應用全外顯子測序?qū)?例白化病家系遺傳病因分析及產(chǎn)前診斷*

徐 盈,石潤茜,郭芬芬,張建芳,黎 昱,宋婷婷,鄭 嬌,沈宇杰,李遠鳳,黨穎慧,楊 紅

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032)

白化病是一種眼睛、皮膚和(或)頭發(fā)的黑色素生物合成紊亂的罕見遺傳性疾病,尚無法治愈,目前僅通過手術(shù)或藥物來優(yōu)化視力和保護皮膚[1]。該病主要特征是不同程度的色素減退和眼球震顫、中心凹發(fā)育不全和視神經(jīng)的視交叉錯行[1-2]。根據(jù)臨床癥狀分為眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism,OCA)和僅眼部色素缺乏的眼白化病(ocular albinism,OA)兩大類。分子研究確定了導致白化病的至少20個基因變異,其中與OCA表型相關的7個基因(TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2、SLC24A5、C10orf11和DCT)以及近緣和散發(fā)性白化病中的一個基因座(OCA5)。OCA的并發(fā)癥導致皮膚癌和各種綜合征,如Hermansky-Pudlak綜合征(Hermansky-Pudlak syndrome,HPS)、Chediak-Higashi綜合征(Chediak-Higashi syndrome,CHS)[3]。世界范圍內(nèi)OCA的患病率約為1/17000,變異攜帶率約為1/65[4]。本研究通過全外顯子測序技術(shù)和Sanger測序?qū)?例白化病家系進行基因檢測,并根據(jù)結(jié)果進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

1 資料與方法

1.1 樣本采集 根據(jù)受檢者病史及臨床表現(xiàn),考慮可能存在遺傳性疾病,獲得患者及親屬知情同意后,采集患者及其父母的樣本送檢進行基因測序。DNA基因組提取試劑盒提取患者DNA,并用核酸濃度測定儀NanoDrop 2000進行DNA濃度測定,-20℃保存。無菌消毒條件下,超聲診斷儀引導下經(jīng)腹壁行絨毛活檢術(shù)/羊膜腔穿刺術(shù)獲取胎兒樣本。所有程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:KY202003044-1),檢測者簽署知情同意書。

1.2 全外顯子測序 采用Covaris超聲打斷儀獲得片段化DNA,通過靶基因特異性探針雜交、鏈霉親和素磁珠捕獲、PCR擴增方法從全基因組文庫中捕獲并富集靶基因片段,構(gòu)建靶基因文庫。采用Illumina高通量測序平臺對先證者及其父母進行人類全外顯子組測序。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit及配套儀器測定捕獲文庫濃度,用NanoDrop光光度計(ND-1000 V3.7.1;Thermo Fisher)檢測質(zhì)量,通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA降解進行質(zhì)控,測序平均深度100×。測序結(jié)果與參考基因組序列GRCh37/hg19進行對比,根據(jù)對比結(jié)果對變異位點進行注釋。應用千人基因組數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫、gnomAD、ClinVar數(shù)據(jù)庫篩選可疑致病位點。致病性分析根據(jù)polyphen2、Mutation Taster預測軟件,獲得候選致病變異。

1.3 Sanger測序 對全外顯子測序鑒定的候選致病變異位點設計引物,PCR擴增DNA樣本,產(chǎn)物純化進行Sanger測序驗證。設計白化病的致病基因的外顯子及其側(cè)翼序列的引物,PCR反應程序:開始(預變性95℃ 5min);降落(變性94℃ 30s;退火58.5～52.5℃ 35s,延伸72℃ 45s,循環(huán)12次);擴增(變性94℃ 30s;退火53.5℃ 30s,延伸72℃ 45s,循環(huán)30次);最終延伸(72℃ 10min)。PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司直接測序。測序數(shù)據(jù)采用3500DX data Collection V1.0和Sequencing Analysis 5.4軟件進行分析。

1.4 生物信息學分析 千人數(shù)據(jù)庫、EXAC數(shù)據(jù)庫、gnomAD等數(shù)據(jù)庫分析變異頻率;利用Clustal Omega軟件分析不同物種間氨基酸序列保守性;應用PyMOL軟件對野生型及變異型蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預測,對比兩種結(jié)構(gòu)差異,評估變異對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 全外顯子測序聯(lián)合Sanger測序結(jié)果 因家系1～3未獲得先證者樣本,應用全外顯子測序方法對3對夫妻雙方樣本進行致病基因篩查。結(jié)果顯示,家系1女方樣本存在TYR基因(NM_000372.5)c.1184G>A(p.Ser395Asn)雜合變異,男方樣本存在TYR基因c.929dupC(p.Arg311fs)雜合變異。家系2女方樣本存在TYR基因c.929dupC(p.Arg311LysfsTer7)雜合變異,男方樣本存在TYR基因c.61C>T(p.Pro21Ser)雜合變異。家系3女方樣本存在TYR基因c.1112_1113del(p.Asn371Argfs)雜合變異,男方樣本存在TYR基因c.929dupC(p.Arg311fs)的雜合變異。家系4女方患者在OCA2基因上(NM_000275)發(fā)現(xiàn)c.1001C>T(p.Ala334Val)和c.2051T>G(p.Phe684Cys)復合雜合變異。家系5男方患者樣本存在HPS1基因(NM_000195)c.972dupC(p.Met325HisfsTer128)和c.1932delC(p.Tyr645Thrfs)復合雜合變異(表1)。

表1 5例白化病家系的病史及其鑒定結(jié)果

2.2 變異致病性分析 家系1～3均發(fā)現(xiàn)TYR c.929dupC(p.Arg311fs)移碼變異,該變異導致氨基酸編碼鏈的改變,導致編碼蛋白功能喪失,該變異的致病性已有文獻報道[5]。根據(jù)ACMG指南,該變異為致病性變異。TYR c.1184G>A(p.Ser395Asn)為錯義變異,在千人基因組中未發(fā)現(xiàn),在EXAC和gnomADs數(shù)據(jù)庫中的頻率分別為8.252e-06、4.069e-06,均為低頻變異。白化病患者中,該變異反式位置上檢測到致病或可能致病變異[6],Clustal Omega軟件分析發(fā)現(xiàn),該位點在不同物種間保守性高;PyMOL軟件分析該位點的變異會導致氨基酸所形成氫鍵分子間相互作用力改變;polyphen2和Mutation Taster軟件預測該變異是有害的,綜上該變異為臨床意義未明的變異。家系2發(fā)現(xiàn)TYR c.61C>T(p.Pro21Ser)變異,該變異為錯義變異,在千人基因組中未發(fā)現(xiàn),在EXAC和gnomADs數(shù)據(jù)庫中的頻率分別為4.943e-05、3.655e-05均為低頻變異,多種預測軟件分析均為有害。白化病患者中,該變異反式位置上檢測到致病或可能致病變異[7-8],根據(jù)ACMG指南,判定為致病性變異。家系3發(fā)現(xiàn)TYR c.1112_1113del(p.Asn371Argfs)為移碼變異,導致編碼蛋白功能喪失,正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)該變異,Mutation Taster軟件預測該變異是有害的,判定為可能致病性變異(圖1)。家系4攜帶OCA2 c.1001C>T(p.Ala334Val)和c.2051T>G(p.Phe684Cys)兩個變異為錯義變異,在千人基因組中未發(fā)現(xiàn),在EXAC和gnomADs數(shù)據(jù)庫中的頻率為低頻變異,多種預測軟件分析均為有害。在白化病患者中,該變異反式位置上檢測到致病或可能致病變異[9-11],綜合判斷均為可能致病性變異。家系5攜帶HPS1c.972dupC(p.Met325HisfsTer128)和c.1932delC(p.Tyr645Thrfs)兩個變異為移碼變異,兩個變異的致病性已有文獻報道[12],根據(jù)ACMG指南,該變異為致病性變異(圖2)。見表1。

圖1 TYR基因變異致病性分析

圖2 OCA2和HPS1基因變異致病性分析

2.3 產(chǎn)前診斷及妊娠結(jié)局 根據(jù)白化病家系成員意愿及再次妊娠情況,對2例胎兒進行產(chǎn)前基因診斷,其中病例3孕10周通過絨毛活檢術(shù)取胎兒絨毛組織標本進行TYR基因檢測,未發(fā)現(xiàn)TYR異常變異,39+3周足月順產(chǎn)1女,出生后隨訪6個月臨床表型正常。病例4孕18周行羊水穿刺術(shù)取羊水樣本,結(jié)果顯示胎兒攜帶c.2051T>G(p.Phe684Cys)雜合變異,不發(fā)病,出生后隨訪1年臨床表型正常(圖3)。

圖3 白化病家系產(chǎn)前診斷結(jié)果

3 討 論

白化病是一種臨床和遺傳異質(zhì)性疾病,以不同程度的色素沉著、眼球震顫、中央凹發(fā)育不全和視神經(jīng)交叉走錯為特征。白化病通常與血液、免疫、肺、消化和神經(jīng)異常有關[13-14],目前尚無有效的治療方法?；颊叩呐R床表型尤其是皮膚和眼表型異質(zhì)性阻礙了表型-基因型相關性的建立[15]。難以區(qū)分的臨床表型和不同基因的參與,使分子診斷成為準確識別白化病類型和嚴重程度的重要工具。Lasseaux等[16]通過NGS測序和高分辨率比較基因組雜交技術(shù)篩選了990例白化病患者的19個已知白化病基因,共鑒定出243個新的致病變異。本研究發(fā)現(xiàn)四種類型TYR基因變異,其中TYR c.929dupC(p.Arg311fs)是較常見的導致白化病的變異位點,c.1184G>A(p.Ser395Asn)、c.61C>T(p.Pro21Ser)、c.1112_1113del(p.Asn371Argfs)分別與和c.929dupC(p.Arg311fs)構(gòu)成復合雜合變異是導致家系1～3患病的重要原因。另外,在家系4中發(fā)現(xiàn)OCA2 c.1001C>T(p.Ala334Val)和c.2051T>G(p.Phe684Cys)兩個錯義突變。研究表明,全世界約30%的病例由OCA2基因變異引起。該基因編碼OCA2黑素體跨膜蛋白P,是參與小分子轉(zhuǎn)運的完整膜蛋白,尤其作用于酪氨酸,其是黑色素合成的前體[17]。在病例5受檢者樣本上發(fā)現(xiàn)HPS1基因c.972dupC和c.1932delC的復合雜合變異。受檢者兩個變異分別遺傳自其父母,其父母均只攜帶其中一個雜合變異。Hermansky-Pudlak綜合征(HPS)的特征是多個組織特異性溶酶體相關細胞器的缺陷,通常表現(xiàn)為眼部皮膚白化病或眼部白化病、出血傾向,在某些情況下還伴有肺纖維化、炎癥性腸病或免疫缺陷,神經(jīng)心理障礙[18]。

本研究5個家系中有3個未獲得先證者樣本,在臨床診療中,單基因病家系往往存在先證者已死亡或其他特殊原因無法獲得樣本的可能性。對未獲得先證者樣本的家系,全面收集臨床資料至關重要,包括臨床表型、家族史、婚育史、生化、影像學檢查資料以及父母雙方基因型等,以此來推斷先證者的基因型。白化病panel檢測疾病范圍相對較有限,仍存在無法準確判斷先證者致病基因的可能。此外,本研究中部分家系患者臨床表型不特異且均有生育的需求,故所有家系采用全外顯子測序技術(shù),目的是通過更全面的測序數(shù)據(jù)分析關聯(lián)疾病和未關聯(lián)疾病的基因變異情況,能較全面地評估家系的風險基因,從而對再次妊娠做到優(yōu)生指導。

白化病高風險家系對于進行產(chǎn)前診斷具有極其強烈的意愿。Xu等[19]對40個白化病家系進行診斷,觀察到白化病最常見的基因類型是OCA1,其次是OCA2、OCA4和OCA3,對20例胎兒進行產(chǎn)前診斷,隨訪后胎兒臨床表型與產(chǎn)前遺傳診斷預測一致。Xu等[20]采用Sanger測序和全外顯子組測序?qū)?0例非近親血緣關系的中國白化病患者進行基因診斷,同時為6個白化病家族提供了產(chǎn)前診斷,分別在85%、10%和5%的患者中檢測到TYR、OCA2和HPS1變異;對6個胎兒進行檢測,其中3個攜帶者胎兒、2個正常胎兒和1個患病胎兒,出生后隨訪結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致(1例妊娠終止胎兒未隨訪)。楊玉姣等[21]對6例白化病高危胎兒進行了產(chǎn)前診斷,4例胎兒為攜帶者,1例正常胎兒,1例白化病胎兒。本研究中對2例孕婦進行產(chǎn)前基因診斷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例攜帶者,1例正常。再次妊娠仍為異常胎兒的夫妻往往承受著巨大的心理壓力,可考慮推薦試管嬰兒結(jié)合胚胎植入前單基因遺傳學檢測(IVF-PGT-M)。Yahalom等[22]對無親緣關系的10例白化病的母親進行PGD檢查,該10對夫婦共經(jīng)歷了28個IVF/PGD周期,結(jié)果7個未受影響的孩子出生。通過產(chǎn)前診斷和胚胎植入前遺傳學檢測,可對高風險家系采取早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療。

總之,通過全外顯子測序技術(shù)和Sanger測序?qū)哂邪谆￡栃约易迨返漠a(chǎn)婦采取基因檢測策略,可快速、準確做出判斷,為其進一步產(chǎn)前診斷或輔助生殖提供可能和有效的保證。