Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的協(xié)同抑制作用

朱澤康，王 昭，聶 蓉，劉國(guó)榮，2，3*

（1 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京100048 2 北京工商大學(xué)老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100048 3 北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048）

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)全球每年有6 億人感染食源性疾病，大多數(shù)病例是食用受致病性微生物污染的食品導(dǎo)致[1]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的可引發(fā)嘔吐、腹瀉等食物中毒不良癥狀的食源性革蘭氏陰性致病菌，在醫(yī)院感染獲得性食源性致病菌病的病例中，銅綠假單胞菌所引起的占比為10%左右[2]。它常見于腐敗的水產(chǎn)品、肉類及涼拌即食產(chǎn)品等，如蔬菜沙拉、魚罐頭等[3-4]。

生物被膜（Biofilm，BF）是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多種胞外基質(zhì)互相黏結(jié)、圍繞自身而形成的具有某些特定功能或結(jié)構(gòu)的膜。BF 的存在能提高銅綠假單胞菌在各種環(huán)境中定植能力及耐藥性，其耐藥性比浮游態(tài)細(xì)菌高出10～1 000 倍[5]。BF對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用，不僅可以阻止抗生素等藥物發(fā)揮作用，還可以幫助逃脫免疫吞噬細(xì)胞，導(dǎo)致其難以清除[6]。同時(shí)，銅綠假單胞菌的生物被膜對(duì)多種物理手段，如高溫高壓、消毒劑、紫外線照射等具有較強(qiáng)的抵抗力，從而提升了食品中感染銅綠假單胞菌的幾率與治理難度[7]。因此，有必要尋找某些藥物來(lái)有效抑制銅綠假單胞菌BF 的生成。

乳酸鏈球菌素（Nisin）是乳酸鏈球菌所分泌的具有抑菌作用的多肽，Nisin 是被FDA/WHO 認(rèn)證并允許用作食品添加劑且商業(yè)化的細(xì)菌素，它具有高效抑菌性、高安全性、無(wú)殘留等特性，能有效抑制或殺死革蘭氏陽(yáng)性菌（Gram-positive bacteria，G+）[8]。然而，G+與革蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria，G-）的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，Nisin 對(duì)于G-一般無(wú)抑制效果，因銅綠假單胞菌的BF 存在，故可將Nisin 阻擋在胞外，僅對(duì)銅綠假單胞菌起很少的作用[9]。此外，Nisin 的生產(chǎn)成本高，不利于在食品工業(yè)中大規(guī)模使用。研究表明，通過(guò)改變作用時(shí)的pH、溫度或者聯(lián)合其它物質(zhì)能夠有效增加G-對(duì)Nisin 的敏感性，以及降低Nisin 的使用量[10-11]。有人發(fā)現(xiàn)某些中藥成分對(duì)銅綠假單胞菌的BF 有一定的抑制作用，如董滿園等[12]發(fā)現(xiàn)150 μmol/mL 和厚樸酚對(duì)銅綠假單胞菌PAO1 有抑制作用。謝林利等[13]發(fā)現(xiàn)2 μg/mL 的黃芩素可以顯著抑制銅綠假單胞菌X140 的黏附性和抑制生物膜的形成。程慧娟等[14]發(fā)現(xiàn)50 μg/mL 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌PAO1 的生物被膜有抑制作用。

本研究篩選與Nisin 聯(lián)合的中藥成分（和厚樸分、穿心蓮內(nèi)酯、黃芩素），評(píng)估Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的協(xié)同抑制作用及效果。采用掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)測(cè)定其對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的組成成分及相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討和厚樸酚對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的抑制機(jī)制。旨在減少由銅綠假單胞菌生物被膜引起的食品安全問(wèn)題，同時(shí)為增強(qiáng)G-對(duì)Nisin 的敏感性和降低防腐劑使用劑量提供參考依據(jù)，為開發(fā)新型天然防腐劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株 銅綠假單胞菌9027 購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏庫(kù)（ATCC）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 1%結(jié)晶紫染液、乳酸鏈球菌素、XTT 鈉鹽、和厚樸酚、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯，塞納生物科技有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2.5%戊二醛，雷根生物科技有限責(zé)任公司；甲萘醌，梯希愛化成工業(yè)有限公司；RNA 提取試劑盒、（SYBR Green）熒光定量預(yù)混試劑，天根生物科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

SpectraMax i3 酶標(biāo)儀，美谷分子儀器上海有限公司；SU8010 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、E-1010離子濺射儀，日立高新技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 可抑制銅綠假單胞菌生物被膜的物質(zhì)篩選

采用結(jié)晶紫染色法，測(cè)定各中藥成分對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜形成的抑制效果；將菌懸液（2×107CFU/mL），取100 μL 至96 孔板中，孔中分別再加入100 μL Nisin、穿心蓮內(nèi)酯、黃芩素、和厚樸酚，使最終質(zhì)量濃度分別為1 000，200，40，10 μg/mL，加入PBS 作對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，棄上清液，200 μL PBS 輕柔清洗3 次；用甲醇固定10 min 后去除殘液，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，再用PBS 沖洗；加入0.1%乙酸和95%乙醇溶液各100 μL 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm 波長(zhǎng)下的吸光值；設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.3.2 Nisin、和厚樸酚單獨(dú)處理對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜最小抑制濃度的測(cè)定 釆用二倍稀釋法和XTT 還原法測(cè)定和厚樸酚和Nisin 的MBIC50；在96 孔板中，分別加入100 μL（2×107CFU/mL）菌懸液，再加入100 μL 最終質(zhì)量濃度分別為4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625 mg/mL Nisin，或加入100 μL 最終質(zhì)量濃度分別為400，200，100，50，25，12.5，6.25 μg/mL 和厚樸酚，對(duì)照組為等量菌液、PBS，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸去96 孔板中菌液，用PBS 清洗2 遍，在每個(gè)孔內(nèi)加入158 μL 20 g/L 葡萄糖的PBS 緩沖液，40 μL XTT 和2 μL 甲萘醌。鋁箔覆蓋37 ℃避光培養(yǎng)3 h，轉(zhuǎn)移至新96 孔板中，測(cè)定492 nm 下的吸光值。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取平均值。抑制率超過(guò)50%時(shí)所需的最小藥物濃度作為最低抑制生物被膜濃度（MBIC50）。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定生物被膜態(tài)菌液與對(duì)照組的吸光度，從而獲得生物被膜抑制率。

1.3.3 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的協(xié)同作用評(píng)估 通過(guò)棋盤法（微量稀釋法）檢測(cè)Nisin 與和厚樸酚的聯(lián)合用藥效果。96 板中每孔加入100 μL 菌懸液（2×107CFU/mL），在每孔中同時(shí)加入Nisin 與和厚樸酚各50 μL，其中Nisin 與和厚樸酚的濃度從1 倍MBIC50值到1/32倍MBIC50值依次減少。以和厚樸酚、Nisin 單獨(dú)作用組和PBS 為對(duì)照，重復(fù)3 次。用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（FICI）來(lái)判斷Nisin 與和厚樸酚的相互作用，計(jì)算公式如下：

1.3.4 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的抑制效果分析

1.3.4.1 對(duì)生物被膜形成的抑制效果分析 在96孔板中加入100 μL 2×107CFU/mL 的菌液和100 μL 不同濃度藥物，對(duì)照組為加入100 μL PBS，37℃分別培養(yǎng)3，6，9，12，18，24，36 h，參照1.3.2 節(jié)的方法，測(cè)定細(xì)菌生物被膜的抑制率。

1.3.4.2 對(duì)成熟生物被膜的清除效果分析 在96孔板中加入100 μL 2×107CFU/mL 的菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄上層浮游菌液，無(wú)菌PBS 清洗2次，加入100 μL LB 培養(yǎng)基和100 μL 藥物，加入200 μL LB 培養(yǎng)基作對(duì)照。然后37 ℃分別培養(yǎng)3，6，9，12，18，24，36 h，參照1.3.2 節(jié)的方法測(cè)定細(xì)菌生物被膜的清除率。

1.3.5 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響 將菌液稀釋至2×107CFU/mL，取1 mL 接種到12 孔板中，孔板中提前加入圓形蓋玻片，加入1 mL 不同藥物，以PBS 為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄上清，用PBS 清洗2 遍，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定8 h 以上。棄廢液，以去離子水清洗菌體，重復(fù)3 次后，依次用50%，70%，85%，95%的酒精脫水，每個(gè)梯度靜置13 min。用無(wú)水乙醇脫水14 min，脫水3 次，后冷凍干燥1 d，取出干燥完全的樣品、陰極噴涂將樣品金覆蓋，觀察銅綠假單胞菌ATCC 9027 形態(tài)與結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3.6 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜組成成分的影響

1.3.6.1 對(duì)EPS 合成的影響 采用苯酚-硫酸法測(cè)定銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜中可溶性多糖與不可溶性多糖含量。BF 的培養(yǎng)和處理方法參考1.3.4.1 和1.3.4.2 節(jié)的步驟，將BF 吸取至離心管中，4 ℃下8 000 r/min 離心30 min 后，取200 μL 上清液與200 μL 6%苯酚溶液、0.5 mL 濃硫酸混合，100 ℃水浴15 min，后測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處吸光值，為可溶性多糖含量。而離心后的沉淀重懸于0.9%的生理鹽水（含0.22%的甲醛）中，80 ℃水浴30 min，在4 ℃下12 000 r/min 離心30 min取上清測(cè)定不可溶性多糖含量，方法同上。

1.3.6.2 對(duì)eDNA 分泌量的影響 取1 mL 菌懸液加入到12 孔板中，再分別加入1 mL 不同組分藥物，37 ℃培養(yǎng)24 h；按Drisse 等[7]的方法提取eDNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，為抑制作用下的eDNA 含量。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

取1 mL 菌懸液加入到12 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄上層浮游菌液，并用PBS 清洗2 次，后加入1 mL TSB 培養(yǎng)基和1 mL 藥物，以PBS 作對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)18 h 后測(cè)定清除作用下的eDNA 含量，方法同上。

1.3.7 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 采用Primer 6軟件設(shè)計(jì)生物被膜相關(guān)基因lasR、pqsA、pelA、algC、lasI 上下游引物。

生物被膜的培養(yǎng)和處理方法同上，取菌懸液6 mL，參考RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，采用一步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后q-PCR 擴(kuò)增，以rpoD 為內(nèi)參基因。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

RT-qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Green1 2×SuperRealPreMix Plus 10 μL；DNase/RNase -Free Water 6.8 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL；cDNA 2 μL。RT-qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃15 min；98 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。

表1 熒光定量PCR 引物列表Table 1 List of primers for fluorescent quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳中藥成分的篩選

篩選對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜有最佳抑制效果的中藥成分。由圖1 可知，Nisin對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的抑制率為39%，有較好的抑制效果；而和厚樸酚、穿心蓮內(nèi)酯、黃芩素的抑制率分別為29.6%，15.1%，3%，其中和厚樸酚對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜抑制效果最好；因此，選取和厚樸酚作為與Nisin 聯(lián)合的中藥成分。

圖1 中藥成分單獨(dú)作用下銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的抑制率Fig.1 Inhibition rate of P.aeruginosa ATCC 9027 biofilm under the action of Chinese herbal ingredients alone

2.2 Nisin、和厚樸酚對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的MBIC50

由表2 可知，1 mg/mL Nisin 對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的抑制率為50.7%，隨著Nisin 濃度的減少，抑制率也逐漸降低，當(dāng)Nisin 質(zhì)量濃度大于1 mg/mL 時(shí)，抑制率的增幅并不明顯。和厚樸酚僅在12.5 μg/mL 便能達(dá)到52.0%抑制率，與Nisin 作用效果相似，其抑制率隨著和厚樸酚的含量增加而增加，然而超過(guò)12.5 μg/mL 后抑制率的增幅不大。因此，Nisin、和厚樸酚對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的MBIC50分別為1 mg/mL 和12.5 μg/mL。

表2 Nisin 與和厚樸酚單獨(dú)作用對(duì)菌株BF 的抑制率Table 2 Inhibition of the biofilm of the strain by Nisin with honokiol alone

2.3 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的協(xié)同作用評(píng)估

由圖2 可知，存在8 個(gè)組合能夠使銅綠假單胞菌ATCC 9027 的BF 抑制率在50%左右。FICI值結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)組合的FICI 值在0.250～0.500 之間，表明聯(lián)合處理對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜有協(xié)同抑制作用，其中當(dāng)0.125 mg/mL Nisin 與1.5625 μg/mL 和厚樸酚聯(lián)用時(shí)，協(xié)同抑制效果最佳，然而也存在無(wú)關(guān)和相加作用的組合。

圖2 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)合對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的抑制率Fig.2 Inhibition rate of biofilm of P.aeruginosa ATCC 9027 by Nisin in combination with honokiol

表3 不同濃度組合下的Nisin 與和厚樸酚聯(lián)合作用的FICI 值Table 3 FICI values of Nisin in combination with honokiol at different concentration combinations

2.4 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的抑制效果分析

2.4.1 生物被膜抑制率時(shí)間變化曲線 如圖3 所示，Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用、和厚樸酚單獨(dú)處理的抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，18 h 時(shí)達(dá)到頂峰，抑制率分別為77.1%，70.9%，然后開始緩慢下降。而Nisin 的抑制率在12 h 達(dá)到最大，為48.3%，并且此后抑制率大幅度下降，是因?yàn)锽F 在生長(zhǎng)初期對(duì)Nisin 的抵抗力較低，后期因?yàn)镹isin 對(duì)G-菌的作用效果差而無(wú)法抑制BF 的生長(zhǎng)。

圖3 4種處理下銅綠假單胞菌ATCC 9027 的生物被膜抑制率時(shí)間變化曲線Fig.3 Time variation curves of biofilm inhibition rate of P.aeruginosa ATCC 9027 under four treatments

2.4.2 生物被膜清除率時(shí)間變化曲線 由圖4 可知，和厚樸酚、藥物聯(lián)用對(duì)BF 的清除率隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升，在18 h 時(shí)達(dá)到最大，分別為25.1%和51.5%，藥物聯(lián)用表現(xiàn)出更好的清除效果。然而在18～24 h，清除率劇烈下降，這可能是因?yàn)樗幬锉幌膶?dǎo)致其清除效果變差；Nisin 單獨(dú)處理的清除效果差，而一直緩慢上升，也許是由于Nisin 難以穿透G-菌的BF，需要更長(zhǎng)的作用時(shí)間才能達(dá)到與聯(lián)用處理同等的清除效果。

圖4 4種處理下銅綠假單胞菌ATCC 9027 的生物被膜清除率時(shí)間變化曲線Fig.4 Time variation of biofilm clearance rate of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 under four treatments

2.5 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

SEM 掃描電鏡結(jié)果如圖5 所示，空白對(duì)照形成較為穩(wěn)定的生物被膜，菌體以多層堆疊形式聚集，外層有大量包裹物，呈現(xiàn)出明顯的立體三維結(jié)構(gòu)（圖5d）；Nisin 單獨(dú)處理只有極少黏附菌落，大部分菌落都互不黏附（圖5a）；和厚樸酚單獨(dú)處理下絕大部分菌體呈桿狀分布，表面有少量絲狀物質(zhì)出現(xiàn)（圖5b）。而在聯(lián)合作用下，生物被膜稀疏，大多數(shù)細(xì)菌都以單體、散體形式存在，只有極少數(shù)的細(xì)菌還在黏附載體上，菌體周邊較為清晰，幾乎無(wú)生物被膜（圖5c）。進(jìn)一步驗(yàn)證了Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜形成的協(xié)同抑制作用，同時(shí)藥物影響了胞外聚合物的形成，間接影響了生物被膜，因此有必要進(jìn)一步研究藥物對(duì)生物被膜態(tài)菌的作用機(jī)理。

圖5 Nisin 與和厚樸酚協(xié)同抑制銅綠假單胞菌ATCC 9027 的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.5 Scanning electron MBIC roscope images of Nisin in combination with honokiol to inhibit P.aeruginosa ATCC 9027

2.6 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜組成成分的影響

2.6.1 對(duì)EPS 含量的分析 EPS 是BF 至關(guān)重要的成分之一，由圖6 可知，Nisin、和厚樸酚、藥物聯(lián)用組對(duì)可溶性多糖抑制率分別為22.4%，10.2%，44.8%，對(duì)不可溶性多糖的抑制率分別為4.4%，4.3%，12.0%。結(jié)果表明，Nisin 與和厚樸酚單用和聯(lián)用均有效降低了銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜可溶性多糖含量，而對(duì)不溶性多糖的影響較少。此外，藥物聯(lián)用組比單用組表現(xiàn)出更好的抑制效果。

圖6 抑制作用下銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的可溶性多糖（a）與不可溶性多糖（b）含量Fig.6 Soluble polysaccharide（a）and insoluble polysaccharide（b）contents of the biofilm of P.aeruginosa ATCC 9027 under inhibition

在清除作用中也有類似的結(jié)果，由圖7 可知，Nisin、和厚樸酚、藥物聯(lián)用組對(duì)可溶性多糖的清除率分別為35.2%，21.9%，43.8%，對(duì)不可溶性多糖的清除率分別為3.5%，4.5%，10.2%。無(wú)論是抑制還是清除作用下，和厚樸酚對(duì)可溶性多糖的影響較低。

2.6.2 對(duì)eDNA 含量的分析 如圖8a 所示，不同處理均可抑制eDNA 的分泌。Nisin、和厚樸酚、藥物聯(lián)用組的抑制率分別為26.7%，81.8%，86.1%，其中和厚樸酚和藥物聯(lián)用組對(duì)eDNA 的抑制更高。如圖8b 所示，Nisin、和厚樸酚、藥物聯(lián)用對(duì)eDNA 的清除率分別為33%，40.5%，60.3%，藥物聯(lián)用對(duì)eDNA 合成的影響最大這與其有最佳抑制與清除效果的結(jié)果一致。相對(duì)于清除作用對(duì)eDNA的影響，和厚樸酚抑制作用效果更好。

圖8 藥物表現(xiàn)抑制作用（a）與清除作用（b）時(shí)eDNA 的含量Fig.8 The amount of eDNA when the drug exhibits inhibition（a）versus clearance（b）

2.7 Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖9 可知，在Nisin、和厚樸酚以及二者聯(lián)用 發(fā)揮抑 制和清 除BF 效果時(shí)，lasR、pelA、lasI、pqsA 與algC 基因都出現(xiàn)明顯下調(diào)，藥物聯(lián)合組比單藥組的效果更為明顯。在抑制BF 形成時(shí)，藥物處理對(duì)BF 合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響程度為：藥物聯(lián)用組〉Nisin〉和厚樸酚，這與其對(duì)BF 的抑制程度類似。其中，在和厚樸酚單獨(dú)處理中，控制Pel多糖形成的pelA 基因僅下調(diào)了38.1%，表明單獨(dú)使用和厚樸酚對(duì)EPS 的影響較少，這與EPS 的分泌量一致。當(dāng)清除BF 時(shí)，藥物處理對(duì)BF 合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響程度為：藥物聯(lián)用組〉和厚樸酚〉Nisin，同樣與清除效果的趨勢(shì)相同；Nisin 處理對(duì)pelA、lasI、pqsA 與algC 基因的抑制效果弱，這是因?yàn)镹isin 難以進(jìn)入成熟BF 而導(dǎo)致其清除效果差。然而，無(wú)論是在單獨(dú)處理還是在聯(lián)合使用中，lasR 基因都顯著下調(diào)，這表明兩種藥物都能顯著影響Psl 多糖的形成。在抑制BF 時(shí)，相對(duì)Nisin組，和厚樸酚處理下的影響eDNA 分泌的pqsA 下調(diào)程度低，然而和厚樸酚組中對(duì)eDNA 的抑制效果強(qiáng)于Nisin 組，與基因表達(dá)結(jié)果相反，這是因?yàn)橛卸鄠€(gè)基因調(diào)控eDNA 的分泌，可能和厚樸酚在其它位點(diǎn)強(qiáng)烈抑制eDNA 的合成。

圖9 不同處理后表現(xiàn)抑制作用（a）與清除作用（b）時(shí)對(duì)BF 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.9 Effect on transcript levels of biofilm-associated genes after different treatments showing repression（a）and clearance（b）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

生物被膜對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用并且可增強(qiáng)其耐藥性，而且在食品設(shè)備中難以清除，是重大的食品安全隱患。為減少銅綠假單胞菌生物被膜的危害，首先分析3 種中藥成分對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的抑制效果，發(fā)現(xiàn)和厚樸酚抑制作用最強(qiáng)；然后，通過(guò)棋盤法篩選出Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用的最佳組 合：1.5625 μg/mL 和厚樸酚與0.125 mg/mL Nisin；SEM 結(jié)果表明，不同處理組下BF 的形態(tài)有明顯區(qū)別，其中在藥物聯(lián)合下，大多數(shù)細(xì)菌為零散形式存在，零散的單個(gè)桿菌上幾乎沒(méi)有生物被膜。一方面可能是因?yàn)轲じ浇橘|(zhì)，如可溶性多糖與不可溶性多糖分泌量降低[15]，另一方面可能是由參與BF 基質(zhì)構(gòu)成和推動(dòng)BF 擴(kuò)張運(yùn)動(dòng)的eDNA 減少而造成[16]。

構(gòu)成BF 的主要成分為胞外多糖、多肽、胞外蛋白及胞外DNA 等。其中EPS 是BF 最重要的成分之一，它能影響銅綠假單胞菌之間的黏附性，是初始黏附時(shí)期BF 發(fā)展的支架，不僅作為影響B(tài)F形成的信號(hào)分子，還能作為抵抗免疫和抗生素攻擊的屏障[17]。eDNA 也是BF 的重要組成，在BF 的發(fā)展、作為連接介質(zhì)具有重要作用，且在維持和穩(wěn)定成熟BF 的結(jié)構(gòu)中也具有重要作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用能有效對(duì)EPS 和eDNA產(chǎn)生抑制和清除，從而影響B(tài)F 的存在。

為探討Nisin 與和厚樸酚聯(lián)用抑制銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的可能機(jī)制，利用RTqPCR 分析BF 相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)。EPS 一般為3 種多糖構(gòu)成：Pel、Psl 及藻酸鹽，其中Psl 多糖對(duì)BF 的建立、抵抗抗生素具有重要作用，在成熟階段還能促進(jìn)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)，研究發(fā)現(xiàn)lasR 能與psl 操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，能間接控制Psl 多糖的合成[19]。Pel 多糖可對(duì)形成牢固的BF 發(fā)揮重要作用，可作為黏附因子幫助其在介質(zhì)表面黏附，研究表明pelA 與Pel 多糖的形成有關(guān)[20]。藻酸鹽對(duì)于BF 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和防護(hù)作用至關(guān)重要，能夠維持BF 所必需的水分和營(yíng)養(yǎng)，還被證明能減少免疫細(xì)胞及抗生素對(duì)BF 的攻擊，研究表明algC 參與藻酸鹽前體合成，能夠間接影響藻酸鹽的形成[21]。本研究表明，在藥物對(duì)BF 表現(xiàn)抑制與清除作用時(shí)，lasR、pelA 與algC 的基因表達(dá)量下調(diào)，藥物聯(lián)用組尤其顯著，表明當(dāng)藥物對(duì)BF 產(chǎn)生抑制或清除作用時(shí)，可能是通過(guò)減少Psl 多糖、Pel 多糖及藻酸鹽的含量，從而影響B(tài)F。銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由lasI/lasR 系統(tǒng)、rhlI/rhlR 系統(tǒng)以及基于喹諾酮信號(hào)（Pseudomonas aeruginosa quinolone signal，PQS）的群體感應(yīng)系統(tǒng)組成[22]。PQS 系統(tǒng)對(duì)BF 形成時(shí)細(xì)菌聚集、BF 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等具有重要作用，它還可以促進(jìn)eDNA 的釋放[23]。有研究表明pqsABCDE 操縱子能夠編碼2-庚基-4-喹諾酮（2-Heptyl4-quinolone，HHQ），而HHQ 是PQS 系統(tǒng)的信號(hào)分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮的前體物質(zhì)，因此pqsA 能夠間接調(diào)控PQS 系統(tǒng)，從而影響B(tài)F 的形成[24]。LasR 系統(tǒng)能夠調(diào)控胞外酶、外毒素A 及BF 的形成，研究發(fā)現(xiàn)lasI 能夠編碼信號(hào)分子——N-（3-氧代十二烷?；?L-高絲氨酸內(nèi)[25]，它是銅綠假單胞菌生物被膜形成所必需的，它能與LasR 相結(jié)合，從而影響B(tài)F 的生成和分散[26]。本研究表明，當(dāng)藥物對(duì)BF 表現(xiàn)抑制與清除作用時(shí)，藥物聯(lián)用組中pqsA 與lasI 的基因表達(dá)量下調(diào)更為顯著，因此推測(cè)藥物是通過(guò)下調(diào)pqsA 與lasI 的表達(dá)量，間接調(diào)控PQS 系統(tǒng)及LasR 系統(tǒng)，從而影響eDNA 及BF 的形成。因此，Nisin 與和厚樸酚協(xié)同抑制銅綠假單胞菌ATCC 9027 BF 和清除BF 的作用機(jī)制與lasR、pelA、algC、pqsA、lasI 相關(guān)。

3.2 結(jié)論

綜上所述，Nisin 與和厚樸酚聯(lián)合使用的多個(gè)組合均對(duì)銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜具有協(xié)同抑制作用，其中1.5625 μg/mL 和厚樸酚與0.125 mg/mL Nisin 組合的抑制效果最好。對(duì)生物被膜的抑制率和清除率先增加，在18 h 時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸降低。其主要作用機(jī)制是通過(guò)降低lasR、pelA、lasI、pqsA 與algC 基因的表達(dá)，減少EPS 的生成及eDNA 的分泌，從而抑制銅綠假單胞菌ATCC 9027 生物被膜的形成和清除成熟生物被膜。然而Nisin 與和厚樸酚是通過(guò)何種方式影響相關(guān)基因的表達(dá)尚不清楚，需進(jìn)一步研究。生物被膜的形成是復(fù)雜且由多種機(jī)制調(diào)控的過(guò)程，本課題組下一步將尋找Nisin 與和厚樸酚抑制和清除生物被膜的其它潛在作用機(jī)制。