苯并［a］芘惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1致裸小鼠原位肺癌模型的構(gòu)建及血清人源神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白2對該模型的診斷價值

邢云昆，馬雪，姚碧云，付娟玲，趙鵬，祁妍敏

（1.北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系，食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191；2.中國民用航空局民用航空醫(yī)學中心，北京 100123）

2022年2 月，國家癌癥中心發(fā)布的最新一期全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居首位［1］。肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療均依賴于肺癌發(fā)生機制的闡明。深入探索肺癌的發(fā)病機制，篩選潛在的診斷和治療靶點，以及研發(fā)新型化療藥物都需要以合適的肺癌動物模型為基礎(chǔ)［2］。合適的肺癌動物模型要具備建模方法簡單、可重復(fù)、最大程度模擬肺癌微環(huán)境及在體環(huán)境的特點。目前用于腫瘤研究的動物模型主要有人源異種移植模型、細胞腫瘤模型和遺傳工程小鼠模型，前兩者按成瘤部位又可分為異位腫瘤模型（包括皮下及腹腔）和原位腫瘤模型等［3-5］。最常用的是皮下移植瘤模型（尤其是腋下），此方法操作簡便，成瘤率高，易于監(jiān)測腫瘤生長。但由于皮下腫瘤在微環(huán)境、局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移模式等方面與原位肺癌存在較大差異，使得皮下移植瘤模型不能很好地模擬臨床肺癌發(fā)生發(fā)展的全過程及伴隨的胸水產(chǎn)生等并發(fā)癥。原位腫瘤模型能夠反映腫瘤的生物學特性，更能夠模擬腫瘤在人體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移過程，在腫瘤機制研究、標志物篩選和藥物評估等方面應(yīng)用較多，因而是當前較為理想的動物模型［6-7］。但原位腫瘤模型成瘤率較低，不易直接動態(tài)觀察，需要借助超聲或手術(shù)等方式觀察腫瘤生長狀況，限制了其應(yīng)用和發(fā)展［8］。在研究化學致癌物所致肺癌時，常采用誘發(fā)腫瘤的方法制備原位腫瘤模型，但該模型制備困難，且存在誘發(fā)腫瘤時間長、成瘤率不理想、重現(xiàn)性差等缺陷［9-11］。考慮到微環(huán)境對腫瘤生長的影響，原位肺癌模型能夠基本模擬肺癌在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程，也能夠反映發(fā)生胸水和遠處轉(zhuǎn)移的實際臨床現(xiàn)象。

目前，建立原位肺癌模型的方法主要有致癌物誘發(fā)、基因工程小鼠、經(jīng)支氣管注射細胞懸液、經(jīng)胸壁注射細胞懸液、尾靜脈注射細胞懸液和腫瘤組織移植等，相較于膀胱、結(jié)腸、肝等其他原位腫瘤模型，原位肺癌動物模型的發(fā)展較慢［12-14］。建立操作簡便、成瘤快、可重復(fù)、易鑒定的原位肺癌模型將為探究肺癌發(fā)病機制、篩選相關(guān)生物標志物，以及抗腫瘤藥物的非臨床藥效學和安全性評價提供較理想的模型。苯并［a］芘惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細胞T-16HBE-C1（THBEc1）由本課題組構(gòu)建并保存，THBEc1 細胞接觸抑制特性消失，在裸小鼠皮下可快速生長成腫瘤，呈高遷移和侵襲表型，病理呈鱗癌特征，且裸小鼠血清人源神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白2（neuropilin-2，NRP2）水平能很好反映皮下腫瘤的生長［15-17］。因此，本研究選擇THBEc1，通過肺內(nèi)注射直接將癌細胞接種于裸小鼠肺內(nèi)建立原位肺鱗癌裸小鼠模型，以期為肺癌特別是化學物所致肺癌相關(guān)研究提供選擇。同時評估NRP2在THBEc1致裸小鼠原位肺癌診斷中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

MEM 培養(yǎng)液，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Corning 公司；青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶，美國Sigma 公司；人NRP2 酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，北京義翹神州科技股份有限公司；牛血清白蛋白，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；單組分3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、硫酸、甲醛和無水乙醇等試劑，北京化工廠；96孔酶標板，美國Corning公司；SCI-165D CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本ASTEC公司；FLUOstar Omega酶標儀，德國BMG LABTECH 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人支氣管上皮細胞16HBE（HBE）由中山大學陳雯教授惠贈，本實驗室保存。HBE 細胞在裸小鼠體內(nèi)無致瘤性。BaP 惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1 由本實驗室建立，可在裸小鼠體內(nèi)成瘤［15-16］。2 種細胞均使用含10%（V/V）滅活胎牛血清的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中。當細胞80%～90%融合時，使用磷酸鹽緩沖液清洗細胞2 次，于25 cm2培養(yǎng)瓶中加入2.5 g·L-1胰蛋白酶/0.2 g·L-1EDTA-Na2消化液1 mL，37 ℃培養(yǎng)箱中消化7 min，使用MEM 完全培養(yǎng)液終止消化并吹打成單細胞懸液，按1∶4比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3 動物和實驗分組

SPF 級ICR 小鼠12 只，BALB/c-nu 裸小鼠16 只，均為4 周齡雄性，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0013。實驗動物飼養(yǎng)于SPF級動物房IVC籠具內(nèi)，溫度24 ℃，12 h 晝夜交替，自由飲水和進食。所有涉及動物使用和福利的實驗方案均在實施前經(jīng)北京大學生物醫(yī)學倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準，批準編號：LA2020237。

ICR 小鼠用于確定肺內(nèi)注射的安全注射體積。根據(jù)體重隨機分為3 組，各組小鼠分別肺內(nèi)注射無菌生理鹽水20，30和40 μL。

BALB/c-nu裸小鼠用于原位肺癌和皮下荷瘤建模。根據(jù)體重隨機分為4 組，即對照組（皮下+肺內(nèi)同時接種HBE 細胞，皮下1×106，肺內(nèi)2×105）、皮下荷癌模型組（皮下一次性接種THBEc1 細胞1×106）和原位肺癌模型組（肺內(nèi)一次性接種THBEc1 細胞2×105或5×105）。

1.4 肺內(nèi)注射位置及安全注射體積的確定

為避免穿刺時對心臟的損傷，本研究選擇右肺作為接種腫瘤細胞的部位。同時，根據(jù)小鼠肺解剖位置，選擇第5 或第6 肋間與胸骨旁線交點作為穿刺點。使用30G 針頭于穿刺點垂直小鼠皮膚進針，進針深度約4 mm，繼而將無菌受試物注射入小鼠右肺內(nèi)，停留片刻后退針。各組ICR 小鼠分別肺內(nèi)一次性注射無菌生理鹽水20，30 和40 μL，觀察注射后小鼠狀態(tài)及14 d內(nèi)死亡數(shù)量。

1.5 裸小鼠原位肺癌模型和皮下荷瘤模型的建立及鑒定

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BaP 惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1 能在BALB/c-nu 裸小鼠皮下成瘤，最小成瘤細胞量為8.0×104［16］。根據(jù)1.3 分組并處理BALB/c-nu 裸小鼠，原位肺癌模型組細胞接種于裸小鼠右肺，對照組皮下和肺內(nèi)2 個部位分別接種細胞，皮下荷瘤模型組細胞接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，于接種細胞后每7 d 測小鼠體重和皮下腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式V=0.5×W2×L（W為腫瘤短徑，L為腫瘤長徑）計算腫瘤體積。原位肺癌模型5×105細胞組在接種細胞后第10 天因小鼠出現(xiàn)呼吸困難、瀕臨死亡，提前結(jié)束實驗，其余3 組均于第14 天結(jié)束實驗。實驗結(jié)束后，乙醚麻醉小鼠，經(jīng)球后靜脈叢采血分離血清，原位肺癌模型5×105細胞量組同時采集、血清和胸水，分裝后均-80 ℃保存。繼而對小鼠進行安樂死，剖取肺及皮下荷瘤模型組小鼠皮下腫瘤，經(jīng)4%甲醛固定后HE染色進行組織病理學檢查。

1.6 ELlSA測定裸小鼠血清中人源NRP2水平

取1.5 分離制備的裸小鼠血清樣品，根據(jù)人NRP2 ELISA 試劑盒說明書檢測血清及原位肺癌模型5×105細胞組胸水中人源NRP2 水平。采用雙波長法測定吸光度（A）值，檢測波長450 nm，參比波長630 nm。將A450nm和A630nm差值作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線并計算樣品中人源NRP2濃度。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 27.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多重比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）Fisher 最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定血清人源NRP2 對THBEc1 細胞致裸小鼠原位肺癌模型的診斷價值。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺內(nèi)注射無菌生理鹽水的安全注射體積

注射無菌生理鹽水后14 d 內(nèi)，肺內(nèi)注射40 μL組小鼠死亡2/4，死亡發(fā)生在注射后24 h 內(nèi)；20 和30 μL組小鼠死亡均0/4，但30 μL組小鼠注射后呼吸急促、精神萎靡、活動減少，而20 μL組小鼠進食和飲水等活動未見明顯異常，故后續(xù)實驗注射體積選擇20 μL。

2.2 THBEc1細胞致原位肺癌模型和皮下荷瘤模型裸小鼠體重和肺癌病理變化

體重變化如圖1 所示。在實驗期內(nèi)，正常對照組小鼠體重持續(xù)增長；皮下荷瘤模型組和原位肺癌模型5×105細胞組小鼠在接種細胞7 d后均出現(xiàn)體重下降，到14 d 實驗結(jié)束時體重均明顯低于正常對照組（P＜0.05，P＜0.01）；原位肺癌模型2×105細胞組小鼠在接種細胞7 d 后體重增加緩慢，但在實驗結(jié)束時（10 d）體重仍然低于正常對照組（P＜0.05）。

Fig.1 Changes in body weight of nude mice after THBEc1 cell inoculation.Sixteen male BALB/c-nu nude mice were randomly divided into 4 groups：the control group [subcutaneously and intrapulmonary inoculated with human bronchial epithelial 16HBE（HBE）cells 1×106 and 2×105 per mouse，repectively]，the subcutaneous tumor group（SCT，subcutaneously inoculated with THBEc1 cells 1×106 per mouse）and the orthotopic lung tumor group（OLT，intrapulmonary inoculation with THBEc1 cells 2×105 or 5×105 per mouse）.The experiment in the OLT group ended on the 10th day after cell inoculation，other groups on the 14th day.Body weight was measured every 7 d.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group at the same time point.

皮下荷瘤模型組祼鼠第7 天可觸及皮下腫瘤，4 只小鼠均成瘤；第14 天腫瘤體積達（211±69）mm3（圖2），小鼠活動受限，實驗結(jié)束。組織病理學檢查結(jié)果如圖3所示，腫瘤呈鱗狀細胞癌特征，即腫瘤細胞呈巢式生長，胞核深染，核質(zhì)比高，分化程度較低，存在粗大團塊樣染色體、不典型核分裂和周圍肌肉組織浸潤，腫瘤中部可見大片壞死區(qū)。正常對照組于接種細胞后第7天和第14天均未檢出腫瘤。

Fig.2 Subcutaneous tumors（A）and their volume（B）of nude mice after being subcutaneously inoculated with THBEc1 cells.See Fig.2 for mouse treatment.±s，n=4.

Fig.3 Histopathological features of tumors of nude mice after being subcutaneously inoculated with THBEc1 cells by HE staining.See Fig.1 for mouse treatment.The arrows point to the tumor's squamous cell carcinoma features.

對照組全部4 只小鼠，大體解剖及組織病理學檢查均未在肺內(nèi)檢出腫瘤（圖4A～D，A1～D1）。

接種細胞后第14 天，原位肺癌模型2×105細胞組小鼠活動如常，解剖可見3 只小鼠右肺存在白色病灶（圖4E，G，H）。肺內(nèi)接種細胞后第10 天，原位肺癌模型5×105細胞組動物活動減少，呼吸困難，個別小鼠處于瀕死狀態(tài)，故提前結(jié)束實驗；解剖可見4 只小鼠右肺均存在白色病灶（圖4I～L），且心臟與橫膈間可見較大腫瘤灶（圖4I～K），胸腔可見血性積液。組織病理學檢查顯示，上述2組7只小鼠肺的白色病灶均為鱗狀細胞癌（圖4E1，G1，H1，I1～L1），病理特征與THBEc1 細胞引起的上述皮下腫瘤一致，且可見較大腫瘤侵犯氣管和支氣管，余1 只小鼠大體及組織病理學檢查均未檢出腫瘤（圖4F，F(xiàn)1）。結(jié)合大體解剖和組織病理學檢查，原位肺癌模型5×105細胞和2×105組成瘤分別為4/4和3/4。

Fig.4 Lung photographs（A～L）and histopathological features（A1～L1）of tumors of nude mice after intrapulmonary injection of THBEc1 cells by HE staining.See Fig.1 for mouse treatment.The arrows show the tumors growing between the heart and diaphragm.

綜上所述，皮下接種1×106和肺內(nèi)接種5×105細胞時，THBEc1 細胞在裸小鼠皮下和肺內(nèi)的成瘤均為4/4，肺內(nèi)接種2×105細胞成瘤為3/4，而HBE細胞在裸小鼠皮下和肺內(nèi)均無致瘤性。表明通過肺內(nèi)注射THBEc1細胞可以建立裸小鼠原位肺癌模型。

2.3 血清人源NRP2在THBEc1細胞致裸小鼠原位肺癌模型中的診斷價值

各組裸小鼠血清及胸水中人源NRP2 水平如圖5A 所示。皮下荷瘤模型組裸小鼠血清及原位肺癌模型5×105細胞組裸小鼠胸水和血清中人源NRP2 水平均高于對照組（P＜0.01）。原位肺癌模型2×105細胞組裸小鼠血清人源NRP2 水平與對照組比較無明顯變化。如果僅對該組原位肺癌建模成功的3 只小鼠與對照組小鼠的血清人源NRP2 水平進行比較，則差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.0182）。

取全部16 只裸小鼠的數(shù)據(jù)繪制血清人源NRP2 水平診斷THBEc1 細胞致裸小鼠原位肺癌的ROC 曲線，結(jié)果如圖5B 所示。該曲線AUC 值為1.000（95%可信限為1.000～1.000，P=0.0018），最佳截斷值為123.00 pg·mL-1，提示血清人源NRP2水平能較好地區(qū)分THBEc1 細胞在裸小鼠肺內(nèi)是否成瘤，即對THBEc1 細胞所致裸小鼠原位肺癌模型具有潛在的判斷價值。

Fig.5 Human-derived NRP2 levels in nude mice serum and pleural fluid by Kit（A）and its receiver operating characteristic（ROC）curve（B）.See Fig.1 for mouse treatment.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 討論

本研究采用肺內(nèi)注射方式接種BaP 惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1 于裸小鼠右肺內(nèi)，接種細胞后可在較短時間建模，是一種操作簡便、成瘤快、易鑒定的原位肺癌模型制備方法。且通過測定血清人源NRP2水平即可鑒定原位肺癌模型是否建模成功。本課題組前期研究顯示，接種1.2×105細胞時，THBEc1在裸小鼠皮下成瘤4/4［16］，本研究中，肺內(nèi)接種THBEc1 細胞2.0×105時，約為皮下接種細胞量的2 倍，但肺內(nèi)成瘤為3/4，低于皮下。這種差異一方面提示組織環(huán)境（如肺內(nèi)的相對富氧環(huán)境和皮下的相對缺氧環(huán)境等）可能影響腫瘤細胞的成瘤能力，另一方面反映了原位肺癌模型和皮下移植瘤模型中腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的差異。因此，裸小鼠原位肺癌模型可能較皮下荷瘤模型能夠更好模擬人肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。在本研究建立的THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型中，接種2.0×105細胞時成瘤為3/4，接種5.0×105時成瘤為4/4。增加接種細胞量能進一步提高成瘤率，但會影響荷瘤裸小鼠的生存時長。參考周永春等［18］、楊曉華等［19］和March等［20］所構(gòu)建的肺原位腫瘤模型，使用基質(zhì)膠作為介質(zhì)，或在接種腫瘤細胞前使用X線照射等方式以抑制裸小鼠免疫功能且輕微破壞肺上皮或肺表面，均可在不增加細胞接種量的前提下提高成瘤率，有助于延長飼養(yǎng)時間，進行肺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移或藥物療效等的相關(guān)研究。同時，相比于經(jīng)支氣管注射細胞懸液、經(jīng)尾靜脈注射細胞懸液和腫瘤組織移植等構(gòu)建肺原位腫瘤模型的方法，本研究所采用的經(jīng)胸壁直接肺內(nèi)注射細胞懸液法，具有操作簡便、快捷、技術(shù)難度低、成瘤快、成瘤率高、對動物的損傷小、安全性較高等優(yōu)點。THBEc1 細胞是經(jīng)BaP 惡性轉(zhuǎn)化的細胞，其接觸抑制特性消失，具有可復(fù)層生長、非錨定依賴生長等腫瘤細胞特征，且該細胞在裸小鼠體內(nèi)所致腫瘤為典型鱗狀細胞癌，成瘤快，特性穩(wěn)定，在肺腫瘤尤其是化學物所致肺腫瘤的相關(guān)研究中具有一定的代表性。

動物原位肺癌模型的應(yīng)用和發(fā)展之所以受到限制，主要原因之一是無法動態(tài)觀察腫瘤生長狀況，需要借助小動物CT、核磁、活體成像系統(tǒng)或手術(shù)進行觀察，增加了操作難度和建模成本，難以普及［21-22］。這種情況下，外周血生物標志物的檢測可能是更好的選擇。血清腫瘤標志物不僅有助于腫瘤的篩檢和鑒別診斷，而且可用于預(yù)后和療效評估［23］。目前在臨床上應(yīng)用及研究最多的肺癌血清生物標志物主要有癌胚抗原、細胞角蛋白19 片段、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和鱗狀細胞癌抗原等［24］。找到合適的血清生物標志物應(yīng)用于監(jiān)測肺癌的生長將有利于動物原位肺癌模型的進一步發(fā)展。許多體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，NRP2 與肺癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種腫瘤的血管生成、腫瘤細胞生長及轉(zhuǎn)移有關(guān)，降低NRP2的表達可抑制腫瘤的侵襲表型，因此其被認為是侵襲性腫瘤表型的候選生物標志物［25-26］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在皮下接種THBEc1 細胞后，腫瘤灶人源NRP2 陽性，裸小鼠血清人源NRP2 水平顯著升高，并與以腫瘤體積為特征的腫瘤生長呈良好正相關(guān)［17，27］。在本研究構(gòu)建的THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型中發(fā)現(xiàn)，血清人源NRP2 水平可以作為監(jiān)測實驗動物肺內(nèi)成瘤的診斷指標，根據(jù)ROC 曲線獲得的最佳截斷值123.00 ng·L-1能很好地診斷實驗裸小鼠肺部是否成瘤。該發(fā)現(xiàn)也使得THBEc1 致裸小鼠原位肺癌模型具備了易于鑒定和監(jiān)測肺內(nèi)腫瘤生長狀況的優(yōu)點。未來在該模型的實際應(yīng)用中，可考慮采用內(nèi)眥靜脈叢采血、尾采血等非終末采血方式，通過對血清人源NRP2 水平的測定，實現(xiàn)對肺內(nèi)成瘤情況的動態(tài)監(jiān)測。

綜上所述，通過肺內(nèi)注射接種THBEc1 細胞可建立裸小鼠原位肺癌模型，血清人源NRP2 可用于該模型的判斷。本研究采用的小鼠肺內(nèi)注射方法和安全注射體積可供參考。