存。百令膠囊0.5 g/粒，生產(chǎn)廠家杭州中美華東制藥有限公司，1∶20 配制為溶液，4 ℃冰箱保存。IL-6、IL-10 酶聯(lián)試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥自然衰老SD 雄性大鼠30 只，隨機(jī)分為5 組。分別為空白對(duì)照組、石斛組（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）、百令膠囊陽(yáng)性對(duì)照組（40 mg/kg）?？瞻讓?duì)照組每天灌胃蒸餾水，每組每天定時(shí)灌胃1 次，連續(xù)灌胃10 周。

1.3.4 取材及檢測(cè)方法心臟取血，血樣離心后取上清液待測(cè)。ELISA 測(cè)定時(shí)每孔加入50 μL 血清和100 μL HRP 酶標(biāo)記，37 ℃溫育60 min，稀釋洗滌液洗滌5 次并拍干。加入顯色劑A 和顯色劑B，37 ℃避光顯色15 min。最后加入終止液50 μL，以空白組調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)下依次測(cè)量各孔的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

網(wǎng)絡(luò)藥理數(shù)據(jù)通過(guò) Genecard、KEGG PATHWAY Database 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析。IL-6與IL-10 表達(dá)量數(shù)據(jù)用SPSS 軟件分析，結(jié)果用單因素方差檢驗(yàn)，最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石斛抗炎性衰老網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 石斛的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)檢索到石斛主要成分28 項(xiàng)，得到492 個(gè)作用靶點(diǎn)，見圖1A。綠色菱形代表活性成分，紫色橢圓形代表靶點(diǎn)。通過(guò)Venny 軟件，輸入成分靶點(diǎn)492 個(gè)，衰老大鼠基因413 個(gè)，繪制交集韋恩圖，見圖1B，獲得石斛對(duì)衰老大鼠的作用靶點(diǎn)共64 個(gè)。在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入交集基因靶點(diǎn)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1C，節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，邊代表兩兩之間互相作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)顏色越藍(lán)大小越大說(shuō)明越重要。顯示石斛抗炎性衰老的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)有AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果Fig.1 Network pharmacological analysis results

2.1.2 石斛主要成分對(duì)衰老大鼠GO 富集分析和KEGG 富集通路分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物富集分析得到GO 功能富集條目見圖2A～2C。結(jié)果顯示藥物作用于細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、核、線粒體等，與ATP 結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子結(jié)合、蛋白激酶C 活性等分子功能有關(guān)，參與蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過(guò)程、有機(jī)環(huán)狀化合物反應(yīng)、對(duì)脂多糖反應(yīng)、EPK1 和EPK2 級(jí)聯(lián)反應(yīng)正向調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、細(xì)胞遷移正向調(diào)節(jié)、肽基蘇氨酸磷酸化等生物過(guò)程，其中石斛參與生物過(guò)程中衰老最為顯著。

圖2 GO 分析和KEGG 分析結(jié)果Fig.2 GO analysis and KEGG analysis result

KEGG 富集到較為顯著20 條信號(hào)通路見圖2D，主要有：PI3K-AKT、Calcium、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1、Apelin、VEGF等信號(hào)通路，通路上多個(gè)基因與炎癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。PI3K-AKT 是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵通路。VEGF、HIF-1、Apelin 3 個(gè)信號(hào)通路中多個(gè)基因參與NO 的合成，間接影響炎性因子合成。在PI3K-AKT、RAP1 信號(hào)通路中，通過(guò)PI3K→AKT→NF-κB調(diào)節(jié)細(xì)胞因子合成促進(jìn)炎癥。在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 中，可能通過(guò)PKC 和AKT 調(diào)節(jié)NF-κB（相關(guān)通路PI3K-AKT 通路、鈣通路），間接調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α、IL-1 合成。

2.2 主要活性成分和核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

對(duì)靶點(diǎn)和成分進(jìn)行篩選，見表1、表2，Degree（節(jié)點(diǎn)的度值）表示與此節(jié)點(diǎn)有聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)的數(shù)量。對(duì)靶點(diǎn)AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B和成分齒葉黃皮素（Dentatin）、吳茱萸次堿（Rutaecarpine）、紫花前胡（Nodakenetin）、吳茱萸堿（Evodaiamine）分別進(jìn)行分子對(duì)接，見圖3、圖4、表3，紫色分子為靶點(diǎn)，綠色部分為靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合部位，藍(lán)色分子為活性成分。以結(jié)合能作為判斷成分與靶點(diǎn)結(jié)合能力大小的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能小于0 表示可以自由結(jié)合，越小更易發(fā)生結(jié)合。結(jié)合后出現(xiàn)氫鍵表示二者結(jié)合穩(wěn)定，提示較好的結(jié)合關(guān)系。結(jié)果顯示各成分與各靶點(diǎn)間均能形成數(shù)量不等的氫鍵，AKT1 與各活性成分、GSK3B與除紫花前胡外的成分、STAT3 和NOS3 與齒葉黃皮素、吳茱萸堿結(jié)合能均小于-5 KJ/mol，表示結(jié)合情況良好。

圖3 分子對(duì)接可視化局部圖Fig.3 Partial diagram of molecular docking

圖4 分子對(duì)接可視化整體圖Fig.4 Overall diagram of molecular docking

2.3 石斛對(duì)IL-6 與IL-10 蛋白表達(dá)的影響

ELISA 測(cè)得IL-6、IL-10 濃度，使用SPSS 軟件分析，見圖5。

圖5 不同給藥對(duì)IL-6、IL-10 的影響Fig.5 The effect of different susstances on the expression of IL-6、IL-10

中劑量組血清中IL-6 含量較空白組（P＜0.01）、百令組（P＜0.01）、低劑量組（P＜0.05）相比均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示中劑量石斛可以更好的降低IL-6 含量。低劑量組、高劑量組、百令組血清與空白組相比、高劑量組與低劑量組相比，IL-6 的含量也有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

低劑量組較空白組血清中IL-10 含量升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），較其它組含量升高但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低劑量石斛能更好的增加IL-10 含量。中劑量組、高劑量組、百令組與空白組相比、中劑量組與高劑量組與百令組相比，IL-10 含量增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選石斛主要活性成分，預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)和抗衰老作用機(jī)制，對(duì)石斛抗衰老的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，并通過(guò)分子對(duì)接和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，闡明了石斛抗炎性衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，可在實(shí)踐中為石斛的應(yīng)用提供新的啟示。

本研究檢索到石斛活性成分28 項(xiàng)，獲得潛在靶點(diǎn)492 個(gè)、交集靶點(diǎn)64 個(gè)。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)得到核心靶點(diǎn)有AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B，這4種蛋白都對(duì)炎癥通路具有調(diào)節(jié)作用。NF-κB可調(diào)節(jié)IL-6 的生成[22]，AKT1（蛋白激酶Bα）是其上游基因[23]，是PI3K 通路的中心環(huán)節(jié)，抑制AKT會(huì)使IL-6 表達(dá)下降[24]，而活化的STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）可激活NF-κB信號(hào)通路，加劇炎癥反應(yīng)[25]；GSK3B 是糖原合成酶激酶3β，其活性受AKT 的調(diào)節(jié)[26]，上升可以促進(jìn)IL-10合成增加；NOS3（一氧化碳合酶3）可誘導(dǎo)NO 合成來(lái)促進(jìn)IL-6 的生成[27]。對(duì)石斛成分進(jìn)行篩選得到齒葉黃皮素、紫花前胡、吳茱萸次堿、吳茱萸堿四種主要活性成分。紫花前胡可通過(guò)抑制NFκB信號(hào)通路而對(duì)炎癥有抑制作用[28]。吳茱萸堿是生物堿類的一種，可抑制巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子的產(chǎn)生，并減少中性粒細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，具有抗炎活性[29]。吳茱萸次堿可改善炎癥小鼠模型的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡[30]。

在KEGG 富集到的通路中，PI3K-AKT 是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，激活可以促進(jìn)炎癥。PI3KAKT、RAP1、AEG-RAGE、EGFR 等信號(hào)通路中抑制AKT 可對(duì)NF-κB調(diào)控使IL-6 表達(dá)下降[31]。在FOCAL ADHESION、PI3K-AKT、LIPID AND ATHEROSLEROSIS 等信號(hào)通路中，提升GSK3B活性可增加IL-10 轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，下調(diào)AKT 和NFκB的活性也可促進(jìn)IL-10 的轉(zhuǎn)錄，使體內(nèi)炎癥狀態(tài)得以抑制[26]。在 Apelin、LIPID AND ATHEROSLEROSIS、EGFR 等信號(hào)通路，抑制STAT3 活性可減少IL-6 生成[25]。VEGF、Apelin、HIF-1、Calcium 等信號(hào)通路 中NOS1、NOS2、NOS3 可促進(jìn)NO 合成，增強(qiáng)促炎介質(zhì)如IL6 和IL8 的合成，導(dǎo)致炎癥嚴(yán)重程度增加[32]，對(duì)NO進(jìn)行調(diào)節(jié)，可在一定程度上減緩炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，改變體內(nèi)炎性狀態(tài)。

分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT1 與各活性成分、GSK3B 與除紫花前胡外的其它成分、STAT3 和NOS3 與齒葉黃皮素、吳茱萸堿對(duì)接結(jié)果良好，表明石斛主要通過(guò)以上四種成分發(fā)揮抗炎性作用，主要作用靶點(diǎn)是AKT1。吳茱萸堿和吳茱萸次堿為抑炎物質(zhì)[29-30，33]與GSK3B 結(jié)合可促進(jìn)IL-10產(chǎn)生，吳茱萸堿還可與STAT3 作用抑制IL-6 生成。紫花前胡作用于AKT1 減少IL-6 的產(chǎn)生，也可間接調(diào)節(jié)GSK3B 活性進(jìn)而調(diào)節(jié)IL-10 表達(dá)[28]。結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，石斛組能降低血清中IL-6 的含量、增加血清中IL-10 的含量，石斛可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的含量來(lái)改善機(jī)體炎性狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)炎性衰老起延緩作用，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。但I(xiàn)L-6 含量與IL-10 含量變化沒(méi)有直接關(guān)系，說(shuō)明不同劑量石斛對(duì)IL-6、IL-10 的調(diào)節(jié)作用不同。

綜上，石斛可通過(guò)多通路、多基因?qū)?xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)而具有抗炎性衰老的功能。主要通過(guò)齒葉黃皮素、吳茱萸次堿、紫花前胡、吳茱萸堿等活性成分調(diào)控AKT1、STAT3、NOS3、GSK3B 等關(guān)鍵基因以及 PI3K-Akt、Calcium、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1、Apelin、VEGF 信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-6、IL-10 表達(dá)量來(lái)達(dá)到抗炎、抗衰老的作用。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)較小，結(jié)果是否存在普遍性還有待探究，同時(shí)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)是一個(gè)極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，不能較好地完全反映免疫功能的變化。實(shí)驗(yàn)針對(duì)鐵皮石斛的免疫調(diào)節(jié)研究仍處于比較淺顯的階段，僅證明了石斛下調(diào)促炎因子IL-6 的含量，上調(diào)抑炎因子IL-10 含量。但更深入的機(jī)制仍有待于繼續(xù)深入研究。