大麻二酚改善福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛作用及中樞機(jī)制

王吳玥，吳寧，宋睿，韓笑，李錦

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，神經(jīng)藥理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

口腔頜面部疼痛是臨床中常見(jiàn)的疼痛類(lèi)型，主要由牙齒、牙齦、頜骨、顳下頜關(guān)節(jié)、口腔黏膜等部位引起，其中損傷和感染導(dǎo)致的炎性痛疾病如：牙髓炎、牙周炎和顳下頜紊亂等在臨床中高發(fā)［1］。目前對(duì)于口腔頜面部炎性痛的主要治療藥物為非甾體抗炎類(lèi)藥物，但仍存在損傷胃腸道和腎及增加心血管系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)等一系列問(wèn)題［2］?？谇粐妱┑柔槍?duì)病患損傷處的局部給藥是治療口面部疼痛的常見(jiàn)給藥方式，對(duì)于提高治療部位的血藥濃度具有良好效果。因此，尋找新的高效低毒的局部藥物治療方法對(duì)于口腔頜面部炎性痛治療具有重要意義。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)，參與調(diào)節(jié)情緒、疼痛和免疫等生理過(guò)程［3］。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)影響ECS 可改善疼痛，直接給予2 種內(nèi)源性大麻素N-花生酰乙醇酰胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油（2-arachidonyl glycerol，2-AG）可抑制疼痛，但表現(xiàn)出代謝快和作用時(shí)間短的弊端［4］。隨后，人們又通過(guò)給予Ⅰ型大麻素受體（cannabinoid receptor 1，CB1R）或Ⅱ型大麻素受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）的高選擇性激動(dòng)劑來(lái)鎮(zhèn)痛，但CB1R 和CB2R 在中樞及外周分布廣泛，會(huì)造成典型的大麻素受體激動(dòng)樣癥狀，引發(fā)全身副作用，可能造成依賴(lài)［5］。研究者們開(kāi)始采用2 種大麻素水解酶抑制劑來(lái)鎮(zhèn)痛［6］，但這種方式在某些治療劑量下可引起大麻素過(guò)量，從而導(dǎo)致耐受。因此，以上3種方式雖有明確的鎮(zhèn)痛效果，但也并非最終理想的治療手段。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻提取物中含量較高的物質(zhì)之一，無(wú)精神活性，安全性較高，是脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）的抑制劑和CB1R 的負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，可雙向調(diào)節(jié)ECS功能。目前已有研究表明，ip給予CBD在角叉菜膠、脂多糖和口腔頜面部炎性痛模型中有良好鎮(zhèn)痛作用［7-9］，但是缺乏局部給予CBD 的藥效學(xué)作用研究，且關(guān)于口面部炎性疼痛鮮有報(bào)道。

鎮(zhèn)痛藥的共同作用機(jī)制主要是抑制痛覺(jué)上行傳導(dǎo)通路，激活痛覺(jué)下行調(diào)控通路，調(diào)節(jié)內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)［10］。其中，中央導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)（periaqueductal gray，PAG）、基底外側(cè)杏仁核（basal lateral amygdala，BLA）和前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex，ACC）是處理疼痛信息和調(diào)節(jié)疼痛的重要腦區(qū)。PAG在內(nèi)源性痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)中起承上啟下作用，凡是激活更高級(jí)中樞所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用，大多都被證明是通過(guò)它才得以實(shí)現(xiàn)的，Walker等［11］研究發(fā)現(xiàn)，電刺激PAG發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用時(shí)，可檢測(cè)到PAG的AEA水平升高；BLA和ACC是痛覺(jué)下行抑制以及下行易化系統(tǒng)的重要核團(tuán)。Silva-Cardoso等［12］發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型下，ACC-左側(cè)前島葉皮質(zhì)-BLA 神經(jīng)環(huán)路參與調(diào)節(jié)疼痛，ip給予CBD 可通過(guò)激活該通路中的CB1R 來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。上述3個(gè)腦區(qū)內(nèi)源性大麻素的改變均對(duì)疼痛產(chǎn)生影響。但在炎性痛過(guò)程中，上述3 個(gè)腦區(qū)的內(nèi)源性大麻素如何變化，以及CBD是否以及如何通過(guò)影響這些腦區(qū)的內(nèi)源性大麻素變化來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用一直未被闡明。因此，本研究首先通過(guò)上唇右側(cè)sc注射1%福爾馬林溶液建立口腔頜面部炎性痛模型，該模型具有雙相痛的特點(diǎn)，一相痛時(shí)期的行為反應(yīng)在注射后立即產(chǎn)生，主要是由福爾馬林溶液直接激活痛覺(jué)感受器導(dǎo)致的，且反應(yīng)劇烈持續(xù)約6 min，隨后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入間歇期，二相痛時(shí)期的行為反應(yīng)一般在15 min左右開(kāi)始，程度較一相痛時(shí)期弱，往往與炎癥反應(yīng)和中樞敏化相關(guān)，持續(xù)時(shí)間可至45 min。然后通過(guò)上唇右側(cè)sc給予CBD 0.01，0.03和0.06 mg來(lái)探究其對(duì)于口腔頜面部炎性痛模型一相痛以及二相痛時(shí)期的鎮(zhèn)痛作用。接下來(lái)利用免疫熒光染色檢測(cè)了CBD 對(duì)三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（spinal trigeminal nucleus caudal part，Sp5C）和ACC 的c-Fos 表達(dá)水平的影響。最后采用內(nèi)源性大麻素探針結(jié)合光纖記錄的方法，在口腔頜面部疼痛發(fā)生過(guò)程中，實(shí)時(shí)在體探究PAG，BLA 和ACC 的內(nèi)源性大麻素水平變化特點(diǎn)，探討CBD對(duì)于口腔頜面部炎性痛鎮(zhèn)痛作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

CBD（云南漢木森生物科技有限公司，批號(hào)：L1810L01），氯胺酮（軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所提供），鹽酸甲苯噻嗪（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S44817），多聚甲醛粉末（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：158127）；二甲亞砜溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：RNBD1994）；甲醛溶液（國(guó)藥集團(tuán)公司，批號(hào)：20210329）；PBS粉末（中國(guó)中杉金橋公司，批號(hào)：23020301），兔抗小鼠c-Fos單克隆抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)：2250S），Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（中國(guó)中杉金橋公司，批號(hào)：8889S），重組腺相關(guān)病毒探針rAAV-hSyn-eCB 2.0（布林凱斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BC-0286），冷凍切片組織包埋劑（美國(guó)SAKURA 公司，批號(hào)：2499-00），蓖麻油溶液（美國(guó)Aladdin 公司，批號(hào)：L2145463），自凝牙科水泥（賀利氏古莎齒科有限公司），1454瞬干膠（北京天山新材料技術(shù)有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海安亭科學(xué)儀器有限公司），雙色單通道光纖記錄儀器、三色單通道光纖記錄儀器（千奧星科南京生物科技有限公司，型號(hào)：QAXK-FD-FPSLED，QAXK-FPS-SS-LED），冰凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)：CM1900），全景腦片高通量成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：VS200）。

1.2 動(dòng)物和分組處理

56 只雄性SPF 級(jí)8 周齡C57BL/6J 小鼠，體重20～22 g（北京斯貝福生物技術(shù)有限公司），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25 ℃，濕度約50%，明暗交替12 h（早上7∶00-晚上7∶00 燈光照明）。飼養(yǎng)期間，動(dòng)物可自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)均在早上9∶00 至下午6∶00 期間進(jìn)行，并于正式實(shí)驗(yàn)前提前將小鼠放入實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)30 min。實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物的處理均符合軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理審查委員會(huì)的要求，倫理審批號(hào)：IACUC-2022-024W。分組①其中40 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+CBD（每側(cè)0.01，0.03 和0.06 mg）組，每組8 只。分組②剩余的16 只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+CBD 0.06 mg組，每組5～6只。

1.3 口腔頜面部炎性痛模型的建立和小鼠抓臉時(shí)間檢測(cè)

取1.2 分組①小鼠，正常對(duì)照組sc 給予10 μL溶劑（2%二甲亞砜+5%蓖麻油），5 min 后sc 給予生理鹽水30 μL；模型組sc給予溶劑10 μL，5 min 后sc 給予1%福爾馬林30 μL；CBD 組分別給予3 個(gè)劑量的CBD 10 μL，5 min 后sc 給予1%福爾馬林30 μL。隨即將小鼠放入20 cm×15 cm×20 cm聚乙烯觀察盒中，觀察記錄45 min 內(nèi)小鼠抓臉時(shí)間；以每3 min 作為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄一次抓臉時(shí)間。記錄鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)劑量CBD 0.06 mg 組一相痛時(shí)期（0～6 min）和二相痛時(shí)期（15～45 min）抓臉總時(shí)間。

1.4 免疫熒光法檢測(cè)小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)水平

1.3 行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束45 min 后（相當(dāng)于注射福爾馬林90 min 后），正常對(duì)照組、模型組和模型+CBD 0.06 mg 組隨機(jī)選取4 只小鼠，麻醉后，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流后取腦，并進(jìn)行冰凍切片，切片厚度30 μm，切取包含Sp5C 和ACC 腦區(qū)的冠狀腦片進(jìn)行免疫熒光染色。首先用PBS 洗去腦片上的包埋劑，共3 次每次5 min，隨后用PBS配制10%山羊血清，加入Triton X-100（終濃度0.3%）混勻作封閉液。用封閉液37 ℃封閉1 h。結(jié)束后，加入用封閉液稀釋的c-Fos 抗體（1∶300），4 ℃孵育18～24 h。24 h后用PBS 漂洗3 次，每次5 min，再加入用封閉液稀釋的Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG 抗體（1∶500），室溫避光孵育2 h，最后PBS 漂洗3 次后用含DAPI 的封片劑封片固定。待封片劑晾干后，放入-20 ℃保存。全景腦片高通量成像系統(tǒng)掃描腦區(qū)，Image J軟件進(jìn)行c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 光纖記錄法檢測(cè)小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)內(nèi)源性大麻素表達(dá)水平

取1.2 分組②小鼠，采用光纖記錄定量福爾馬林二相痛時(shí)期PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)的內(nèi)源性大麻素水平變化。本熒光探針eCB2.0 基于大麻素受體設(shè)計(jì)，遞質(zhì)探針與熒光基團(tuán)偶聯(lián)，遞質(zhì)的變化導(dǎo)致熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，這一變化被轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，以F值表示。

1.5.1 病毒注射與光纖埋置

小鼠稱(chēng)重后用氯胺酮100 mg·kg-1和鹽酸甲苯噻嗪50 mg·kg-1麻醉至翻正反射消失，使用碘伏消毒頭皮并使用眼科剪在眼睛到顱骨后部做切口。隨后將小鼠固定在立體定位儀上，在眼睛上涂抹紅霉素眼膏后再用干凈的棉簽蘸取生理鹽水擦拭顱骨表面，過(guò)程中保持顱骨表面潔凈干燥。利用立體定位儀找到目標(biāo)坐標(biāo)后用顱骨鉆進(jìn)行打孔并用針挑破硬腦膜。用注射泵輕微接觸Bregma 點(diǎn)并將該點(diǎn)設(shè)為零點(diǎn)，然后移至目標(biāo)位點(diǎn)處，立體定位坐標(biāo)參考Franklin 和Paxino 的小鼠腦圖譜，前后AP（anterior-posterior，AP），中旁（medial-lateral，ML）和背腹（dorsal-ventral，DV）表示相對(duì)于Bregma 距離。PAG 坐標(biāo)為（AP：-4.55 mm，ML：-0.45 mm，DV：-2.68 mm），BLA 坐標(biāo)為（AP：-1.5 mm，ML：-3.0 mm，DV：-4.68 mm），ACC 定位為（AP：+1.55 mm，ML：+0.35 mm，DV：-2.35 mm）。鉆孔結(jié)束后，吸取病毒并于顱骨下針。將300 nL rAAVhSyn-eCB 2.0 病毒探針［13］以30 nL·min-1速度分別注入每只小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)中，注射結(jié)束后，注射玻璃針懸停10 min使病毒充分?jǐn)U散。

病毒注射完成后，將陶瓷插芯垂直插入病毒原注射位點(diǎn)并深入目的坐標(biāo)DV 上方0.02 mm，隨后固定陶瓷插芯并將小鼠轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。在進(jìn)行后續(xù)的行為實(shí)驗(yàn)前，小鼠進(jìn)行3 周手術(shù)恢復(fù)和表達(dá)。

1.5.2 光纖記錄

光纖與小鼠頭部陶瓷插針連接，使用光纖記錄系統(tǒng)采集動(dòng)物在口腔頜面部炎性痛模型下大腦的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)前，打開(kāi)雙色、三色單通道光纖記錄儀提前預(yù)熱，光纖先漂白20 min 以避免光纖的自發(fā)熒光影響真實(shí)熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠插上光纖（小鼠頭部的陶瓷光纖需預(yù)先用生理鹽水輕微擦拭），待基線穩(wěn)定后按照1.3 實(shí)驗(yàn)流程給予生理鹽水、福爾馬林和CBD，全程記錄470 nm 和405 nm信號(hào)。

1.5.3 光纖記錄數(shù)據(jù)分析

光纖記錄分析使用千奧星科生物科技有限公司提供的腳本獲取ΔF/F 軌跡，采用當(dāng)前熒光強(qiáng)度F和基線熒光強(qiáng)度F0的差值再除以基線熒光強(qiáng)度F0的值〔即ΔF/F0=（F-F0）/F0值〕表示熒光強(qiáng)度變化，F(xiàn)0為事件前100 s 信號(hào)積分平均值。熒光信號(hào)以100 Hz 采樣。在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，以405 nm 激發(fā)光為參考通道，利用MATLAB 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)運(yùn)動(dòng)矯正去除背景噪聲信號(hào)，結(jié)合多項(xiàng)式矯正算法對(duì)信號(hào)進(jìn)行擬合，改善光漂白效應(yīng)即熒光信號(hào)或光纖的自發(fā)熒光由于長(zhǎng)時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白基線逐步下降，從而得到真實(shí)熒光數(shù)據(jù)。分析數(shù)據(jù)時(shí)，選擇注射CBD 或溶劑的前100 s 作為基線，選擇注射福爾馬林或生理鹽水后（1300～4000 s）的二相痛時(shí)期進(jìn)行分析。具體實(shí)驗(yàn)流程參見(jiàn)圖1。

Fig.1 Experimental procedure of fiber photometry recording during phaseⅡin formalin-induced orofacial inflammatory pain.Mice were anesthetized and fixed in the stereotaxic fram.rAAV-hSyn-eCB 2.0 was unilaterally injected into the periaqueductal gray（PAG）,basal lateral amygdala（BLA）and anterior cingulate cortex（ACC）.After three weeks,mice were divided into normal control group,model group,and model+cannabidiol（CBD）0.06 mg group.The normal control group was given 10 μL of vehicle（2% DMSO+5% castor oil）and 30 μL of saline 5 min later.The model group received 10 μL of vehicle followed by 30 μL of 1% formalin after a duration of 5 min.The CBD group received a dosage of 0.06 mg of CBD in 10 μL,followed by 30 μL of formalin solution at a concentration of 1% after a duration of 5 min.The 100 s before injection of CBD or vehicle was calculated as the baseline,analysis was performed through the phase Ⅱpain period (1300-4000 s) after injection of formalin or saline.The fluorescence intensity changes (peak value-valley value) in the PAG,BLA,and ACC were recorded as indexes for analysis.

1.6 病毒注射位置驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行病毒注射位置驗(yàn)證。麻醉小鼠后，經(jīng)心臟灌流4 ℃預(yù)冷的PBS 溶液和4%多聚甲醛溶液。灌流結(jié)束后迅速取出鼠腦，放入4%多聚甲醛溶液中4 ℃浸泡過(guò)夜進(jìn)行后固定，后固定完成后于4 ℃在PBS 配制的20%和30%蔗糖溶液中梯度脫水2 d，至鼠腦沉至管底脫水完全。隨后進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為30 μm。隨后用PBS 振蕩漂洗3 次，每次5 min，完全洗去包埋液。選擇包含目的腦區(qū)的腦片，滴加DAPI 的防熒光淬滅的封片劑進(jìn)行封片。待封片劑晾干后，將腦片保存于-20 ℃冰箱或立即使用全景腦片高通量成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。45 min內(nèi)每3 min 的抓臉時(shí)間數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，45 min 內(nèi)抓臉時(shí)間、一相痛和二相痛時(shí)期抓臉時(shí)間、c-Fos 表達(dá)以及不同腦區(qū)內(nèi)源性大麻素水平變化均采用單因素方差分析，組間比較均采用Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBD 對(duì)福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛模型小鼠抓臉時(shí)間的影響

如表1 所示，在45 min 內(nèi)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠抓臉時(shí)間顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，模型+CBD（0.03 和0.06 mg）組小鼠的抓臉時(shí)間顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示在該模型下，CBD 0.03和0.06 mg具有鎮(zhèn)痛作用，且CBD 0.06 mg鎮(zhèn)痛作用最為顯著。

Tab.1 Effect of CBD on face rubbing time in formalininduced orofacial inflammatory pain model mice

在45 min 內(nèi)抓臉時(shí)間結(jié)果（圖2A）顯示，其中0～6 min 為一相痛時(shí)期，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠在3 和6 min 抓臉時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），而模型+CBD 0.06 mg 組抓臉時(shí)間與模型組相比無(wú)顯著差異。15～45 min為二相痛時(shí)期，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠從18～33 min和45 min的抓臉時(shí)間均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+CBD 0.06 mg組小鼠在21，27和30 min的抓臉時(shí)間均顯著降低。一相痛（圖2B）和二相痛（圖2C）總抓臉時(shí)間結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠一相痛（0～6 min）和二相痛（15～45 min）時(shí)期的抓臉時(shí)間顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，CBD 0.06 mg 可顯著降低小鼠在二相痛時(shí)期的抓臉總時(shí)間（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，在該模型下上唇右側(cè)sc 給予CBD 0.06 mg 可顯著降低二相痛時(shí)期模型小鼠的疼痛反應(yīng)，具有抗炎性痛作用。

Fig.2 Effect of CBD 0.06 mg on face rubbing time within 45 min（A），phaseⅠ（B）and phaseⅡ（C）pain in formalininduced orofacial inflammatory pain model mice.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 CBD 對(duì)福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛模型小鼠Sp5C和ACC腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)的影響

c-Fos熒光表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達(dá)均顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，模型+CBD 組的Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.01）。提示上唇右側(cè)sc 給予CBD 0.06 mg 可顯著降低模型小鼠Sp5C 和ACC 腦區(qū)c-Fos 蛋白表達(dá)，CBD 通過(guò)抑制痛覺(jué)上行傳導(dǎo)通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

Fig.3 Effect of CBD 0.06 mg on c-Fos expression in the trigeminal spinal tract nucleus caudal subnucleus（Sp5C）and ACC in formalin-induced orofacial inflammatory pain model mice detected by immunofluorescence analysis.See Tab.1 for the mouse treatment.The arrows indicate c-Fos positive neurons.B and C were the quantitative result of A.±s.n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 CBD對(duì)福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛模型小鼠PAG，BLA和ACC腦區(qū)內(nèi)源性大麻素變化水平的影響

光纖記錄結(jié)果（圖4）顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)內(nèi)源性大麻素變化水平均無(wú)顯著變化；與模型組小鼠相比，模型+CBD 0.06 mg 組小鼠BLA 腦區(qū)內(nèi)源性大麻素變化水平顯著升高（P＜0.05）（圖4B）。提示在福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛二相痛時(shí)期，上唇右側(cè)sc給予CBD 0.06 mg 可通過(guò)上調(diào)下行調(diào)控通路中內(nèi)源性大麻素水平來(lái)發(fā)揮抗炎性痛作用。

Fig.4 Effect of CBD 0.06 mg on changes of endocannabinoid（ECB）levels in periaqueductal gray（PAG，A），basal lateral amygdala（BLA，B），anterior cingulate cortex（ACC，C）during phase Ⅱpain in formalin-induced orofacial inflammatory pain model mice by fiber photometry recording.See Fig.1 for the mouse treatment.F：raw fluorescence signal；F0：baseline fluorescence signal.Change of levels of ECB=（F-F0）/F0.±s，n=5-6.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.4 探針表達(dá)驗(yàn)證

結(jié)果如圖5所示，注射腦核團(tuán)示意圖如圖5A 所示；熒光表達(dá)位置如圖5B 所示，在PAG，BLA 和ACC 腦區(qū)處均可見(jiàn)清晰的綠色熒光信號(hào)表達(dá)，證明探針表達(dá)良好且位置準(zhǔn)確；將所納入記錄的小鼠均進(jìn)行冰凍切片并對(duì)于探針埋植位置進(jìn)行描繪，如圖5C所示均準(zhǔn)確埋植于記錄目標(biāo)位置，表明記錄結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛模型小鼠預(yù)先上唇右側(cè)sc 給予CBD 0.03和0.06 mg 可顯著降低二相痛時(shí)期小鼠的疼痛反應(yīng)。CBD 可在二相痛時(shí)期發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，說(shuō)明其對(duì)于炎癥和中樞敏化均可能產(chǎn)生影響［14］，雖然本研究中并未探究CBD的抗炎作用，但有研究表明在礦物油致痛模型大鼠ip 給予CBD 可顯著降低炎性因子IL-1β 的表達(dá)［15］。并且，本課題組前期［16］研究發(fā)現(xiàn)，ip 給予CBD（30 和60 mg·kg-1）在福爾馬林誘導(dǎo)的口腔頜面部炎性痛二相痛時(shí)期具有鎮(zhèn)痛作用，且可通過(guò)降低唇部組織促炎因子來(lái)發(fā)揮抗炎性痛作用。以上結(jié)果提示CBD 對(duì)于緩解口面部炎性痛具積極作用。而在口面部炎性疼痛的臨床治療中，局部給藥可以提高病痛部位的局部藥物濃度，具有便捷、起效快的特點(diǎn)，通常會(huì)帶來(lái)更高的治療效率和依從性，所以對(duì)于這一給藥方式下藥物作用的研究具有較高的臨床價(jià)值。已有研究報(bào)道，右耳局部涂抹CBD 油10 g·L-1可緩解由巴豆油誘導(dǎo)的右耳炎性痛［17-18］，與本研究CBD 的鎮(zhèn)痛作用相似，進(jìn)一步說(shuō)明CBD局部給藥具有良好的生物利用度和治療效果，以上結(jié)果可能為之后的CBD 局部治療臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

上唇右側(cè)sc 給予CBD 是否可以通過(guò)影響中樞系統(tǒng)發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用是本研究關(guān)心的重點(diǎn)，本研究從中樞系統(tǒng)疼痛調(diào)節(jié)中重要的神經(jīng)物質(zhì)基礎(chǔ)-疼痛環(huán)路中的上行傳導(dǎo)和下行抑制兩個(gè)方面對(duì)CBD 鎮(zhèn)痛作用機(jī)制進(jìn)行了探究，但是需要指出的是本實(shí)驗(yàn)中局部給予CBD 的鎮(zhèn)痛作用也可能是首先通過(guò)影響注射部位的炎癥反應(yīng)或者抑制口腔頜面部痛覺(jué)感受器的電活動(dòng)，導(dǎo)致痛覺(jué)信號(hào)向中樞傳導(dǎo)的水平受到抑制，從而導(dǎo)致相關(guān)腦區(qū)c-Fos 因疼痛所激活的神經(jīng)元數(shù)量下降，以及內(nèi)源性大麻素的水平改變。CB2R 和瞬時(shí)感受器電位香草酸1 型受體（transient receptor potential vanilloid receptor 1，TRPV1R）很可能參與到CBD 鎮(zhèn)痛的外周受體機(jī)制。CB2R 主要分布于外周免疫系統(tǒng)，廣泛參與炎癥調(diào)節(jié)；TRPV1R 主要分布于傷害性感覺(jué)神經(jīng)元，在體內(nèi)主要參與傷害性信號(hào)的傳導(dǎo)以及痛覺(jué)調(diào)制。CBD 抑制FAAH 會(huì)使得AEA 升高，而AEA 可以激動(dòng)CB2R 以及TRPV1R［19-20］，Costa 等［21］發(fā)現(xiàn)ip 給予TRPV1R 抑制劑可逆轉(zhuǎn)CBD 在完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的足底炎性痛模型下的鎮(zhèn)痛作用，而Negrete等［22］在與上述相同疼痛模型中可通過(guò)ip給予CB2R激動(dòng)劑從而影響一氧化氮信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。另外，F(xiàn)AAH 水解AEA 后產(chǎn)物花生四烯酸是前列腺素的合成前體，CBD 也可能通過(guò)抑制FAAH 減少前列腺素的合成從而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。對(duì)于上行傳導(dǎo)通路，本研究選取了與口面部疼痛調(diào)節(jié)最為密切的2個(gè)腦區(qū)Sp5C與ACC進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示，預(yù)先sc 給予CBD 可顯著降低Sp5C 和ACC腦區(qū)的c-Fos 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量，提示CBD 可通過(guò)抑制痛覺(jué)上行傳導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮其作用。需要指出的是，有關(guān)口面部疼痛環(huán)路的最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)臂旁核是Sp5C 的下級(jí)核團(tuán)，因此本研究如果增加對(duì)于臂旁核c-Fos的檢測(cè)會(huì)更具有說(shuō)服力。

研究表明，在疼痛狀態(tài)下會(huì)引起腦內(nèi)或疼痛部位內(nèi)源性大麻素變化，Guindon 等［4］對(duì)注射福爾馬林5 和35 min 后的大鼠足部進(jìn)行取材，發(fā)現(xiàn)足爪背部中端和足爪背部近端的2-AG水平升高；Beaulieu等［23］檢測(cè)了不同濃度福爾馬林（0.9%，1%，2.5%和5%）誘導(dǎo)的相同模型的足底AEA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AEA 含量均無(wú)顯著變化。Petrosino 等［5］在神經(jīng)病理性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)第7 天的AEA 和2-AG 水平均顯著升高，而第3 天PAG 腦區(qū)的2-AG 無(wú)變化。內(nèi)源性大麻素在腦內(nèi)含量極低，且有著按需合成、降解迅速的特點(diǎn)。因此，即使采用更為靈敏的高效液相方法檢測(cè)組織中的內(nèi)源性大麻素含量，在某些研究中仍由于處死動(dòng)物后進(jìn)行檢測(cè)很可能錯(cuò)過(guò)了相應(yīng)變化窗口，導(dǎo)致并未檢測(cè)出內(nèi)源性大麻素變化。本研究首次在急性痛模型下采用最新的內(nèi)源性大麻素探針結(jié)合光纖記錄的方式，在疼痛的不同階段精準(zhǔn)并實(shí)時(shí)在體的記錄內(nèi)源性大麻素變化，結(jié)果顯示，預(yù)先sc 給予CBD 可顯著升高二相痛時(shí)期BLA的內(nèi)源性大麻素水平，但對(duì)其他兩個(gè)腦區(qū)內(nèi)源性大麻素水平無(wú)顯著影響。有研究表明，激活BLA-前額葉皮質(zhì)-PAG 這條下行抑制系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［24］；而Yin等［25］發(fā)現(xiàn)，腹外側(cè)中央導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)（ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG）-中央內(nèi)側(cè)核-BLA的新型神經(jīng)環(huán)路參與疼痛調(diào)節(jié)，表明BLA-PAG 具間接雙向投射關(guān)系。內(nèi)源性大麻素中AEA水平升高會(huì)激活CB1R，有研究表明，電針可通過(guò)激活vlPAG 的GABA 能神經(jīng)元中CB1R 來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［26］；而Deli 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在福爾馬林炎性痛模型中可通過(guò)激活BLA 的CB1R 來(lái)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。因此，推測(cè)CBD的中樞鎮(zhèn)痛作用可能通過(guò)BLA 的內(nèi)源性大麻素水平升高進(jìn)而激動(dòng)下行抑制系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮。在中樞層面，5-羥色胺1A受體（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1AR）同樣參與疼痛調(diào)節(jié)，CBD 是5-HT1AR 的激動(dòng)劑，Thapa 等［28］發(fā)現(xiàn)，ip給予5-HT1AR 拮抗劑WAY100635 可抑制CBD 在角膜疼痛模型下的鎮(zhèn)痛作用，表明CBD在炎性痛中的中樞受體機(jī)制復(fù)雜，因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中仍需通過(guò)ip給予相關(guān)受體拮抗劑來(lái)探究其中樞受體機(jī)制。關(guān)于本研究中對(duì)于其他腦區(qū)內(nèi)源性大麻素水平并無(wú)變化的現(xiàn)象，可能與取材部位及模型不同有關(guān)。此外，炎癥部位和中樞內(nèi)源性大麻素的變化在時(shí)程上并不統(tǒng)一，而神經(jīng)病理性疼痛在疼痛發(fā)生時(shí)即可迅速通過(guò)初級(jí)神經(jīng)元傳導(dǎo)至中樞產(chǎn)生痛覺(jué)，并引發(fā)較炎癥性疼痛更為持久的中樞敏化。需要指出的是，大麻素在腦中含量極低，其變化不容易捕捉，并且在本研究記錄過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一些小鼠的記錄噪音較大，故采用了組別變化值（最高值-最低值）進(jìn)行比較。本研究仍存在不足，以上結(jié)果并不能反映內(nèi)源性大麻素在絕對(duì)量上的改變，在之后的實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)測(cè)量絕對(duì)量的變化。另外，本研究光纖埋置更偏向于背外側(cè)中PAG，但也有文獻(xiàn)報(bào)道腹外側(cè)PAG 參與調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與鎮(zhèn)痛，如Yuan等［29］在腹外側(cè)PAG 給予CB1R 拮抗劑AM251 后可逆轉(zhuǎn)電針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛作用，提示后續(xù)研究可對(duì)于PAG進(jìn)行亞區(qū)的細(xì)分，以便進(jìn)一步探究CBD抗口腔頜面部炎性痛的中樞機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，sc 給予CBD 對(duì)于福爾馬林誘導(dǎo)的口面部疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，這一作用可能與CBD 抑制痛覺(jué)上行傳導(dǎo)以及激活下行抑制通路有關(guān)。