芯片式數(shù)字PCR 檢測禽流感病毒方法的性能驗(yàn)證

嚴(yán)謹(jǐn) 姜欣余 閻琪 陳小鳳

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，利用脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）聚合酶擴(kuò)增DNA 片段。自20 世紀(jì)80 年代初發(fā)明以來，PCR 已成為檢測微生物不可或缺的工具。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是傳統(tǒng)PCR的改進(jìn)型生物技術(shù)，可以擴(kuò)增和直接定量DNA。1992 年，Sykes 提出了dPCR 的概念，它通過泊松分布和稀釋模板來量化DNA 分子到單分子水平［1］。Volgelstein 和Kinzler 在1999 年首次將dPCR 應(yīng)用于研究中，通過一系列四個(gè)96 孔板，對(duì)結(jié)直腸癌患者樣品進(jìn)行物理分區(qū)，以檢測ras 癌基因中的突變［2］。近年來，隨著微流控技術(shù)日臻成熟，基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR（chip-based digital PCR）技術(shù)得到了快速發(fā)展，在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、病毒微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及二代測序等方面均得到廣泛的應(yīng)用。

禽流感病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技 術(shù)（Quantitative real-time PCR，qPCR）［3］，qPCR 方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量和較高靈敏度，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受樣品抑制劑影響，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，在低濃度樣品中精確度較低，且主觀性強(qiáng)，量化取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線［4-5］。作為新興PCR 平臺(tái)的dPCR，具有更高的抑制劑耐受性，且它是終點(diǎn)法測量，較少依賴于PCR 擴(kuò)增效率［6-7］。其原理是將一個(gè)PCR 混合物分離成許多獨(dú)立的納升級(jí)亞反應(yīng)，單個(gè)分區(qū)有少量或沒有目標(biāo)序列。PCR 完成后，確定每個(gè)樣本的陽性和陰性分區(qū)的比例，并通過泊松統(tǒng)計(jì)來計(jì)算核酸絕對(duì)拷貝數(shù)［8］。由于分區(qū)被計(jì)數(shù)為正數(shù)或負(fù)數(shù)的二進(jìn)制性質(zhì)，使量化更加簡單。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

甲型流感標(biāo)準(zhǔn)品是由本單位儲(chǔ)藏，濃度為1×107copies/mL 的質(zhì)粒，并保存于-80℃超低溫冰箱；根據(jù)重慶市禽流感監(jiān)測方案，于2022 年1 月采集的人和加新農(nóng)貿(mào)市場禽流感外環(huán)境標(biāo)本31 份。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑與儀器：甲型流感病毒檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）、甲型流感病毒試劑盒（數(shù)字PCR 法）（均購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；核酸提取試劑盒（購自中元公司）；dPCR 系統(tǒng)（購自新加坡JN MEDSYS 公司）；核酸提取儀（購自碩世公司）；生物安全柜、PCR 擴(kuò)增儀（均購自美國Thermo 公司）；振蕩器（購自德國Eppendorf 公司）；移液器（購自瑞士METTLER TOLEDO 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、病毒基因組提取

禽流感標(biāo)本從農(nóng)貿(mào)市場攤販的案板、籠具及刀具表面和禽類排泄物中涂抹采集到病毒采樣管中，取200 μL 采樣液用病毒核酸提取試劑盒抽提禽流感病毒基因組RNA。

1.2.2 反應(yīng)體系配制、微反應(yīng)制備

Clarity dPCR 系統(tǒng)應(yīng)用了一種獨(dú)特的管內(nèi)芯片格式，通過使用自動(dòng)裝載器同時(shí)裝載和劃分8 個(gè)反應(yīng)混合物，可以高效快速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨后用密封增強(qiáng)劑和密封流體將反應(yīng)混合物密封在隔板中。接著，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行熱循環(huán)。熱循環(huán)后，管條被轉(zhuǎn)移到Clarity 閱讀器中，以檢測隔板中的熒光信號(hào)。最后，通過Clarity 軟件分析陽性與陰性分區(qū)的比例，并使用泊松統(tǒng)計(jì)來計(jì)算每個(gè)樣本的拷貝數(shù)濃度。體系配制，微反應(yīng)制備，結(jié)果讀取均按說明書操作。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立并比較兩種方法的線性范圍和吻合度

流感質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡稱為標(biāo)準(zhǔn)品）建立qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取濃度為1×107copies/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍稀釋，稀釋至1.00×103copies/mL，每個(gè)稀釋度分別重復(fù)做三次檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL 16 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別重復(fù)做三次檢測。觀察用兩種方法檢測上述16 個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果的線性范圍以及和預(yù)期結(jié)果的相關(guān)性，并用線性回歸比較兩種方法的吻合程度。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

分析方法的精密度取決于同一樣品在特定條件下多次測定獲得的一系列測量結(jié)果的接近程度，通過分析標(biāo)準(zhǔn)品在不同稀釋度下的變異系數(shù)（Coefficient of Variance，CV），測試使用相同的設(shè)備，通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品在各稀釋水平下被測濃度的變異系數(shù)（CV）來評(píng)價(jià)衡量精密度，用百分比表示。CV 值越低，精密度越高。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn)

通過將標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次稀釋到2.00×103，1.00×103，8.00×102，6.00×102，5.00×102，3.00×102，2.50×102，1.25×102，測定分析靈敏度，定義為檢測下限（Limit of Detection，LOD）。每個(gè)稀釋度進(jìn)行20 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并使用概率回歸分析結(jié)果。LOD 定義為檢測概率為95%的反應(yīng)中目標(biāo)DNA 的濃度，并通過插值概率曲線確定。

1.2.6 dPCR 和qPCR 在檢測環(huán)境樣本中的比較

用兩種方法分別檢測31 份農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境標(biāo)本，分別得到熒光定量PCR 和數(shù)字PCR 的檢測結(jié)果。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad prism8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Bland-Altman 分析評(píng)價(jià)dPCR 與qPCR 的一致性。采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)評(píng)估兩種方法陽性率的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法的線性范圍及線性回歸分析

dPCR在3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL測量范圍內(nèi)，測量值和預(yù)測值具有良好的線性關(guān)系。兩者在線性范圍內(nèi)斜率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.996，P=0.321）。見圖1。

圖1 核酸標(biāo)準(zhǔn)品與dPCR 和qPCR 定量結(jié)果的線性關(guān)系Fig. 1 Linear relationship of dPCR and qPCR for plasmid DNAs

2.2 兩種方法的批內(nèi)精密度

相同條件下，隨著濃度降低，dPCR 和qPCR 的CV 值越高，精密度下降，在15 個(gè)都能檢測出標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度中，dPCR 有12 個(gè)稀釋度的CV 值低于qPCR，特別是在標(biāo)準(zhǔn)品濃度小于1×104copies/mL，dPCR 的CV 值遠(yuǎn)低于qPCR。見圖2。

圖2 dPCR 和qPCR 在各稀釋水平下的變異系數(shù)Fig. 2 Coefficient of Variation at each dilution level by dPCR and qPCR

2.3 兩種方法的檢測下限（LOD）

標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋的概率回歸分析，估算dPCR的LOD 為410（95%CI：344～570）copies/mL，qPCR的LOD 為845（95%CI：749～1 004）copies/mL，相比之下，dPCR 檢測具有更低的檢測下限。見圖3。

圖3 概率分析曲線計(jì)算dPCR 和qPCR 的最低檢出限Fig. 3 Probit analysis sigmoid curve reporting the LoD of dPCR and qPCR

2.4 兩種方法檢測禽流感環(huán)境標(biāo)本結(jié)果比較

針對(duì)31 份禽流感環(huán)境標(biāo)本的核酸檢測，結(jié)果表明dPCR 的檢出率（96.8%）高于qPCR 檢出率（80.6%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Kappa=0.244，P=0.063）。采 用Bland-Altman 分析評(píng) 價(jià)dPCR 與qPCR 的一致性，經(jīng)分析兩種定量檢測方法的偏倚值為1.265 139，兩種方法95%一致性界限為1.265 139±1.96×4.689 898。見圖4。

圖4 dPCR 和qPCR 定量檢測禽流感病毒的Bland-Altman分析圖Fig. 4 The Bland-Altman analysis of quantitative Avian influenza virus by dPCR and qPCR

3 討論

市場上現(xiàn)有的商業(yè)dPCR 平臺(tái)主要采用兩種方法：一種是QX100?/200?滴式dPCR 系統(tǒng)（Bio-RadLaboratories）和Naica?系統(tǒng)（StillaTechnologies）采用的基于水油乳化液滴技術(shù)的方法；另一種是BioMark?HD（Fluidigm）、QuantStudio?3D（Thermo-FisherScientific）、qiacity（QIAGEN）和Clarity?（JNMedsys）采用的基于芯片/納米板技術(shù)［9］的方法。然而，液滴式dPCR 在熱循環(huán)過程中可能會(huì)出現(xiàn)液滴合并的現(xiàn)象，導(dǎo)致樣品丟失［10-11］，因此低豐度樣品可能存在漏檢的情況。本實(shí)驗(yàn)采用JNMedsys公司推出的一種名為Clarity?的新型dPCR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了基于液滴和基于芯片系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，用一種新穎的管中芯片的方法來進(jìn)行樣品劃分。每個(gè)反應(yīng)混合在高密度芯片上被細(xì)分為10 000 個(gè)分區(qū)。這種基于芯片的分區(qū)設(shè)計(jì)提供了更好的穩(wěn)定性，且簡化了液滴式PCR 相關(guān)的繁瑣工作流程，減少了檢測時(shí)間。需要指出的是，dPCR 作為一種新興技術(shù)，目前可用的系統(tǒng)代表了第一代或第二代平臺(tái)。研究人員正在開發(fā)新的平臺(tái)和方法，通過強(qiáng)化利用dPCR 的理論優(yōu)勢，來解決現(xiàn)有的局限性。例如，增加dPCR 可檢測的熒光通道數(shù)量［12］；開發(fā)基于分區(qū)體積的變化［13］來糾正目標(biāo)分子豐度的估計(jì)的算法。因此，隨著時(shí)間的推移，dPCR 有望得到不斷的改進(jìn)和增強(qiáng)，我們可以展望，比起現(xiàn)有檢測技術(shù)，未來的檢測平臺(tái)可能會(huì)表現(xiàn)出更多指標(biāo)上的優(yōu)勢。

禽流感病毒的定量分析能力可以提高對(duì)病毒生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，而dPCR 提供了一個(gè)更加高效的平臺(tái)。在本研究中，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在3.05×102copies/mL～1.00×107copies/mL 是因?yàn)檫@一范圍覆蓋了儀器制造商推薦的輸入拷貝范圍。在這一濃度范圍內(nèi)，與dPCR 檢測值呈良好的線性關(guān)系，R2=0.996 9，dPCR 和qPCR 在線性范圍內(nèi)斜率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；dPCR 在不同稀釋度的批內(nèi)精密度變異系數(shù)（CV）范圍為2.36%～22.78%，在低濃度下，dPCR 比qPCR 展現(xiàn)出更好的精密度；dPCR的估計(jì)檢測下限（LOD）為410（95%CI，344～570）copies/mL，qPCR 的估計(jì)LOD 為845（95%CI，749～1 004）copies/mL；用dPCR 和qPCR 檢測31 份農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境標(biāo)本，dPCR 的檢出率96.8%，qPCR 的檢出率80.6%，兩種方法的定量一致性較好。由于標(biāo)準(zhǔn)品的限制，未能精確的確定dPCR 的線性動(dòng)態(tài)范圍上限，但數(shù)據(jù)顯示Clarity Plus?dPCR 至少在1.00×102～1.00×107，6 個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)展現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。

研究表明增加dPCR 的分區(qū)數(shù)量或者稀釋目標(biāo)DNA 可以獲得較高的檢測范圍［14］。Clarity Plus?dPCR 系統(tǒng)在檢測禽流感病毒中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，并成功檢測出低豐度病毒RNA 樣本，具有較高檢測精確度。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，使用Clarity-Plus?dPCR 有可能在臨床應(yīng)用中作為一種有效的分子診斷工具，用于檢測低豐度的禽流感病毒標(biāo)本或通過絕對(duì)定量來監(jiān)測病人治療的有效性。此外，該技術(shù)還可用于其他病毒例如新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的環(huán)境監(jiān)測。在廢水等環(huán)境樣本中檢測SARS-CoV-2，可以為社區(qū)中的疾病傳播和暴發(fā)提供早期預(yù)警信號(hào)［15］。

綜上，與傳統(tǒng)qPCR相比，dPCR在性能方面的優(yōu)勢使其在病原檢測上顯示出巨大的潛力和應(yīng)用前景。