陜西省野生擬黑蟲草的多基因分子生物學(xué)鑒定

孟桂花,李孟樓,王春燕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西楊凌 712100)

蟲草是蟲生真菌寄生于昆蟲蟲體后形成的菌蟲復(fù)合體,包括寄生真菌和寄主昆蟲兩部分。長期以來,人們習(xí)慣將蟲生真菌、蟲生真菌與其寄主形成的復(fù)合體均稱為蟲草,而未將二者區(qū)分開,造成了名稱使用上的混亂,易引起非專業(yè)人員的混淆。為此,Zhang等[1]提出了新的術(shù)語規(guī)則:在僅指形成蟲草的蟲生真菌時使用蟲草菌、冬蟲夏草菌等名稱,而涉及到蟲生真菌與寄主形成的復(fù)合體時使用蟲草、冬蟲夏草等名稱,由此避免名稱混淆。蟲草菌是廣義蟲草屬(Cordycepss. l.)所有真菌的統(tǒng)稱,作為昆蟲病原真菌,可被開發(fā)成生防菌劑,在害蟲生物防治領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[2]。蟲草菌隸屬于子囊菌門(Ascomycota),是子囊菌中多樣性較高的類群之一,全世界已報道的蟲草菌有近千種[3],中國已報道的蟲草菌約120種[4]。蟲草菌不僅種類繁多,其寄主種類也比較復(fù)雜,不同蟲草菌侵染的昆蟲種類及范圍不同,因此僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)很難對蟲草種類進行準確的分類鑒定。近年來,分子生物學(xué)技術(shù)在蟲草菌物種鑒定及其與相關(guān)屬真菌之間親緣關(guān)系的認定中發(fā)揮了重要作用[2],極大提升了蟲草物種分類鑒定的效率和準確性。

在分子生物學(xué)鑒定過程中,由于絕大多數(shù)單基因系統(tǒng)進化樹在某些關(guān)鍵節(jié)點上的支持率較低、聚類可信度不高,因而僅依靠單基因進行物種的分類鑒定存在一定的局限性[4]。多基因涵蓋的信息比單基因多,通過聯(lián)合多個DNA片段構(gòu)建的多基因系統(tǒng)進化樹能更可靠地反映物種之間真正的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[5-6],也能明顯提高進化樹的分辨率和可信度[7]。如今,多基因聯(lián)合分析也被廣泛地用于蟲草菌分類地位的鑒定中[8-9]。Sung等[10]利用核糖體大亞基LSU和小亞基SSU、RNA聚合酶Ⅱ大亞基RPB1和小亞基RPB1及EF-1α等多個基因位點對蟲草類真菌進行了系統(tǒng)分類,將廣義的蟲草屬重新分成了4個屬:狹義蟲草屬(Cordycepss. s.)、鹿蟲草屬(Elaphocordyceps)、異蟲草屬(Metacordyceps)和線蟲草屬(Ophiocordyceps),該分類系統(tǒng)被學(xué)術(shù)界廣泛認可和接受。

張興民等[11]根據(jù)蟲草子座及蟲體形態(tài),將陜西省旬邑縣石門山林區(qū)采集到的野生蟲草初步鑒定為山西省報道過的香棒蟲草(O.barnesii),但該林區(qū)蟲草的產(chǎn)量比山西的香棒蟲草大,且發(fā)現(xiàn)的寄主昆蟲僅小闊脛絨金龜(Maladeraovatula)1種,而已報道的香棒蟲草的寄主種類比較復(fù)雜,因此該蟲草是否為香棒蟲草需進一步驗證。本研究在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上,通過多基因序列分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建,以Wang等[12]建立的多基因系統(tǒng)進化樹為佐證,明確石門山林區(qū)蟲草的種類及其蟲草菌的分類地位,以期豐富陜西省的蟲草真菌資源,為陜西省蟲草資源的保護和可持續(xù)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標本采集

野生蟲草標本采集自陜西省旬邑縣石門山林區(qū)。刮去采集的蟲草表面土壤后用報紙包裹放入滅菌的塑封袋中,置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 形態(tài)觀察

測量蟲草子實體及蟲體的長度和直徑,用體視顯微鏡觀察蟲草子實體的著生位置、子實體頂部和蟲體的形態(tài),拍照并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 DNA提取

在超凈工作臺內(nèi),使用無菌手術(shù)剪將蟲草子實體和蟲體分別剪成長5 mm的小段置于培養(yǎng)皿中,依次用升汞水溶液浸泡30 s,75%酒精浸泡3 min,無菌水清洗4～5次。用無菌濾紙吸干樣品表面的水后將其放入無菌研缽中,加入液氮研磨成粉末。最后,用CTAB法[13]提取DNA作為后續(xù)基因擴增的模板。

1.3.2 目的基因擴增及測序

使用3對引物(ITS1和ITS4[14]、983F和2218R[15]、CRPB1和RPB1Cr[16],由上海生物工程技術(shù)公司合成)對蟲草菌DY6F的3個DNA序列位點(ITS、EF-1α和RPB1)分別進行擴增,擴增體系參照仇飛[17]的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于紫外透射下觀察PCR條帶,檢測合格后送至陜西楊凌天潤奧科生物公司進行雙端測序。

1.3.3 序列比對和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將測序所得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對,并從GenBank中分別下載同源性較高的ITS、EF-1α和RPB1基因序列,用ClustalW進行基因序列的比對,序列兩端截齊后使用Mega7.0構(gòu)建單基因Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)進化樹,進化樹各分支上的數(shù)值為經(jīng)1 000次Bootstrap后的置信度。利用PhyloSuite v1.2.2(http://phylosuite.jushengwu.com/)軟件將EF-1α和RPB1的基因序列串聯(lián)成數(shù)據(jù)集,通過ModelFinder計算這2個基因序列的最佳模型,并用Mr-Bayes的貝葉斯推理法(Bayesian Intreence,BI)構(gòu)建多基因系統(tǒng)進化樹,通過節(jié)點上的后驗概率值(Bayesian posterior probability,BP)評估構(gòu)建的進化樹,最后用Chiplot網(wǎng)站(https://www.chiplot.online/tvbot.html)進行系統(tǒng)進化樹的美化[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

蟲草子實體從寄主昆蟲幼蟲頭部的下側(cè)方長出,單生,無分支,棍棒狀(圖1,A),頂部呈圓形或鈍頭狀(圖1,B),長度為3～6.2 cm,直徑為0.1～0.2 cm;新鮮時為黃褐色,曬干后呈棕褐色,品相較差。寄主為金龜子幼蟲(又稱蠐螬),蟲體粗而肥,黃色,呈直線型或C型彎曲,長度為1.2～1.9 cm,直徑0.2～0.6 cm(圖1,C)。

A.蟲草子實體形態(tài);B.蟲草子實體頂部;C.寄主。圖1 蟲草標本的形態(tài)特征A. Morphological characteristics of fruiting body;B. Top of fruiting body; C. Host.Fig.1 Morphological characteristics of cordyceps

2.2 序列比對及系統(tǒng)進化分析

2.2.1 基因測序結(jié)果與序列比對

研究獲得蟲草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因片段的長度分別為576,921,732 bp,將所得序列提交至GenBank,獲取登錄號分別為OQ711778、OQ828437、OQ828436。NCBI在線Blast比對的結(jié)果顯示,這3個基因的序列與擬黑蟲草菌(O.nigrella)相應(yīng)基因序列的相似度最高(99%～100%),而與線蟲草屬(Ophiocordyceps)其他種相應(yīng)基因序列的相似度只在80%～90%之間。由此可見,蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌的親緣關(guān)系最近。

2.2.2 單基因系統(tǒng)進化分析

基于所獲得的蟲草菌DY6F的3個基因片段的序列,以及下載的相似度較高的其他物種的基因序列,分別構(gòu)建了ITS(圖2)、EF-1α(圖3)和RPB1(圖4)單基因NJ系統(tǒng)進化樹。這3個進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致,蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌聚集于同一個分支,支持率達到100%,表明蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌的遺傳距離最近。但基于ITS和RPB1基因序列構(gòu)建的單基因NJ系統(tǒng)進化樹中,不同種的很多上級分支節(jié)點的支持率都低于60%,聚類可信度相對較低。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences

圖3 基于EF-1α序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on EF-1α sequences

圖4 基于RPB1序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on RPB1 sequences

2.2.3 多基因聯(lián)合系統(tǒng)進化分析

通過ModelFinder計算出的EF-1α和RPB1基因數(shù)據(jù)分區(qū)的最佳模型為GTR+G+I,它們的串聯(lián)序列數(shù)據(jù)集由1 641個堿基組成,其中GC含量為56.7%,AT含量為43.3%。所構(gòu)建的多基因系統(tǒng)進化樹各分支的支持率較高,除3個分支節(jié)點外,支持率均超過95%;不同種上級分支節(jié)點的支持率也比單基因系統(tǒng)進化樹中同一節(jié)點的支持率高,線蟲草屬內(nèi)同種不同菌株均能聚集于同一分支,且支持率均為100%(圖5)。這表明,所構(gòu)建的多基因系統(tǒng)進化樹的聚類結(jié)果較為可信。

圖5 基于EF-1α和RPB1序列聯(lián)合矩陣構(gòu)建的BI系統(tǒng)進化樹Fig.5 BI phylogenetic tree inferred from combined EF-1α and RPB1 sequences

多基因系統(tǒng)進化樹大致可分為3個不同的系統(tǒng)進化支,分別為Hirsutella進化支、O.sobolifera進化支和O.ravenelii進化支;在O.ravenelii進化支的亞分支ravenelii-scarabaeidae中,O.highlandensis、O.konnoana和O.barnesii形成1個姐妹群,O.ravenelii、O.superficialis和擬黑蟲草菌形成1個姐妹群,而蟲草菌DY6F與擬黑蟲草菌聚于同一分支,支持率為100%(圖5)。綜上所述,蟲草菌DY6F被鑒定為擬黑蟲草菌,石門山林區(qū)發(fā)現(xiàn)的野生蟲草為擬黑蟲草,這是陜西省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的又一種新的蟲草資源。

3 討 論

多基因聯(lián)合分析能突破單基因分析的局限,可以更準確地反映菌株間的親緣關(guān)系及分類地位。本研究基于蟲草菌DY6F的ITS、EF-1α和RPB1基因序列分別構(gòu)建了單基因及多基因聯(lián)合系統(tǒng)進化樹,最終將陜西省旬邑縣石門山林區(qū)的蟲草菌DY6F鑒定為擬黑蟲草菌,野生蟲草鑒定為擬黑蟲草。擬黑蟲草是擬黑蟲草菌寄生于金龜子幼蟲后形成的菌蟲復(fù)合體,擬黑蟲草菌是廣義蟲草屬的一種,隸屬子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)、線蟲草屬(Ophiocordyceps)[10]。國內(nèi)外關(guān)于擬黑蟲草的研究相對較少,日本曾報道過擬黑蟲草的生長環(huán)境和宏觀形態(tài)特征[19],國內(nèi)有學(xué)者對山西境內(nèi)采集到的擬黑蟲草的遺傳多樣性及其區(qū)系真菌多樣性進行了研究[20-21]。本研究首次在陜西省發(fā)現(xiàn)了擬黑蟲草,增加了擬黑蟲草在中國的分布地區(qū),為擬黑蟲草這一珍稀蟲草資源的利用提供了基礎(chǔ)。

陜西省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的植物新類群較多[22-24],而關(guān)于蟲草的報道相對較少,目前已發(fā)現(xiàn)的蟲草種類有變形蟲草(O.variabilis)、布氏蟲草(C.brongniartii)[25]及秦巴蛹蟲草(C.militaris)[26]等,主要分布于秦嶺地區(qū)。本研究鑒定所得的擬黑蟲草是陜西省新發(fā)現(xiàn)的一種蟲草資源。張興民等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn),旬邑縣藥商從2016年起就開始大量收購擬黑蟲草(曾被鑒定為香棒蟲草),每1 kg價格在600元以上,表明擬黑蟲草具有很高的藥用價值和市場前景。但目前關(guān)于擬黑蟲草生物學(xué)及化學(xué)藥理成分的研究很少,無法明確其質(zhì)量、藥用功能及作用,阻礙了擬黑蟲草的開發(fā)利用。野生冬蟲夏草資源極度缺乏,國內(nèi)外學(xué)者長期致力于冬蟲夏草的人工培養(yǎng)及其替代品的研究。培育近緣種作為冬蟲夏草替代品具有最大的優(yōu)勢[27-28],擬黑蟲草與冬蟲夏草同科同屬,親緣關(guān)系較近,具有冬蟲夏草替代品的潛能,本研究未分離培養(yǎng)出擬黑蟲草無性型。因此,后續(xù)需加強擬黑蟲草的生物學(xué)特性及人工培育技術(shù)研究,深入考察擬黑蟲草的藥效,揭示其藥用價值,明確其被開發(fā)成冬蟲夏草替代品進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可行性和市場前景,并建立科學(xué)合理的保護和可持續(xù)利用機制。