T-2毒素抗人食管癌細胞EC1的活性及其機制

馬永成，范霞霞，蘇楠

（1.河南省人民醫(yī)院藥學部，鄭州大學華中阜外醫(yī)院藥學部臨床藥理室，河南 鄭州 450003；2.河南牧業(yè)經濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450011）

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病。國家癌癥中心最新發(fā)布的《2022年全國癌癥報告》顯示，我國惡性腫瘤發(fā)病率及死亡數持續(xù)上升，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2200億［1］。由此可見，繼續(xù)研發(fā)新的高效抗癌藥物仍十分迫切。真菌來源的天然產物具有廣泛的生物活性，是活性天然產物及臨床藥物研發(fā)的重要分子庫和靈感來源。T-2 毒素屬于鐮刀菌（Fusarium）所產生的單端孢霉烯族毒素，是該類毒素中毒性最強的一種毒素［2］。T-2毒素結構中含有氧環(huán)和雙鍵活性單元，化學性質穩(wěn)定，室溫下放置7 年毒性不減［3］。近年研究表明，其通過抑制蛋白質和DNA 合成，對胸腺、骨髓、肝、脾和生殖腺等細胞分裂旺盛的臟器毒性明顯；此外，T-2 毒素還可引起細胞DNA 單鏈斷裂以及線粒體損傷，誘導細胞凋亡［4］。癌細胞也具有旺盛分裂的特征，推測T-2 毒素對腫瘤細胞可能具有較強的抑制活性。本研究從細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期阻滯和蛋白表達等水平研究T-2 毒素的抗癌作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

T-2 毒素（純度98%，批號902030），北京百靈威科技有限公司，使用二甲亞砜（DMSO）配成50 mmol·L-1的儲備液，使用前用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（使DMSO 終濃度＜0.1%）。MTT、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑2，7-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、線粒體膜電位檢測試劑JC-1和線粒體提取試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清，美國Gibco 公司；青鏈霉素混合液（100×）、FITC-annexin Ⅴ/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒和碘化丙啶（PI），北京索萊寶科技有限公司；兔抗人GAPDH（AB-P-R001）多克隆抗體，杭州賢至生物科技公司；兔抗人多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（46D11）、P21（12D1）和磷酸化的組蛋白2A 家族X 成員（phosphorylated H2A histone family member X，γ-H2AX）（Ser139，20E3）單克隆抗體，美國CST公司；小鼠抗人P53（6C4B6）、Bax（4G5E8）、細胞色素c（2D8D11）、細胞色素c 氧化酶Ⅳ（cytochrome c oxidase Ⅳ，COXⅣ）（2A7B2）、胱天蛋白酶3（2G4B2）和胱天蛋白酶7（3C9H4）單克隆抗體，美國Proteintech 公司；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠/兔IgG 抗體（二抗），中杉金橋公司；ECL 發(fā)光液，美國Advansta公司。

多功能酶標儀（Meta-Ready），德國BMG公司；實時無標記動態(tài)細胞分析（real time cell analysis，RTCA）儀（xCELLigence RTCA DP），美國Agilent公司；流式細胞儀（Accuri C6 Plus），美國BD公司；熒光顯微鏡（Eclipse Ni-U），日本Nikon公司；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon4600SF），上海天能生命科學有限公司。

1.2 細胞和細胞培養(yǎng)

人食管癌細胞EC109 和EC1，人胃癌細胞MGC-803 和人肺癌細胞H460 購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；人正常胃黏膜細胞GES-1 由本實驗室傳代凍存。于RPMI 1640培養(yǎng)基中分別加入胎牛血清（體積比10%）、青霉素（終濃度為1×108U·L-1）和鏈霉素（終濃度為100 g·L-1），配制完全培養(yǎng)液。所有細胞均使用該完全培養(yǎng)基在37 ℃，CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法測定細胞存活率

將人食管癌細胞EC109 和EC1，人胃癌細胞MGC-803 和人肺癌細胞H460，以及人正常胃粘膜細胞GES-1，以每孔5×103細胞接種于96 孔板，培養(yǎng)細胞至充分貼壁，加入T-2 毒素，使終濃度分別為0.375，0.75，1.5，3.0，6.25，12.5，25，50 和100 nmol·L-1，每濃度設6復孔。作用24，48或72 h后，加入MTT 溶液（終濃度為0.5 g·L-1），孵育4 h后，去除原培養(yǎng)基，加DMSO（每孔150 μL），室溫搖動15 min；充分溶解紫色結晶物后，使用酶標儀于490 nm 處測定吸光度（A490nm）值。細胞存活率（%）=（T-2 組A490nm-空白組A490nm/細胞對照組A490nm-空白組A490nm）×100%。

1.4 RTCA法實時分析EC1細胞增殖和遷移

1.4.1 細胞增殖實驗

參照文獻［5］，利用RTCA 技術進行細胞增殖分析。將EC1細胞以每孔4×103接種于RTCA專用板E-Plate 中，每孔加入RPMI 1640 完全培養(yǎng)基150 μL 后置于RTCA 設備中。將上述裝有E-Plate板的設備放入培養(yǎng)箱中，24 h 培養(yǎng)貼壁后，將細胞分為細胞對照組和T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1組，每組3 復孔。給藥后將RTCA 設備再次放入細胞培養(yǎng)箱中，設定RTCA 每30 min 檢測1次細胞指數（cell index，CI）值，于72 h 后停止檢測。CI 值越低，說明細胞增殖程度越小。

1.4.2 細胞遷移實驗

取對數生長期EC1 細胞，以無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，并調整細胞密度為1×108L-1，取160 μL細胞懸液接種至專用板上室中（CIM-Plate 16），下室中加入120 μL 含血清培養(yǎng)基。將細胞分為細胞對照組和T-2毒素5和10 nmol·L-1組。細胞遷移通過微孔膜，然后沉積到金阻抗電極上，使用RTCA每隔3 h記錄1次CI值，至48 h。

1.5 流式細胞儀檢測EC1 細胞早期凋亡率、細胞周期和ROS水平

T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1作用EC1 細胞48 h 后，離心收集細胞。按照試劑盒說明書進行FITC-annexinⅤ和PI熒光染料雙染色，通過流式細胞儀分析細胞凋亡率。使用預冷的70%乙醇垂懸細胞，4 ℃放置12 h。棄去上清液，PBS 洗2 遍后，利用熒光染色液（含有RNA 酶和100 mg·L-1PI）室溫避光染色30 min。流式細胞儀檢測DNA 含量，F(xiàn)lowJo 軟件分析細胞周期。加入適當體積無血清培養(yǎng)基配制的ROS 檢測探針DCFH-DA（10 μmol·L-1），在培養(yǎng)箱中孵育30 min。使用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，去除未結合的DCFH-DA，流式細胞儀檢測熒光值，以與細胞對照組熒光強度比值表示ROS水平。

1.6 熒光顯微鏡和流式細胞儀分別檢測EC1 細胞線粒體膜電位

參照文獻［6］，將EC1 細胞接種于6 孔板，使用T-2毒素5，10，20 nmol·L-1分別作用細胞48 h；將細胞離心收集于1.5 mL EP 管中，每管樣品中加入適量體積的JC-1 溶液（PBS稀釋至終濃度10 mg·L-1）垂懸細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中熒光染色15～30 min；用熒光顯微鏡或流式細胞儀分別對MMP 進行定性和定量分析。

1.7 Western 印跡法檢測細胞質和線粒體中細胞色素c含量及細胞中PARP、P21、γ-H2AX、P53、Bax和胱天蛋白酶3/7蛋白表達水平

將EC1 細胞以每孔6×104接種于6 孔板，細胞分為細胞對照組和T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1組，T-2 毒素作用細胞48 h 后，①參照線粒體分離試劑盒操作說明，提取各組細胞線粒體并保留胞質部分；②所得樣品分別經SDS-PAGE 電泳后，電轉印到醋酸纖維素膜；利用5%脫脂奶粉室溫膜封閉2 h，加入一抗（①抗細胞色素c、COX Ⅳ和GAPDH抗體；②抗PARP，P21，γ-H2AX，P53，Bax，胱天蛋白酶3/7 和GAPDH 抗體，均1∶1000 稀釋），4 ℃孵育過夜；充分洗膜后，加二抗（1∶6000）室溫下孵育2 h，加ECL 發(fā)光液，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結果。利用Image J 軟件測定目標蛋白積分吸光度值（integrated absorbance，IA），以目標蛋白IA 與內參蛋白IA比值表示目標蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數據以±s表示，采用GraphPad 6.0軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T-2毒素對4種癌細胞存活的抑制活性

如圖1A 所示，T-2 毒素顯著抑制4 種癌細胞存活，且在0～25 nmol·L-1濃度范圍內，細胞生存率隨著T-2 濃度升高而降低。T-2 毒素對EC109，EC1，MGC-803 和H460 細胞的IC50值分別為6.34，5.54，6.94 和5.96 nmol·L-1，對GES-1 的IC50值為16.4 nmol·L-1；在1.5～25 nmol·L-1范圍內，上述4種癌細胞存活率與GES-1 存活率相比明顯降低（P＜0.01）。圖1B顯示，T-2對EC1細胞的抑制作用呈現(xiàn)明顯的時間依賴性，24，48 和72 h 的IC50值分別為77.8，11.4 和6.0 nmol·L-1。由于EC1 相對敏感，后續(xù)研究皆以EC1為細胞模型；同時根據上述IC50值，選擇T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1作用該細胞48 h進行研究。

Fig.1 Effect of T-2 toxin on survival rate of four cancer cells and GES-1 cells by MTT assay.A：four cancer cells，EC109，EC1，MGC-803 and H460，as well as human gastric epithelial cells GES-1 were treated with T-2 toxin 0.375-100 nmol·L-1 for 72 h，respectively.B：the survival rate of EC1 cells after being treated by T-2 toxin for 24，48 h or 72 h.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with GES-1.

2.2 T-2毒素抑制EC1細胞增殖和遷移

由圖2A 可見，24 h 時加入T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1，從36 h 開始至檢測結束，各濃度組細胞活力（CI）值均明顯小于細胞對照組，且濃度越高，CI 值越小；在48 h 后，各濃度組CI 值與細胞對照組比較明顯降低（P＜0.01）。由圖2B 可見，T-2毒素處理組CI值顯著低于細胞對照組（P＜0.01），提示T-2 毒素處理組細胞遷移通過微孔膜的細胞數下降。表明T-2毒素抑制EC1細胞的生長和遷移。

Fig.2 Effect of T-2 on cell viability（A）and cell migration（B）of EC1 cells.EC1 cells were treated with T-2 toxin and the viability and migration were measured by real time cell analysis (RTCA).CI：cell index.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 T-2毒素誘導EC1細胞凋亡

圖3A 結果顯示，與細胞對照組相比，T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高（P＜0.01）；Western 印跡結果表明，與細胞對照組相比，T-2 毒素各濃度組細胞內酶原形式PARP明顯減少，剪切形式PARP顯著增加（圖3B，P＜0.01）。表明T-2毒素可誘導EC1細胞凋亡。

Fig.3 Effect of T-2 toxin on apoptosis in EC1 cells.After treatment with T-2 toxin for 48 h，EC1 cells were stained with FITCannexin V/PI and analyzed by flow cytometry（A），or were extracted with proteins，and the cleavage of PARP was detected by Western blotting（B）.A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 T-2毒素誘導EC1細胞周期阻滯

圖4A 結果顯示，T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1組G2/M 期細胞比例分別為（12.5±3.3）%，（18.7±3.8）%和（24.7±2.7）%，與細胞對照組（7.5±2.7）%相比顯著升高（P＜0.01）；與細胞對照組相比，T-2毒素可明顯上調周期抑制蛋白P21 的表達（P＜0.01）（圖4B）。表明T-2 毒素可將細胞周期阻滯于G2/M期，其機制可能與P21表達上調有關。

Fig.4 Effect of T-2 toxin on cell cycle distribution in EC1 cells.See Fig.3 for the cell treatment PI.A：cell cycle distribution detected by flow cytometry，A2 was the quantitative result of A1.B：P21 expression detected by Western blotting，B2 was the semiquantitative result of B1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 T-2毒素誘導EC1細胞線粒體膜電位降低

圖5A 結果顯示，細胞對照組呈現(xiàn)強紅橙色熒光，而T-2毒素組橙色熒光減弱且綠色熒光增強，表明T-2 毒素誘導了MMP 下降；與細胞對照組相比，T-2 毒素5，10 和20 nmol·L-1組MMP 顯著下降（P＜0.01）（圖5B）。Western 印跡實驗結果（圖5C）顯示，與細胞對照組相比，T-2 毒素組線粒體中細胞色素c 顯著下降（P＜0.01），而細胞質中細胞色素c 含量卻顯著增加（P＜0.01）。上述結果表明，T-2 毒素可使EC1 細胞MMP 下降，使細胞色素c 釋放，這可能是其誘導細胞凋亡的原因之一。

Fig.5 Effect of T-2 toxin on mitochondrial membrane potential（MMP）of EC1 cells.See Fig.3 for the cell treatment.A：the drop of MMP in EC1 cells imaged by fluorescence microscopy（200×）.B1：the changes of MMP quantified by flow cytometry，numbers in the bottom right gate represented the percentage of cells with low MMP；B2 was the statistical result of B1.C1：cytochrome c（Cyt c）release determined by Western blotting；C2 and C3 were the semi-quantitative results of C1.Cyt c oxidase Ⅳ（COX Ⅳ）and GAPDH were used as loading controls in mitochondria and cytoplasm，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 T-2 毒素對EC1 細胞ROS 水平，γ-H2AX，P53和Bax表達及對胱天蛋白酶3/7活化的影響

圖6A 結果顯示，與細胞對照組相比，T-2 毒素可增加EC1 細胞內ROS 水平（P＜0.01）。Western印跡結果（6B 和6C）顯示，與細胞對照組相比，T-2毒素組γ-H2AX，P53 和Bax 表達增加（P＜0.05，P＜0.01），并誘導了胱天蛋白酶3/7 剪切活化增加（P＜0.05，P＜0.01）。表明T-2毒素誘導的MMP下降和細胞凋亡可能與上述結果有關。

Fig.6 Effects of T-2 toxin on levels of ROS and protein expressions of γ-H2AX，P53，Bax and caspase3/7 in EC1 cells.See Fig.3 for the cell treatment，except that the cells were stained with DCFH-DA.A1：the intracellular levels of ROS determined by flow cytometer；A2 was the statistical analysis result of A.B1 and C1：protein levels measured by Western blotting.B2 and C2 were the semi-quantitative results of B1 and C1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the cell control group.

3 討論

本研究結果表明，T-2毒素可通過誘導凋亡和周期阻滯方式抑制癌細胞增殖，濃度在0.75 nmol·L-1時即展現(xiàn)出明顯抗癌活性。機制研究提示，T-2 毒素增加胞內ROS 水平，致使DNA 氧化損傷，激活轉錄因子P53表達，從而激活其靶基因p21（周期抑制因子）和Bax（線粒體靶向蛋白）的轉錄表達，最終引起癌細胞周期阻滯和線粒體參與的細胞凋亡。

相對于正常細胞，癌細胞更加依賴胞內氧化還原系統(tǒng)的平衡［7］。本研究結果也表明，正常胃黏膜細胞GES-1對T-2毒素的敏感性弱于癌細胞。T-2毒素結構中的氧環(huán)和雙鍵傾向與細胞內含巰基的蛋白分子、多肽或氨基酸結合，如半胱氨酸和谷胱甘肽等，從而可引起氧化還原系統(tǒng)的失衡，導致ROS水平的升高與累積［3］。過量ROS 可引起DNA 損傷，繼而誘導p53和其下游基因的表達［8］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，T-2 毒素可導致EC1 細胞ROS 增多，過量ROS導致DNA的氧化損傷（γ-H2AX增多），從而誘導抑癌因子P53表達，繼而轉錄激活P21、Bax等靶基因的表達，引起細胞周期阻滯和凋亡的發(fā)生。因此推測，氧化還原系統(tǒng)可能是T-2 毒素的一個重要靶點，但具體作用于哪個環(huán)節(jié)需進一步研究。

雖然本研究結果表明，T-2 毒素抑制癌細胞的IC50值低至納摩爾級，較臨床現(xiàn)有的多種化療藥物表現(xiàn)出更強的細胞毒性［9］，但T-2 毒素的腫瘤選擇性仍然較差，其對人體正常組織的不良反應不容忽視。為解決這一問題，研究人員已做了一些有意義的工作，如對其結構進行修飾以降低系統(tǒng)毒性［10］、利用腫瘤特異性單克隆抗體［11-12］或pH 敏感的脂質體包載T-2毒素［13］以提高腫瘤細胞的靶向性。這些研究為T-2 毒素未來的開發(fā)應用提供了技術手段，也為本文提供了理論支撐。

總之，T-2 毒素具備良好的抗癌潛力，對其進行深入研究或尋找類似結構的新型抗癌藥物具有重要的科研和應用價值。