不同結(jié)香方法對(duì)土沉香木質(zhì)部芳香物質(zhì)形成的影響

龐圣江,周再知,李英健,張 培,李忠國(guó),鄧碩坤

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,廣西憑祥 532600;2 南京林業(yè)大學(xué),南京 210037;3 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所,廣州 510520,4 廣西大學(xué),南寧 530004;5 廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站,廣西憑祥 532600;6 崇左憑祥友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)廣西野外科學(xué)觀測(cè)站研究站,廣西憑祥 532600)

沉香是沉香屬樹(shù)種含有油脂的木質(zhì)部分(俗稱“結(jié)香”),也是沉香屬樹(shù)種遭遇傷害、真菌侵?jǐn)_等外界脅迫,產(chǎn)生含有芳香氣味用于抵御不良因素的次生代謝產(chǎn)物[1]。沉香具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,通常應(yīng)用于高檔香料、名貴藥材、宗教用品和精細(xì)工藝雕刻用品;同時(shí),沉香因其具有獨(dú)特而優(yōu)異的香韻氣味,令人感覺(jué)愉悅舒適,在調(diào)節(jié)人體心理生理機(jī)能方面發(fā)揮著重要作用[2]。沉香主要由具有揮發(fā)性芳香物質(zhì)組成,包括色酮類、萜烯類和芳香族類化合物[3-4]。健康的沉香屬樹(shù)種木質(zhì)部呈白亮色,沉香有效成分少且香味不濃,香農(nóng)通過(guò)利用打洞、砍傷和火燒等傳統(tǒng)結(jié)香的方法,才能形成少量沉香。人工沉香無(wú)論色澤形態(tài)、香氣活性成分均有別于天然沉香;采用不同的結(jié)香方法,沉香屬樹(shù)種結(jié)香木質(zhì)部結(jié)構(gòu)變化、沉香形成時(shí)間及其揮發(fā)性香氣成分亦有差異,潘質(zhì)洪[5]研究認(rèn)為激素處理有利于土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色面積擴(kuò)大與芳香物質(zhì)的積累;Liu等[6]研究表明鉆孔誘導(dǎo)土沉香結(jié)香,所結(jié)沉香品質(zhì)相對(duì)稍好,但其產(chǎn)量低和結(jié)香時(shí)間長(zhǎng)。一些諸如火燒可適當(dāng)增加沉香產(chǎn)量[7-8],采用激素、無(wú)機(jī)鹽溶液混合處理,土沉香結(jié)香時(shí)間有所縮短且產(chǎn)量也相對(duì)較高[9-10],沉香品質(zhì)仍然參差不齊。可見(jiàn),盡管土沉香結(jié)香技術(shù)豐富多樣,還需要繼續(xù)積極創(chuàng)新和優(yōu)化結(jié)香技術(shù),才能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)量大質(zhì)優(yōu)的沉香,是人工種植土沉香的最終目的,也是沉香產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的一個(gè)重大難題。

土沉香(Aquilariasinensis)木質(zhì)部的變色范圍作為沉香產(chǎn)量的重要指標(biāo),通常縱向變色距離較長(zhǎng)而橫向?qū)挾容^窄,淀粉和可溶性糖含量變化,與具有芳香氣味的沉香物質(zhì)形成密切相關(guān)[9,11];醇溶性提取物直接決定沉香四醇含量,后者是沉香藥材的優(yōu)劣標(biāo)志物,《中國(guó)藥典》規(guī)定其不低于0.1%作為藥用的質(zhì)量指標(biāo)[12];土沉香結(jié)香木質(zhì)部中的芐基丙酮、愈創(chuàng)木醇和2-(2-苯乙基)色酮等主要特征香氣成分[13],也已被用作沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。

試驗(yàn)以12年生土沉香人工林為研究對(duì)象,通過(guò)設(shè)置鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌(Melanotusflavolivens)溶液誘導(dǎo)土沉香結(jié)香試驗(yàn),比較分析各處理的土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色范圍,淀粉和可溶性糖含量、醇溶性提取物、沉香四醇、揮發(fā)性香氣成分方面的差異,探討不同結(jié)香方法對(duì)土沉香木質(zhì)部芳香物質(zhì)形成的影響,為創(chuàng)新和優(yōu)化土沉香結(jié)香技術(shù)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于廣西憑祥市熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心夏石樹(shù)木園附近的沉香種植基地(106°89′E,22°11′N)。研究地氣候條件為南亞熱帶季風(fēng)氣候,年平均氣溫21～23 ℃,年平均降雨量1 060～1 780 mm,無(wú)霜期344～362 d,土壤為酸性紅壤土,為土沉香適宜栽培區(qū)。以12年生土沉香人工林為研究對(duì)象,選取長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)均勻,無(wú)嚴(yán)重病蟲(chóng)害植株開(kāi)展結(jié)香誘導(dǎo)處理。土沉香的平均胸徑(15.86±0.86) cm、平均樹(shù)高(7.78±0.26) m。

1.2 試驗(yàn)方法

2021年8月以來(lái),選擇晴朗天氣,在土沉香人工林試驗(yàn)地內(nèi),設(shè)置鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液誘導(dǎo)處理,不處理作為對(duì)照組。采用完全隨機(jī)區(qū)組排列,每個(gè)區(qū)組各處理10株,3次重復(fù),共計(jì)120株。鉆孔處理采用電鉆(鉆頭直徑10 mm),在土沉香樹(shù)體基部 0.5 m 處直至距離樹(shù)干的第一枝下高處0.5 m,上下洞口相距10 cm處,橫向排列鉆孔;火燒孔處理則是用直徑為12 mm的火燒鋼釬,鐵錘輔助往土沉香樹(shù)體鉆孔;1 L黃綠墨耳菌溶液用大樹(shù)營(yíng)養(yǎng)液袋分裝2袋,以輸液方式注入土沉香樹(shù)體進(jìn)行結(jié)香處理。2022年10月,即處理12個(gè)月后,每個(gè)處理隨機(jī)取樣5株,于土沉香樹(shù)體鉆孔上下1～3 cm處的鑿取適量結(jié)香木質(zhì)部,取樣后用錫箔紙包好拿回實(shí)驗(yàn)室自然晾干,粉碎研磨成細(xì)粉末。每次稱取過(guò)40目篩的沉香粉末,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.1 土沉香木質(zhì)部組織變色范圍

土沉香經(jīng)過(guò)打孔、火燒孔和菌液一定時(shí)間處理,結(jié)香木質(zhì)部有明顯的含油性沉香物質(zhì),且具有特殊的芳香氣味,淺色區(qū)(變色材)、深色區(qū)(沉香材)界限明顯,剝?nèi)?shù)皮和白邊材,可直接初步判別土沉香木質(zhì)部變色情況(圖1)。取樣時(shí),土沉香剝皮和用勾刀刨去外圍一部分白邊材,采用直尺和電子游標(biāo)卡尺,分別測(cè)量淺色區(qū)、深色區(qū)的橫向?qū)挾?處理孔為中心,沿左、右方向的寬度)、縱向長(zhǎng)度(處理孔為中心,沿上、下方向的長(zhǎng)度)[9,11]。

圖1 3種結(jié)香技術(shù)獲得的土沉香標(biāo)本Fig.1 A. sinensis samples obtained from three agarwood-induction technique treatments

1.2.2 淀粉和可溶性糖含量

取樣前于土沉香鉆孔上方3.0～5.0 cm處鉆取結(jié)香木質(zhì)部小木塊,錫箔紙包好放入液氮里速凍。當(dāng)天將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,用液氮磨成粉并置于-80 ℃溫冰箱臨時(shí)保存,蒽酮-硫酸比色法和硝酸鈣法測(cè)定淀粉和可溶性糖含量[9]。

1.2.3 醇溶性提取物測(cè)定

根據(jù)林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 2904—2017《沉香》方法[14],采用電子稱準(zhǔn)確取2 g沉香粉末,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(色譜純)超聲波提取 2 h,靜置3～5 min后,過(guò)0.45 μm濾膜獲取懸浮液,重復(fù)提取3次,待液體揮發(fā)至恒重,稱其質(zhì)量計(jì)算醇溶性提取物含量[15]。

1.2.4 沉香四醇和揮發(fā)性成分

按照1.2.3節(jié)操作步驟,每次提取10 mL乙醇提取物,溶劑揮發(fā)后用乙酸乙酯定容2 mL,過(guò)濾干燥后,在廣西大學(xué)林產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心采用GC-MS(日本島津),DB-5ht專用色譜柱(250 m×4.6 mm,5 μm),對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行沉香四醇和揮發(fā)性成分測(cè)定。

沉香四醇:根據(jù)2020版《中華人民共和國(guó)藥典》測(cè)定沉香四醇含量,沉香四醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為30 μg/mL(由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供),采用LC-20A液相色譜儀(日本島津),色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測(cè)沉香四醇含量。

揮發(fā)性成分:稱取2 g沉香粉末,按步驟1.2.3節(jié)的操作獲取乙醇提取物,進(jìn)行GC-MS上機(jī)檢測(cè)揮發(fā)性成分。色譜條件:升溫程序,起始溫度90 ℃保持1 min后,以5 ℃/min升溫至150 ℃,保持5 min;再以 5 ℃/min 的升速至260 ℃,保持10 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%),載氣流量0.5 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,溶劑延遲4 min。質(zhì)譜條件:離子源接口溫度為250 ℃,電離方式 EI;電子能量70 eV,質(zhì)量掃描范圍35～350 m/z。

利用 GC-MS Postrun Analysis軟件,根據(jù)色譜峰的保留指數(shù)和質(zhì)譜碎片信息檢索 NIST 譜庫(kù)(2014),確認(rèn)化學(xué)成分。采用沉香四醇的保留時(shí)間作為基準(zhǔn),對(duì)GC-MS總離子流圖和HPLC中的色譜峰進(jìn)行保留時(shí)間校正,用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件,尋找共有峰并計(jì)算峰面積[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析,Duncan法進(jìn)行多重比較,用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土沉香木質(zhì)部組織變色范圍

從表1可以看出,3種結(jié)香方法對(duì)土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色范圍的影響各異,對(duì)照組土沉香木質(zhì)部未結(jié)香均為白邊材。從土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色大小范圍來(lái)看,黃綠墨耳菌溶液處理>火燒孔處理>鉆孔處理。

表1 土沉香木質(zhì)部組織橫向和縱向變色范圍

其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香木質(zhì)部(沉香材部分)變色范圍最大,縱向變色距離最長(zhǎng)達(dá)120.02 cm,橫向變色距離最寬達(dá)3.84 cm,離輸入孔越近深色區(qū)域范圍越大。鉆孔和火燒孔誘導(dǎo)土沉香木質(zhì)部變色范圍,持續(xù)存在沒(méi)有規(guī)律性的變色材和沉香材;沉香材縱向變色距離均超過(guò)110 cm,但橫向變色距離最寬僅為0.58 cm和1.06 cm,而后者變色范圍優(yōu)于前者處理。

2.2 土沉香木質(zhì)部組織淀粉和可溶性糖含量

從圖2可以看出, 3種方法處理的土沉香結(jié)香木質(zhì)部淀粉含量均顯著低于CK處理(P<0.05),降幅范圍為24.82%～55.25%;其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香結(jié)香木質(zhì)部淀粉含量降幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理降幅最小。此外,黃綠墨耳菌溶液和火燒孔處理土沉香結(jié)香木質(zhì)部可溶性糖含量均顯著高于CK處理(P<0.05),鉆孔處理與CK處理差異不顯著(P>0.05),三者漲幅范圍為23.76%～46.87%;其中,黃綠墨耳菌溶液處理土沉香結(jié)香木質(zhì)部可溶性糖含量漲幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理漲幅最小,說(shuō)明不同結(jié)香方法處理后,土沉香結(jié)香木質(zhì)部淀粉出現(xiàn)不同程度的消耗,促進(jìn)了可溶性糖轉(zhuǎn)化積累,黃綠墨耳菌溶液處理效果最為明顯。

柱狀圖上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。圖2 土沉香木質(zhì)部組織淀粉和可溶性糖含量Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.Fig.2 Starch content and soluble sugar content of xylem tissue of A. sinensis

2.3 土沉香醇溶性提取物和沉香四醇含量

從圖3可以看出,鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液處理的土沉香樣品醇溶性提取物含量分別達(dá)到11.84%、13.26%和21.08%,均顯著高于對(duì)照處理(P<0.05)。各方法誘導(dǎo)處理的所有土沉香樣品醇提物含量在11.84%～21.08%之間,均達(dá)到林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 2904—2017《沉香》鑒定標(biāo)準(zhǔn),但醇溶性提取物含量卻各有差異。其中,黃綠墨耳菌溶液處理效果最優(yōu),與其他處理均存在顯著差異(P<0.05);鉆孔和火燒孔處理的效果次之,二者之間的差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明黃綠墨耳菌溶液處理更有利于提高沉香醇溶性提取物含量。

圖3 土沉香木質(zhì)部組織醇溶性提取物和沉香四醇含量Fig.3 The alcohol soluble extractive content and agarotetrol content of xylem tissue of A. sinensis

3種方法處理的沉香四醇含量分別達(dá)到0.18%、0.26%和0.42%,CK處理未檢測(cè)出沉香四醇。各誘導(dǎo)處理的所有沉香四醇含量在0.18%～0.42%之間,均超過(guò)2020年版《中國(guó)藥典》所規(guī)定的0.1%含量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)沉香四醇含量高低順序依次為黃綠墨耳菌溶液處理>火燒孔處理>鉆孔處理,且各處理間存在顯著差異(P<0.05)。由此可見(jiàn),黃綠墨耳菌溶液處理更有利于提高沉香四醇含量。

2.4 土沉香香氣揮發(fā)性成分

通過(guò)GC/MS方法分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種方法處理的土沉香結(jié)香木質(zhì)部芳香物質(zhì)形成過(guò)程中,共鑒定出46種主要揮發(fā)性香氣成分(表2)。

表2 結(jié)香誘導(dǎo)處理所得土沉香主要揮發(fā)性香氣成分

鉆孔處理土沉香芳香物質(zhì)中共鑒定出29種成分,占總峰面積的66.79%;主要成分包括色酮及其衍生物(16.40%)、沉香螺醇(7.35%)、愈創(chuàng)木醇(6.34%)、香樹(shù)烯(5.49%)、芐基丙酮(5.47%)、二氫卡拉酮(5.28%)和枯蘇醇(3.59%)。火燒孔處理土沉香芳香物質(zhì)中共鑒定出 33種成分, 占總峰面積的70.92%;主要成分是色酮及其衍生物(16.58%)、沉香螺醇(8.67%)、愈創(chuàng)木醇(7.45%)、二氫卡拉酮(5.52%)、香樹(shù)烯(5.24%)、枯蘇醇(4.26%)、芐基丙酮(4.23%)和α-檀香醇(3.05%)。黃綠墨耳菌溶液處理土沉香芳香物質(zhì)中共鑒定出36種成分,占總峰面積的76.78%;主要成分是色酮及其衍生物(21.87%)、沉香螺醇(8.56%)、愈創(chuàng)木醇(8.32%)、芐基丙酮(6.82%)、二氫卡拉酮(3.06%)、香樹(shù)烯(2.83%)、枯蘇醇(2.82%)和壬醛(2.81%)。

3 討 論

本研究中鉆孔、火燒孔和黃綠墨耳菌溶液處理,對(duì)土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色范圍的影響各異;其中,以黃綠墨耳菌溶液處理的變色范圍最大,深色區(qū)(沉香材)縱向變色距離最長(zhǎng)達(dá)120.02 cm,橫向變色距離最寬達(dá)3.84 cm。鉆孔或火燒孔的變色范圍較小,屬于沒(méi)有規(guī)律性的沉香材。這與其他方法的土沉香結(jié)香,出現(xiàn)類似心材變色現(xiàn)象有一定相似性[9,17],尤其是菌液處理之后通過(guò)蒸騰作用,向上輸導(dǎo)所引起土沉香樹(shù)體防御反應(yīng),更有利于木質(zhì)部芳香物質(zhì)的積累。有學(xué)者研究認(rèn)為,有色物質(zhì)大多數(shù)來(lái)源于含氧酚羥基或者碳基,這些助色自由基與土沉香結(jié)香木質(zhì)部變色有密切關(guān)系,主要通過(guò)淀粉代謝經(jīng)由可溶性糖類化合物轉(zhuǎn)化而來(lái)[18-19]。

本研究表明,3種方法處理土沉香結(jié)香木質(zhì)部淀粉和可溶性糖含量(除鉆孔)均顯著低于CK處理(P<0.05)。其中,菌液處理的淀粉含量降幅最大,火燒孔處理次之,鉆孔處理降幅最小;可溶性糖含量在這些組織結(jié)構(gòu)內(nèi)增加,增幅則相反之。前人研究認(rèn)為可能與人工誘導(dǎo)土沉香樹(shù)體所產(chǎn)生的生理響應(yīng)有關(guān)[20-21],木質(zhì)部淀粉加速轉(zhuǎn)化為可溶性糖,增強(qiáng)自身代謝能力,利于具有芳香氣味的物質(zhì)形成以抵御外界脅迫。

3種方法處理土沉香的醇溶性提取物含量分別達(dá)到11.84%、13.26%和21.08%,顯著高于CK處理(P<0.05)。也高于半截干或接菌處理1年左右土沉香[22],通體結(jié)香技術(shù)處理為11.15%～24.02%[23],與本研究結(jié)果基本一致,說(shuō)明不同方法處理土沉香的醇溶性提取物含量各有差異。3種方法處理的沉香四醇含量分別達(dá)到0.18%、0.26%和0.42%,這與其他人工促進(jìn)土沉香結(jié)香,檢測(cè)的沉香四醇含量無(wú)明顯差別[24]。總體上來(lái)看,本研究3種方法處理1年后,沉香四醇含量均超過(guò)0.1%的藥用標(biāo)準(zhǔn),這可能與土沉香結(jié)香的時(shí)間有關(guān),積累時(shí)間越長(zhǎng)沉香品質(zhì)才更優(yōu)質(zhì)。

研究顯示,3種方法處理的土沉香結(jié)香木質(zhì)部芳香物質(zhì)主要是色酮及其衍生物(16.40%～21.87%)、沉香螺醇(7.35%～8.56%)、愈創(chuàng)木醇(6.34%～8.32%)、香樹(shù)烯(2.83%～5.49%)、芐基丙酮(4.23%～6.82%)、二氫卡拉酮(3.06%～5.52%)和枯蘇醇(2.82%～4.26%)。而采用生物接菌、火燒和化學(xué)刺激法誘導(dǎo)處理[25-27],所得沉香螺旋醇、沉香呋喃、白木香醛、芐基丙酮、對(duì)甲氧基芐基丙酮和矛蒼術(shù)醇是沉香主要芳香物質(zhì),與本研究結(jié)果有所差異。與2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、沉香螺醇、愈創(chuàng)木二烯-15-醛、二氫卡拉酮和雪松醇是馬來(lái)沉香(A.malaccensis)主要芳香物質(zhì)也有一定區(qū)別[28-29]?？梢?jiàn),土沉香結(jié)香木質(zhì)部芳香物質(zhì)的化學(xué)成分及其相對(duì)含量方面的差異,可能與沉香屬樹(shù)種、結(jié)香方法、結(jié)香時(shí)長(zhǎng)和遺傳因素存在密切關(guān)聯(lián)[30-31]。

土沉香結(jié)香木質(zhì)部芳香物質(zhì)中,色酮及其他衍生物、沉香螺醇、二氫卡拉酮和枯蘇醇帶有木質(zhì)和堅(jiān)果香氣,是最具有強(qiáng)烈的芳香活性成分之一。這與馬來(lái)沉香、近全緣沉香(A.subintegra)和柯拉斯那沉香(A.crassna) 揮發(fā)性香氣成分研究結(jié)果[32]相似,是土沉香芳香物質(zhì)的重要成分。另外,一些諸如白木香醛、二氫沉香呋喃、雅欖酮、纈草烯醛、愈創(chuàng)木-4,11-二烯和α-布藜烯等低濃度香氣物質(zhì),也有助于提升沉香香韻氣味。3種方法處理土沉香所含的芐基丙酮、欖香素、4-苯基-2-丁酮、纈草-4,7(11)-二烯和香木蘭烷的香氣貢獻(xiàn)率也比較大,甜果香、花香和藥草香歸因于該類物質(zhì)存在;壬醛、環(huán)氧異香橙烯、香樹(shù)烯、丁酸丁酯、4-叔丁基間二甲苯和間二甲苯是甜香的主要香氣來(lái)源,說(shuō)明沉香香氣是不同揮發(fā)性成分的氣味物質(zhì)之間的平衡。