外源生殖激素對(duì)小鼠超數(shù)排卵及胚胎發(fā)育的影響

王巨龍,張繼輝,黎婷,張海燕,劉寬輝,許澤軍

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241003)

人工輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)是利用現(xiàn)代輔助醫(yī)學(xué)生殖技術(shù)手段在體外將精子與卵子結(jié)合,使不孕不育夫婦完成妊娠的技術(shù)[1].其中涉及超數(shù)排卵技術(shù)、體外人工受精術(shù)或顯微單精注射術(shù)、體外胚胎體外發(fā)育及胚胎移植等相關(guān)技術(shù).1977年,愛德華茲首次通過體外人工受精及胚胎移植技術(shù)應(yīng)用于人類生殖.該技術(shù)成功讓一對(duì)不育夫婦誕下一名健康的胎兒[2].近年來,隨著ART技術(shù)不斷完善發(fā)展,早期胚胎發(fā)育率及胚胎質(zhì)量得到很大提高,但早期胚胎發(fā)育仍是模擬體內(nèi)發(fā)育環(huán)境,勢(shì)必影響胚胎質(zhì)量,導(dǎo)致受精卵著床率低.為了獲取更優(yōu)質(zhì)的胚胎,往往采用超數(shù)排卵技術(shù)獲得較多成熟的卵子進(jìn)行體外受精.該技術(shù)通過外源性生殖激素注射雌性動(dòng)物,促使卵巢發(fā)育更多的卵泡并促使成熟卵子排出.超數(shù)排卵技術(shù)能較好地募集卵泡,獲取多的卵母細(xì)胞,利用輔助生殖技術(shù),大大增加妊娠的機(jī)會(huì),但在非自然的激素誘導(dǎo)下可能影響卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的質(zhì)量[3].已有的研究顯示,通過外源激素超數(shù)排卵獲取小鼠早期胚胎,在8 cell階段全基因組CpG甲基化水平顯著降低[4].與此同時(shí),超數(shù)排卵技術(shù)對(duì)父系印記基因H19及母系印記基因小核核糖核蛋白肽N (small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N,Snrpn),父系表達(dá)3 (paternally expressed 3,Peg3) DNA甲基化水平呈劑量依賴性改變[ 5 ].超數(shù)排卵引起表觀遺傳DNA甲基化水平波動(dòng),可能直接或間接影響胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá).一項(xiàng)針對(duì) ART 后出生的兒童的研究表明,DNA 甲基化的變化與多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄變化相關(guān)[6].本實(shí)驗(yàn)使用小鼠作為模型動(dòng)物,利用外源生殖激素孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)研究超數(shù)排卵對(duì)小鼠胚胎質(zhì)量及胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡雌性、12周齡雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)昆明白小鼠.小鼠飼養(yǎng)環(huán)境濕度保持50%～65%.光照時(shí)間為8∶00 ～20∶00,飼養(yǎng)溫度在20～25 ℃,自由采食、飲水.

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及藥品

CO2培養(yǎng)箱(德國Hera cell)、熒光定量PCR儀、熒光倒置顯微鏡(日本Nikon)、體視顯微鏡、HTF精子獲能液(Sigma)、胚胎培養(yǎng)液(KSOM+AA)、M2培養(yǎng)液(Sigma)、RNA微量試劑盒(QIAGEN )、微量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)、透明質(zhì)酸酶(Sigma)、石蠟油(Sigma)、35 mm培養(yǎng)皿(Sigma)、胎牛血清FBS(Gibco)、PMSG(寧波三生)、HCG(寧波三生)、DAPI染液及抗熒光淬滅封片液(碧云天)、生理鹽水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超數(shù)排卵及卵子獲取

選取6-8周齡的雌性昆明白小鼠,腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG),12 h后頸椎脫臼法將雌鼠處死,腹腔消毒,手術(shù)剪刀打開腹腔,沿著輸卵管找到輸卵管壺腹部,用剪刀將輸卵管及壺腹部剪掉,放入盛有生理鹽水培養(yǎng)皿中,在體視顯微鏡下,用尖頭鑷子將輸卵管壺腹部刺破,卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)流出.用撿卵針將COCs收集于M2培養(yǎng)液中.

1.2.2 成熟卵母細(xì)胞體外受精及胚胎培養(yǎng)

選擇12周齡以上的SPF級(jí)雄性昆明小鼠.取精前一周公鼠單獨(dú)飼養(yǎng),采用頸部脫臼處死,腹部噴灑酒精消毒,用剪刀剖開腹部找到睪丸位置.用剪刀取出附睪尾部及輸精管,并將輸精管及附睪尾剪成數(shù)段,用鑷子輕輕擠壓輸精管使精子擠入1000 μL過夜平衡的HTF中,放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中精子獲能 1.5～2.0 h.

將上述方法收集COCs,并將其轉(zhuǎn)移到100 μL HTF小滴中.獲能的精子濃度為1.5×106～2×106個(gè)/mL.孵育6 h后,將這些卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液(KSOM+AA)中,用石蠟油覆蓋,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)120 h,獲取囊胚.

1.2.3 體內(nèi)胚胎的收集

按上述1.2.1方法外源激素處理后,與公鼠1∶1合籠自然交配.交配的雌性小鼠于次日可觀察陰道栓,單籠飼養(yǎng)5 d后,頸部脫臼處死,獲取輸卵管、子宮,收集囊胚期胚胎.

1.2.4 囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)

將體外受精獲取的囊胚和超數(shù)排卵后體內(nèi)囊胚收集,并用Hoechst 33342染色10 min.然后壓片后,使用Fluoview 1000激光掃描共聚焦顯微鏡使用20倍物鏡獲得圖像.

1.2.5 RT-PCR胚胎相關(guān)基因的表達(dá)

采用RT-PCR檢測(cè)胚胎發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平,引物設(shè)計(jì)如下表,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin,引物由擎科創(chuàng)新生物公司合成.將實(shí)驗(yàn)獲取的囊胚,按照QIAGEN公司的RNA微量試劑盒(QIAGEN RNeasy Plus Micro Kit)說明提取總RNA,取2 μL檢測(cè)總RNA的濃度,要求RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之間,接著使用反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈試劑盒(Thermo)反轉(zhuǎn)錄成cDNA.RT-PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、SYBR Mix 5 μL、ddH2O 3 μL,總體系為10 μL.反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95 ℃,5 min.PCR為95 ℃,15 s、60 ℃,30 s、72 ℃,45 s,共44個(gè)循環(huán).

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一:不同劑量PMSG和HCG對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響

將雌性小鼠隨機(jī)分為6組,每組注射相同劑量的PMSG和HCG.注射劑量分別為1 IU、5 IU、10 IU、15 IU、20 IU,對(duì)照組注射生理鹽水.頸椎脫臼法將雌鼠處死,按照1.2.1方法統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率,成熟的卵母細(xì)胞以第一極體排出為標(biāo)志.

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二:外源生殖激素作用下對(duì)體內(nèi)胚胎和體外胚胎發(fā)育的影響

將雌性小鼠隨機(jī)分為3組,記作A、B、C組.根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一,確定最優(yōu)劑量組.A組為雌性小鼠注射生理鹽水后,與公鼠1∶1合籠自然交配.B組為雌性小鼠注射最優(yōu)劑量組,與公鼠1∶1合籠自然交配.C組為雌性注射最優(yōu)劑量組,獲取成熟卵母細(xì)胞體外受精,進(jìn)行體外胚胎發(fā)育.A、B組120 h后頸椎脫臼法將雌鼠處死,收集囊胚,統(tǒng)計(jì)胚胎數(shù)目并對(duì)胚胎發(fā)育相關(guān)基因檢測(cè).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)成熟卵母細(xì)胞以明顯第一極體排出為標(biāo)志,成熟率=成熟卵母細(xì)胞數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行LSD多重比較進(jìn)行顯著性分析.實(shí)驗(yàn)組至少有3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,*表示p<0.05差異顯著,**表示p<0.01差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源生殖激素對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響

由表1顯示,10 IU PMSG+10IU HCG劑量組、15 IU PMSG+15 IU HCG劑量組、20 IU PMSG+20 IU HCG劑量組平均獲得卵子總數(shù)為110枚、112枚、103枚,差異不顯著(p>0.05).但顯著高于(1+1)IU和(5+5)IU劑量組.其中10 IU PMSG和10 IU HCG處理獲得110枚卵母細(xì)胞,卵細(xì)胞成熟率與(1+1)IU、(5+5)IU和(15+15)IU劑量組相比差異顯著(p<0.05).由此可見,10 IU PMSG+10 IU HCG劑量組獲得卵母細(xì)胞質(zhì)量要優(yōu)于其他組合.

表1 不同濃度外源生殖激素對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響

2.2 外源生殖激素對(duì)體內(nèi)外受精胚發(fā)育的影響

為進(jìn)一步探究外源生殖激素PMSG和HCG對(duì)小鼠體內(nèi)外受精胚的影響,處理如表2所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,B組雌性小鼠注射10 IU PMSG和10 IU HCG后,與公鼠1∶1合籠自然交配獲得囊胚數(shù)與A組、C組相比差異顯著(p<0.05);A組與C組間胚胎細(xì)胞數(shù)差異極顯著(p<0.01).由上可知,在用外源生殖激素10 IU PMSG和10 IU HCG處理后自然交配獲得胚胎質(zhì)量最好.

表2 外源生殖激素對(duì)體內(nèi)外受精胚發(fā)育的影響

2.3 胚胎發(fā)育相關(guān)基因mRNA水平表達(dá)

對(duì)多能性基因檢測(cè)由圖1顯示,A組囊胚期胚胎,Pou5f1 mRNA水平顯著高于生殖激素處理交配B組與生殖激素處理體外人工受精C組(p<0.05),其中A、C組差異極顯著(p<0.01).B組與C組相比較,Sox2 mRNA表達(dá)水平上調(diào),且差異顯著(p<0.05).

注:*表示差異顯著p<0.05,**表示差異極顯著p<0.01

3 討 論

生殖激素PMSG 和HCG在牛[7]、豬[8]、羊[9]開展較多的研究和應(yīng)用,現(xiàn)廣泛用于動(dòng)物繁殖生產(chǎn).隨著技術(shù)的改進(jìn),人工輔助生殖技術(shù)已應(yīng)用于人類生殖健康.超數(shù)排卵作為ART關(guān)鍵技術(shù),受到許多因素的影響.在臨床上主要與種屬生理狀態(tài)、年齡、激素的種類及劑量相關(guān).有研究表明,激素劑量的大小,對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有關(guān),低劑量對(duì)卵巢刺激度小,卵泡發(fā)育低[10];高劑量往往會(huì)對(duì)卵巢過度刺激,可能會(huì)造成卵母細(xì)胞減數(shù)分裂期紡錘體組裝異常、卵子發(fā)育不正常甚至停止發(fā)育.Tain等人研究發(fā)現(xiàn),促排卵激素會(huì)過度刺激卵巢,造成卵母細(xì)胞發(fā)育異常率增加[11].周曉旭等研究顯示高劑量使用PMSG和HCG,小鼠的妊娠率及產(chǎn)仔數(shù)顯著下降[12].這些表明一定激素劑量與卵子質(zhì)量及胚胎質(zhì)量呈相關(guān)性.

我們利用不同濃度PMSG 和HCG處理小鼠,發(fā)現(xiàn)15-20 IU高劑量處理小鼠獲取卵子數(shù)量及成熟率顯著下降.低劑量組下,獲得卵子總數(shù)較少.這也印證低劑量激素促使卵巢卵泡發(fā)育能力有限.

調(diào)控胚胎發(fā)育相關(guān)基因能否正常表達(dá),關(guān)乎早期胚胎質(zhì)量及胚胎附植子宮.其中Sox2、Pou5f1便是調(diào)控其發(fā)育的關(guān)鍵基因.Pou5f1又稱Oct4,是POU轉(zhuǎn)錄因子家族重要的一員.研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物早期胚胎2 cell時(shí)期Oct4 mRNA表達(dá)水平高于囊胚期,Oct4正常表達(dá)可能是受精卵能否卵裂的關(guān)鍵[13].早期胚胎時(shí)期Sox2 mRNA在小鼠各階段表達(dá)各不同,囊胚期Sox2 mRNA維持高表達(dá)水平.

總之,本次利用外源激素對(duì)小鼠超數(shù)排卵及胚胎發(fā)育及相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):低劑量和高劑量的激素?zé)o法獲取適當(dāng)量的優(yōu)質(zhì)卵子.激素處理下小鼠體內(nèi)早期胚胎Pou5f1、Sox2 mRNA表達(dá)處于高水平狀態(tài),胚胎質(zhì)量較高.后期我們?nèi)孕枰M(jìn)一步探究外源性生殖激素對(duì)胚胎發(fā)育重要基因調(diào)控以及它對(duì)后續(xù)胚胎全期發(fā)育的影響.