神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

孫珊珊 于曦 翟秋月 于竹芹

(1 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)神經(jīng)內(nèi)科,山東 青島 266035; 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合中心; 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院松山醫(yī)院內(nèi)科)

隨著世界人口的老齡化,缺血性卒中的發(fā)病率逐年增加[1]。目前普遍認(rèn)為,腦缺血后血液供應(yīng)恢復(fù)對(duì)于挽救缺血區(qū)受損組織、降低缺血性卒中患者的殘疾率和病死率至關(guān)重要。然而,再灌注也會(huì)引起一系列細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),加重神經(jīng)血管損傷,導(dǎo)致血-腦屏障破壞和神經(jīng)細(xì)胞死亡,造成腦缺血再灌注損傷[2-4]。據(jù)報(bào)道,神經(jīng)調(diào)節(jié)素1β(NRG1β)在大腦海馬、大腦皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)等部位均有表達(dá),可減輕腦卒中后的腦損傷[5-6]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),NRG1β可通過調(diào)節(jié)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的JNK和Cdk5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]。最新研究表明,缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)[9-10]。GUAN等[11]指出,香芹酮可通過增強(qiáng)缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的表達(dá)來抑制鐵死亡,從而修復(fù)缺血再灌注損傷引起的海馬神經(jīng)元損傷。因此,抑制鐵死亡可能是干預(yù)腦缺血再灌注損傷的潛在治療方法?；谏鲜鲅芯?本研究將構(gòu)建PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型,旨在探討NRG1β對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC12細(xì)胞系購自上海iCell公司;CCK-8試劑盒、ROS熒光檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(GSSG)試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,β-actin抗體購自武漢Proteintech公司,GPX4抗體購買于成都正能生物有限公司。

1.2 OGD/R模型構(gòu)建及細(xì)胞分組

將PC12細(xì)胞接種于96孔板中,待匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)將原培養(yǎng)基(改良型RPMI培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)0.10的馬血清+體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清+10 g/L雙抗)更換為無糖RPMI-1640培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移至厭氧盒中(含體積分?jǐn)?shù)0.94 N2、體積分?jǐn)?shù)0.01 O2和體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2)繼續(xù)培養(yǎng)6 h完成氧糖剝奪后,更換為原培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱復(fù)氧(O2體積分?jǐn)?shù)0.21)培養(yǎng)48 h。然后將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組,每組均設(shè)置2個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組使用原培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h,模型組在復(fù)氧培養(yǎng)結(jié)束后,更換為原培養(yǎng)基處理48 h,干預(yù)組同樣更換為原培養(yǎng)基并且加入NRG1β(終濃度10 nmol/L)處理48 h。

1.3 各組細(xì)胞形態(tài)觀察及活力檢測(cè)

細(xì)胞OGD/R 48 h后,將孔板直接置于倒置顯微鏡下,觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。各組細(xì)胞處理結(jié)束后,以PBS洗滌孔板中的細(xì)胞2次,然后每孔中按照10∶1加入細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK8檢測(cè)液,置于培養(yǎng)箱37 ℃下孵育90 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度值,計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組吸光度均值-空白組吸光度均值)/(對(duì)照組吸光度均值-空白組吸光度均值)×100%。

1.4 細(xì)胞中活性氧(ROS)水平檢測(cè)

各組細(xì)胞處理結(jié)束后,以PBS洗滌細(xì)胞2次,然后每孔按DCFH-DA和PBS 1∶1 000比例加入稀釋好的DCFH-DA工作液(終濃度為10 μmol/L)100 μL,置于培養(yǎng)箱37 ℃下孵育20 min后,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,設(shè)置酶標(biāo)儀(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm),檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度來表示細(xì)胞中ROS水平。

1.5 細(xì)胞中MDA水平的檢測(cè)和GSH/GSSG吸光度比值的計(jì)算

各組細(xì)胞處理結(jié)束后,首先加適量RIPA充分裂解細(xì)胞,然后按照試劑盒說明書的要求,分別配置MDA和GSH/GSSG檢測(cè)所需試劑,并按照要求依次加入相關(guān)試劑。反應(yīng)完成后,以酶標(biāo)儀分別測(cè)定532 nm(MDA)和560 nm(GSH/GSSG)波長(zhǎng)處的吸光度值,并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各組細(xì)胞中MDA的相對(duì)含量和GSH/GSSG 吸光度比值。

1.6 透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

各組細(xì)胞處理結(jié)束后,將96孔板置于25 g/L的戊二醛中4 ℃下固定過夜,再經(jīng)10 g/L的鋨酸處理2 h,以PBS洗滌細(xì)胞3次,每次20 min;梯度乙醇脫水后,置于丙酮中滲透,于包埋板中完成包埋。采用超薄切片機(jī)將包埋烘干好的樣品以50 nm厚切片后置于銅網(wǎng)上,硝酸鉛和醋酸鈾染色,透射電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)水平

各組細(xì)胞處理結(jié)束后,加適量RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞,加入5×SDS煮沸后變性處理,BCA法檢測(cè)蛋白的濃度。根據(jù)配膠試劑盒說明書配制10%凝膠,加入10～20 μL各組細(xì)胞提取的蛋白樣品,100 V恒壓電泳后,120 V恒壓轉(zhuǎn)膜;然后依次用脫脂奶粉進(jìn)行封閉和β-actin及GPX4一抗孵育,次日,以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗孵育2 h后顯影。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以同一標(biāo)本的β-actin為內(nèi)參照,目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 3組細(xì)胞形態(tài)及活力比較

OGD/R 48 h后,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組PC12細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞透亮,生長(zhǎng)速度較快(圖1A);模型組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,可見部分死亡后漂浮的細(xì)胞(圖1B);與模型組相比,干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和速度均有改善(圖1C)。對(duì)照組、模型組和干預(yù)組細(xì)胞活力分別為91.09±1.44、62.18±2.49、71.69±2.35,3組比較差異有顯著性(F=48.031,P<0.01);與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞活力顯著降低(t=25.76,P<0.01);與模型組相比,干預(yù)組細(xì)胞活力顯著升高(t=8.03,P<0.05)。

a:對(duì)照組,B:模型組,C:干預(yù)組,100倍

2.2 3組細(xì)胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG 吸光度比值比較

熒光顯微鏡下觀察顯示,對(duì)照組細(xì)胞中綠色熒光較弱(圖2A),模型組細(xì)胞中綠色熒光較亮(圖2B),干預(yù)組細(xì)胞中綠色熒光變暗(圖2C)。酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示,3組PC12細(xì)胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG吸光度比值比較具有顯著差異(F=7.118～58.724,P<0.05);模型組細(xì)胞中ROS水平較對(duì)照組顯著升高(t=12.43,P<0.01),干預(yù)組細(xì)胞的ROS水平較模型組顯著降低(t=10.34,P<0.01),模型組細(xì)胞GSH/GSSG吸光度比值較對(duì)照組顯著降低(t=9.17,P<0.01),干預(yù)組較模型組顯著升高(t=15.71,P<0.01);模型組細(xì)胞中MDA水平相較于對(duì)照組顯著升高(t=29.46,P<0.01),干預(yù)組較模型組則顯著降低(t=2.96,P<0.05)。見表1。

a:對(duì)照組,B:模型組,C:干預(yù)組,DCFH-DA熒光染色,200倍

表1 3組細(xì)胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG吸光度比值比較

2.3 3組細(xì)胞中線粒體損傷情況比較

透射電鏡觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞中線粒體形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,線粒體嵴排列有序(圖3A);和對(duì)照組及干預(yù)組相比,模型組線粒體損傷較重,表現(xiàn)為線粒體內(nèi)膜破裂,線粒體嵴消失(圖3B);與模型組相比,干預(yù)組線粒體損傷得到一定改善(圖3C)。

A:對(duì)照組,B:模型組,C:干預(yù)組;鉛染色,上排放大倍數(shù)12 000倍,下排為上排黃色框中局部區(qū)域的放大(50 000倍);圖中黑色箭頭指示正常線粒體,紅色箭頭指示損傷線粒體

2.4 3組細(xì)胞中GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

Western blot方法檢測(cè)顯示,對(duì)照組、模型組和干預(yù)組細(xì)胞中GPX4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.58±0.02、0.75±0.07、1.09±0.09,3組比較差異具有顯著性(F=37.498,P<0.05);模型組細(xì)胞中GPX4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(t=23.06,P<0.01),干預(yù)組細(xì)胞中GPX4相對(duì)表達(dá)水平較模型組顯著升高(t=6.07,P<0.05)。見圖4。

圖4 3組細(xì)胞中GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

既往研究顯示,腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜病理生理過程,是興奮性毒性、鈣失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等相互作用的結(jié)果[12-13]。神經(jīng)保護(hù)劑治療可能是一種潛在的干預(yù)腦缺血再灌注損傷的策略。

NRG屬表皮生長(zhǎng)因子家族,通過激活ErbBs蛋白的受體絡(luò)氨酸激酶進(jìn)行一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而發(fā)揮生物學(xué)作用。根據(jù)編碼基因的不同,NRG可以分為NRG1～NRG4 4種同分異構(gòu)體[14]。NRG1β/ErbB4信號(hào)傳導(dǎo)與神經(jīng)元遷移、軸突引導(dǎo)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、軸突髓鞘化、發(fā)育中的突觸形成以及成人大腦突觸的可塑性有關(guān)[15]。NRG1β可以保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷,并且NRG1β通過抑制促炎反應(yīng)和PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本項(xiàng)目組前期的研究表明,在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中,NRG1β能夠通過抑制缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Cdk5信號(hào)通路,降低神經(jīng)元凋亡,減小腦梗死體積,改善大鼠的神經(jīng)行為[17]。

鐵死亡是一種非凋亡形式的細(xì)胞死亡,其特征是細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)ROS積累。鐵死亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為線粒體萎縮,線粒體嵴減少,內(nèi)膜壓縮,外膜破裂及細(xì)胞核完整,其發(fā)生與鐵、氨基酸和過氧化脂質(zhì)的代謝過程有關(guān)[18]。大量研究證明,神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡與缺血性腦卒中的病理生理過程密切相關(guān),抑制缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡可以減輕腦卒中后繼發(fā)性腦損傷,提示鐵死亡通路可能是腦卒中的潛在治療靶點(diǎn)[19]。此外,LAN等[20]研究發(fā)現(xiàn),中草藥腦泰方化合物也可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1/二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1以及溶質(zhì)載體家族7成員11/GPX4通路,減少缺血性卒中后的神經(jīng)元鐵死亡。值得注意的是,蒲公英醇通過誘導(dǎo)Nrf2核積累和鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4表達(dá),可顯著抑制OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中ROS和MDA的產(chǎn)生。由此推測(cè),蒲公英醇可能是通過調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元中Nrf2信號(hào)通路而使其免受氧化應(yīng)激和發(fā)生鐵死亡[19]。綜上所述,神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡可能是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制,但NRG1β是否通過調(diào)控鐵死亡發(fā)揮腦細(xì)胞保護(hù)作用尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞活力下降,干預(yù)組細(xì)胞活力得到改善,這提示NRG1β的干預(yù)治療可以改善PC12細(xì)胞損傷;同時(shí),熒光顯微鏡下觀察和酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組比較,經(jīng)NRG1β處理后,PC12細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度減弱,細(xì)胞中MDA水平顯著下降,GSH/GSSG吸光度比值顯著升高。由于細(xì)胞中ROS、MDA水平和GSH/GSSG吸光度比值與細(xì)胞鐵死亡密切相關(guān),因此干預(yù)組在一定程度上改善了受損PC12細(xì)胞的鐵死亡狀況。線粒體損傷是細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵形態(tài)學(xué)特征,本研究又進(jìn)一步對(duì)各組PC12細(xì)胞線粒體損傷情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,干預(yù)組和模型組相比,線粒體損傷程度得到改善。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了PC12細(xì)胞中抑制細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵蛋白GPX4的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,干預(yù)組GPX4的相對(duì)表達(dá)水平較模型組顯著升高,從而進(jìn)一步提示NRG1β干預(yù)治療可改善受損PC12細(xì)胞的鐵死亡程度[21]。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,NRG1β可以降低OGD/R模型PC12細(xì)胞的ROS、MDA水平以及GSH/GSSG吸光度比值,改善線粒體超微結(jié)構(gòu),上調(diào)細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4的表達(dá),表明NRG1β干預(yù)治療可能是通過影響受損PC12細(xì)胞的鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4的表達(dá)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的,本研究結(jié)果為探究NRG1β治療腦缺血再灌注損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者聲明：于竹芹、孫珊珊、翟秋月參與了研究設(shè)計(jì);孫珊珊、于曦、翟秋月、于竹芹參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。