基于16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異

安靜 郭會(huì)敏 孔蕊

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活水平的提高以及膳食結(jié)構(gòu)也發(fā)生轉(zhuǎn)變，近年來(lái)，我國(guó)居民肥胖人群明顯增加，且兒童肥胖率的上升速度高于成年人，其中我國(guó)6 歲以下兒童超重率達(dá)到6.8%和肥胖率達(dá)3.6%［1-2］。肥胖本身是一種疾病，也是發(fā)生高血壓、高血脂、胰島素抵抗、糖尿病等多種慢性疾病的危險(xiǎn)因素，其發(fā)生受遺傳、環(huán)境、個(gè)體等多種因素的影響［3］。腸道菌群是在人體消化道的重要組成成分。目前有研究表示［4］，人體內(nèi)的腸道微生物環(huán)境與脂肪、碳水化合物及氨基酸等物質(zhì)的代謝息息相關(guān)，腸道菌群和肥胖癥之間存在著一定的相關(guān)性。身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）是目前臨床評(píng)估和診斷肥胖最常用的指標(biāo)，以體重和身高的比值進(jìn)行計(jì)算，可間接反映人體脂肪成分的數(shù)量［5-6］。有研究報(bào)道表示［7］，BMI 與人糞便微生物群組成具有顯著的相關(guān)性。為進(jìn)一步探尋肥胖、不同身體質(zhì)量指數(shù)與和腸道菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性，本研究基于16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，對(duì)肥胖進(jìn)行分層和鑒別，分辨菌群結(jié)構(gòu)不同與身體質(zhì)量指數(shù)類型的聚類關(guān)系，為臨床肥胖兒童針對(duì)性治療和干預(yù)提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020 年8 月至2022 年8 月82 例到許昌市中心醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的兒童作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡6～14 歲的兒童；②符合超重或單純性肥胖的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；③兩個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、益生菌及其他腸道藥物的兒童；④留取大便樣本前2 周內(nèi)無(wú)應(yīng)激創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染、便秘或腹泄等癥狀的兒童；⑤所有受試兒童其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有先天性遺傳代謝疾病、I 型糖尿病等基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致的代謝紊亂及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的兒童；②有腎臟疾病或血管因素導(dǎo)致的高血壓等的兒童；③患有其他重大疾病且無(wú)法進(jìn)行相關(guān)檢查的兒童。由本院醫(yī)護(hù)人員統(tǒng)一對(duì)體檢兒童的身高和體重進(jìn)行測(cè)量，按照國(guó)際通用的BMI 計(jì)算方法對(duì)其身體質(zhì)量指數(shù)進(jìn)行計(jì)算［9］，即BMI=體重（kg）/身高（m）2。其中BMI 18.5～＜24 為正常組，BMI≥24 為肥胖組，根據(jù)其身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）分為正常組及肥胖組，正常組兒童50 名，其中男童28 名，女童22 名，平均年齡（8.03±3.78）歲；平均BMI（20.39±1.53）kg/m2。肥胖組32 例，男童19例，女童13 例，平均年齡（7.54±3.19）歲；平均BMI（26.69±1.53）kg/m2。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

采用問(wèn)卷調(diào)查的方式對(duì)受試兒童的性別、年齡等資料進(jìn)行收集，并現(xiàn)場(chǎng)對(duì)受試兒童的身高、體重及BMI 進(jìn)行記錄。

1.2.2 樣本收集與儲(chǔ)存

所有受試兒童均留取早晨新鮮糞便于無(wú)菌干燥采便盒內(nèi)，并裝入2 mL 試管，于液氮中儲(chǔ)存，于4℃條件下冷藏，并在采集4h 內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱處保存。

1.2.3 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

取適量樣本至離心管中，使用無(wú)菌水將樣本稀釋至1 ng/μL，采用QIAamp DNA stool Mini kit 試劑盒提取總DNA。使用引物338 F5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′ 和806 R 5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 對(duì)16S rDNA（16S ribosomal RNA gene）的基因的V4-V5 區(qū)進(jìn)行后PCR 擴(kuò)增制備測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。每個(gè)樣品DNA 均加上8 bp 的標(biāo)簽序列，重復(fù)擴(kuò)增3 次。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；然后進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)變性包括（95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，30 s）；最后72℃充分延伸5 min。反應(yīng)體系包括4 μL 的5 X FastPfu Buffer，2 μL 的2.5 mM dNTPs，引物（5 μM）各0.8 pL，0.4 μL 的FastPfu Polymerase 和10 ng 模板DNA，補(bǔ)雙蒸水至20 μL；然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在凝膠DNA 片段回收后，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行純化，再Q(mào)uantiFluorTM-ST 進(jìn)行定量，然后在Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

在測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，然后通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行拼接、過(guò)濾和去嵌合體完成序列優(yōu)化，最后進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類。各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。采用Alpha 多樣性分析正常組和肥胖組兒童微生物群落的豐度和多樣性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Qiime 軟件對(duì)腸道菌群的豐富度和多樣性進(jìn)行分析，計(jì)算Ace、Chaol、Shannon、Simpson 指數(shù)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用（）表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群組多樣性指標(biāo)分析比較

肥胖組的Ace 指數(shù)和Chaol 指數(shù)明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肥胖組的Shannon 和Simpson 指數(shù)較正常組低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群組多樣性指標(biāo)分析比較（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

表1 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群組多樣性指標(biāo)分析比較（）Table 1 Analysis and comparison of diversity indexes of intestinal flora in children with different body mass index（）

2.1 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)比較

兒童腸道微生物群落在門水平上排名的分別為：厚壁菌門＞擬桿菌門＞放線菌門＞變形菌門。肥胖組的變形菌門水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組的擬桿菌門、擬桿菌屬、乳桿菌屬、志賀菌屬、放線菌門、雙歧桿菌屬水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)分布特征比較Fig. 1 Comparison of structural distribution characteristics of intestinal flora in children with different body mass index

表2 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)比較（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

表2 不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)比較（）Table 2 Comparison of intestinal flora structure of children with different body mass index（）

3 討論

人體腸道菌群被稱為“人類的第二基因庫(kù)”［10］，腸道內(nèi)定植超過(guò)1 000 種細(xì)菌，編碼的基因數(shù)量是人類基因組的150 倍以上，且腸道菌群的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)與多種疾病相關(guān)。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，腸道菌群在人類疾病中的作用也逐漸被重視。腸道微生物群作為一個(gè)重要的“器官”，腸道菌群構(gòu)成情況與宿主的機(jī)體的狀態(tài)相關(guān)［11］，本研究通過(guò)16S rRNA 高通量測(cè)序分析不同BMI兒童的腸道菌群差異，篩選出標(biāo)志菌群，可幫助揭示腸道菌群在肥胖、代謝綜合征等疾病發(fā)生發(fā)展中作用和機(jī)制，為肥胖的治療提供新指標(biāo)和臨床依據(jù)，最終實(shí)現(xiàn)臨床輔助診斷及早篩。

本研究結(jié)果顯示，肥胖組的Ace 指數(shù)和Chaol指數(shù)明顯低于正常組，但肥胖組的Shannon 和Simpson 指數(shù)雖較正常組低，但兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ace 指數(shù)和Chaol 指數(shù)均為評(píng)估群落豐富度的指標(biāo)，而Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)是評(píng)估腸道微生物菌落多樣性的指標(biāo)；指數(shù)值分別與群落的豐富度和多樣性呈正比的關(guān)系［12］。人體腸道菌群種類復(fù)雜，但大約有30～40 種占人體腸道菌群的90%，厚壁菌門和擬桿菌門為主要菌群，放線菌門和變形菌門次之［13-14］。厚壁菌門包含有乳桿菌屬、胃球菌屬等，其可將食物纖維分解成短鏈脂肪酸從而促進(jìn)人體對(duì)食物的吸收從而增加能量的攝入，而擬桿菌等也可產(chǎn)生糖苷水解酶，將食物分解為單糖或短鏈脂肪酸，從而幫助人體對(duì)食物的分解與吸收［15］。本研究結(jié)果顯示，肥胖組兒童的菌群的豐富度雖低于正常組，但兩組兒童的菌群的多樣性沒(méi)有太大差異，可能是由于兒童腸道內(nèi)菌群的組成大致相同，但不同的飲食習(xí)慣或其他因素導(dǎo)致兩組兒童的菌群豐富度不同［16］。除此之外還有梭桿菌門、疣微菌門等重要菌群參與著人體腸黏膜上皮細(xì)胞的分化與增殖，共同維持著人體腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，但當(dāng)人體的腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成失衡，或某類細(xì)菌數(shù)量出現(xiàn)變化時(shí)，則可能引發(fā)疾病的發(fā)生［17］。臧曉明等［18］也在研究中表示，不同BMI 人群的腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)組成有明顯差異，腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的不同和菌群豐度的差異可能是導(dǎo)致兒童BMI 變化的重要原因。

在本研究中，不同BMI 兒童的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在著差異，兒童腸道微生物群落在門水平上排名的分別為：厚壁菌門＞擬桿菌門＞放線菌門＞變形菌門，其中肥胖組的變形菌門明顯高于正常組，但厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門比較無(wú)明顯差異。Chen 等［19］的研究表明，肥胖鼠中的變形菌門存在豐富度提高的現(xiàn)象；李靜等［20］也在研究中表示，肥胖兒童腸道菌群中有出現(xiàn)變形菌門菌群水平升高的情況，且變形菌門水平與BMI 水平存在一定的相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明變形菌門水平升高可能與兒童肥胖的發(fā)生相關(guān)，變形菌門可能是BMI 升高的標(biāo)志菌群。

綜上所述，不同身體質(zhì)量指數(shù)兒童的腸道菌群的豐度不同，肥胖兒童的腸道菌群的豐度明顯較低，且腸道菌群結(jié)構(gòu)組成有差異，變形菌門可能是BMI 升高的標(biāo)志菌群，可能在兒童BMI 升高中發(fā)揮著重要作用。但由于本研究為單中心研究，且樣本量較少，可能存在一定的地域限制。