茯苓四逆湯抑制TLR4/NF-κB通路改善慢性心衰大鼠心功能

張 夢, 李晶晶, 樊光輝

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院, 湖北 武漢 430000 2.湖北省武漢市第五醫(yī)院, 湖北 武漢 430000 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)/深圳大學(xué)附屬華南醫(yī)院, 廣州 深圳 518111)

慢性心力衰竭(簡稱心衰)是由心臟結(jié)構(gòu)或功能損害引起的心室充盈和/或射血功能障礙所致,以呼吸困難、乏力等為主要表現(xiàn),是大多數(shù)心血管疾病發(fā)展的最終階段[1]。目前臨床上常用強(qiáng)心劑、利尿劑等西藥及心臟移植、介入手術(shù)等非藥物治療方式治療慢性心衰,但均存在一定局限性[2]。近年,中醫(yī)藥治療慢性心衰獲得比較滿意效果。臨床研究發(fā)現(xiàn),茯苓四逆湯治療慢性心衰的有效性及安全性均較高[3]。但茯苓四逆湯在慢性心衰中的作用機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路激活可引發(fā)心肌炎癥,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和心肌病理損傷[4]。茯苓四逆湯通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕膿毒癥大鼠心肌損傷[5]。本研究旨在探討茯苓四逆湯對慢性心衰大鼠心功能的影響以及TLR4/NF-κB通路在此過程中的作用,以期為慢性心衰的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:72只SPF級雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～220g)購自武漢大學(xué)動物實驗中心【生產(chǎn)許可:SCXK(鄂)2019-0004】。本實驗嚴(yán)格遵循3R原則。

1.2藥物與試劑:茯苓四逆湯由茯苓、附子、人參、炙甘草、干姜5味中藥(張仲景大藥房)組成,中藥煎煮2次后合并,濃縮成水煎劑(生藥濃度3.6g/mL),備用;卡托普利(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H33021130);注射用鹽酸多柔比星(阿霉素)(深圳萬樂藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H44024359)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號:ER1393、ER1094、ER0042);TUNEL凋亡檢測試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司,貨號:IBO2707G);TLR4、GAPDH抗體(美國abcam公司,貨號:ab217274、ab22555);p-NF-κB、NF-κB抗體(美國Invitrogen公司,貨號:PA5-118566、PA5-27617);核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、p-IκBα抗體(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:K18362-ZKS、K21377-FJR)。

1.3主要儀器:寵羨動物用便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(南京云石醫(yī)療科技有限公司);Sunrise酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司);E100光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司);ZF-268型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海金鵬分析儀器有限公司)。

1.4造模、分組及給藥:采用腹腔注射阿霉素法復(fù)制慢性心衰大鼠模型:阿霉素注射劑量第1、3、9、11、13和15天為1mg/kg,第5和7天為2mg/kg,注射體積為1mL。12只腹腔注射等體積生理鹽水大鼠作為對照組。末次注射一周后,使用超聲測量心功能指標(biāo):左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。根據(jù)大鼠一般行為體征(體重下降、精神萎靡等)和心功能指標(biāo)(LVEF<60%)判斷造模成功與否。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組。給藥劑量根據(jù)人和大鼠等效劑量換算公式計算,200g大鼠茯苓四逆湯等效劑量折算為6g/kg,卡托普利等效劑量折算為2.25mg/kg。茯苓四逆湯低、中、高劑量組分別給予茯苓四逆湯等效劑量的1、2、3倍(6g/kg、12g/kg、18g/kg);卡托普利組給予卡托普利2.25mg/kg;模型組和對照組給予等體積蒸餾水。1次/d,2mL/次,連續(xù)灌胃4周。

1.5超聲心電圖檢測心功能指標(biāo):給藥結(jié)束后,麻醉大鼠并呈仰臥位固定在操作臺上,將彩色多普勒超聲診斷儀的探頭置于左胸前,使用二維超聲心動圖顯示左心室的長軸,獲取LVEF、LVFS、LVESD、LVEDD。

1.6ELISA法檢測血清炎性因子水平:超聲檢查結(jié)束后,腹主動脈取血5mL,離心分離血清,參照ELISA試劑盒說明操作,獲取光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.7HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變:取血后迅速摘取心臟,PBS洗滌后一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定,另一部分置于-80℃保存。固定24h后的心肌組織進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋以及切片(4μm);將切片脫蠟、水合后依次放入蘇木素和伊紅染液中;光學(xué)顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變。

1.8TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡率:將切片進(jìn)行脫蠟、水合后添加TdT酶反應(yīng)液37℃孵育1h;添加熒光標(biāo)記液避光孵育20min;DAPI染核;光學(xué)顯微鏡觀察并拍照,隨機(jī)選取5個視野計數(shù)凋亡細(xì)胞(綠色熒光),計算凋亡率。

1.9Western blot檢測心肌組織中TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá):取出-80℃保存的心肌組織,添加RIPA裂解液充分裂解以獲取總蛋白;將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致,蛋白變性后每泳道上樣20μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳;切膠后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5% BSA對膜封閉2h;添加一抗(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜,洗滌后添加二抗(1∶5000稀釋);化學(xué)發(fā)光試劑顯色。分析蛋白條帶灰度(Image J軟件),GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1茯苓四逆湯對慢性心衰大鼠心功能的影響:與對照組比較,模型組大鼠LVEF、LVFS降低,LVESD、LVEDD升高(P<0.05);與模型組比較,茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組大鼠LVEF、LVFS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠LVEF LVFS LVESD LVEDD比較

2.2茯苓四逆湯對慢性心衰大鼠心肌損傷的影響:HE染色顯示,對照組大鼠心肌無明顯異常;模型組大鼠心肌纖維排列不規(guī)則且明顯斷裂,細(xì)胞核皺縮、水腫,存在大量炎性細(xì)胞浸潤;茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組大鼠心肌纖維呈不規(guī)則排列,但僅部分出現(xiàn)斷裂和細(xì)胞水腫、壞死,存在少量炎性細(xì)胞浸潤,且隨著茯苓四逆湯劑量增加,心肌損傷程度逐漸減輕。見圖1。TUNEL染色顯示,對照組大鼠心肌組織中幾乎看不到呈綠色熒光的細(xì)胞;模型組可見大量呈綠色熒光細(xì)胞,心肌細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05);茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組可見少量呈綠色熒光的細(xì)胞,心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組(P<0.05),見圖2、表2。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變(HE染色,×400)

圖2 各組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.3茯苓四逆湯對慢性心衰大鼠血清炎性因子的影響:模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于對照組(P<0.05);而與模型組比較,茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α IL-1β IL-6水平比較

2.4茯苓四逆湯對慢性心衰大鼠心肌組織中TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響:模型組大鼠心肌組織中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05);而與模型組比較,茯苓四逆湯低、中、高劑量組和卡托普利組大鼠心肌組織中上述蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠心肌組織中TLR4、p-NF-κB、NF-κB、p-IκBα、IκBα蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠心肌組織中TLR4 p-NF-κB/NF-κB p-IκBα/IκBα蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為心衰主要是由于氣血虧虛、心氣不足、心體損傷等所致,屬于怔忡、心悸、痰飲、喘癥、水腫、心水等范疇。心功能異常及心肌損傷是慢性心衰的主要病理體現(xiàn),具體表現(xiàn)為心室收縮和舒張功能障礙、射血分?jǐn)?shù)降低以及心肌細(xì)胞過度凋亡等[6-7]。本研究中模型大鼠LVEF、LVFS降低,LVESD、LVEDD以及心肌細(xì)胞凋亡率升高,且心肌組織出現(xiàn)明顯病理損傷。提示本研究成功復(fù)制了慢性心衰大鼠模型,可用于藥物治療效果的研究。

中醫(yī)藥以“權(quán)衡緩急,補(bǔ)虛瀉實”為慢性心衰的治療原則。茯苓四逆湯是一種中藥方劑,出自《傷寒論》,由四逆湯加茯苓、人參組成,具有回陽益陰之功效。茯苓四逆湯方中茯苓健脾利水消腫且能安神除燥;人參益氣生津養(yǎng)陰;干姜辛熱,回陽通脈,溫陽守中,與附子、炙甘草合用能夠增強(qiáng)回陽救逆、益氣固脫之功。本研究使用茯苓四逆湯治療后,慢性心衰大鼠LVEF、LVFS升高,LVESD、LVEDD以及心肌細(xì)胞凋亡率降低,且心肌組織病理損傷程度有所減輕,與陽性藥物卡托普利的作用效果一致。提示茯苓四逆湯能夠有效改善慢性心衰大鼠心功能及心肌損傷。以上結(jié)果表明,茯苓四逆湯對慢性心衰具有較好的治療效果,但其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

炎癥是慢性心衰的發(fā)病機(jī)制之一,且炎癥相關(guān)細(xì)胞因子常作為慢性心衰的治療靶點(diǎn)[8-9]。本研究中,慢性心衰大鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高,且心肌組織中存在大量炎性細(xì)胞浸潤,提示慢性心衰大鼠除存在心肌炎癥外,還存在全身炎癥。而茯苓四逆湯可降低慢性心衰大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,且改善心肌組織中炎性細(xì)胞浸潤,提示茯苓四逆湯能夠減輕慢性心衰大鼠的局部和全身炎癥反應(yīng)。TLR4是心肌組織中分泌最多的TLR蛋白,在心肌炎癥中起關(guān)鍵作用,TLR4激活能夠?qū)е翹F-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,同時誘導(dǎo)NF-κB和IκBα磷酸化,從而促進(jìn)炎性因子合成與釋放,引發(fā)炎癥[10]。本研究中,茯苓四逆湯減輕了慢性心衰大鼠心肌組織中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα蛋白表達(dá)水平的上調(diào),提示茯苓四逆湯可能通過抑制TLR4/NF-κB通路激活降低慢性心衰大鼠中炎癥反應(yīng)。

綜上所述,茯苓四逆湯能夠抑制TLR4/NF-κB通路激活,減輕慢性心衰大鼠心肌損傷,改善心功能,為臨床中醫(yī)藥治療慢性心衰提供了一定的理論依據(jù)。