分離乳酸菌對金黃色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌作用

吉 果 麥迪乃姆·米爾阿迪力 古哈爾尼薩·吾布力 董鵬林 努爾買買提·阿卜杜瓦伊提 陳 偉

(塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,塔里木畜牧科技兵團重點實驗室,阿拉爾 843300)

金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的病原菌,它所引起的奶牛乳房炎占所有細(xì)菌性乳房炎的30%～50%。據(jù)統(tǒng)計,美國每年由于奶牛乳房炎造成15億～30億美元的牛奶損失,占其牛奶總量的11%[1]。細(xì)菌、真菌和支原體等都能引起奶牛乳房炎,常見的奶牛乳房炎致病菌主要有葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌等[2]?？股卦陲暳咸砑觿┲械牟缓侠硎褂靡约芭R床治療奶牛乳房炎導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增加,“飼料禁抗”已成為國際畜牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

目前,乳酸菌至少可分為18個屬200多個種,主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)等[3]。乳酸菌可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì),如乳酸、短鏈脂肪酸、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)和細(xì)菌素等,這些物質(zhì)幫助其競爭性抑制致病菌的黏附和定植,發(fā)揮益生功能[4]。乳酸菌具有益生特性,主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道菌群[5]、緩減腸道疾病[6]、增強機體免疫力[7]和抗氧化[8]等方面。Espeche等[9]對從健康奶牛乳腺中分離的數(shù)百株乳酸菌的益生特性進行了評價,表明乳酸菌能夠有效抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等病原菌的生長,為防治奶牛乳房炎提供了豐富的選擇。目前關(guān)于羊瘤胃內(nèi)容物和牛糞中是否存在能有效抑制奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌的乳酸菌的研究較少。因此,本試驗從羊瘤胃內(nèi)容物和牛糞中分離出乳酸菌菌株,并驗證其中是否存在能有效抑制奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌的菌株,同時探究相關(guān)菌株發(fā)揮作用的主要成分和最適pH環(huán)境,以期為奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

從新疆阿克蘇市新和縣某肉牛場(飼養(yǎng)少量羊只)采集5頭健康肉牛的新鮮糞便(每頭肉牛各取1份糞便樣品),對屠宰的1只健康羊無菌采集其瘤胃內(nèi)容物7份,同時采集2份青貯飼料樣品。將采集的樣品裝于50 mL滅菌離心管中,冷藏后送回實驗室進行菌株分離,并按照如下方法對分離的菌株進行命名:N代表自羊瘤胃內(nèi)容物中分離;F代表自牛糞中分離;S代表自青貯飼料中分離。第1個阿拉伯?dāng)?shù)字代表樣品編號;第2個阿拉伯?dāng)?shù)字代表所使用的菌株為純化的菌株類型;圓圈內(nèi)阿拉伯?dāng)?shù)字代表該菌株類型的第幾株克隆。金黃色葡萄球菌ATCC29213株由塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳偉教授實驗室吳自豪提供,屎腸球菌(Enterococcusfaecium)5號株由塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院郭雪峰教授惠贈,戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)12號株由塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院任曉鏷副教授提供。

1.1.2 主要試驗用品

MRS肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)培養(yǎng)基、瓊脂粉(agar powder)、過氧化氫酶(CAT,400 000 U/g)購自北京索萊寶有限責(zé)任公司,胰蛋白大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,乳酸鏈球菌素(Nisin,900 IU/mg)購自北京酷來搏科技有限公司,MRA瓊脂培養(yǎng)基是在MRS肉湯培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂粉經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后制成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

實時微生物生長分析系統(tǒng)(型號MicroScreen-HT),由森靈儀器制造(天津)有限公司生產(chǎn);凍干機(型號FDU-1200),由日本東京理化有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離與純化

參考王利紅[10]的試驗方法,對從牛場采集的牛糞和羊瘤胃內(nèi)容物以及青貯飼料樣品進行乳酸菌菌株分離。首先對牛糞樣品采用TSB培養(yǎng)基進行富集,然后在TSA平板上進行劃線分離,在37 ℃進行培養(yǎng),直至長出單克隆,反復(fù)純化3次,得到18株細(xì)菌(F3-1①、F3-1②、F3-2①、F3-2②、F3-3①、F3-3②、F3-5①、F3-5②、F4-1①、F4-1②、F4-2①、F4-2②、F4-3①、F4-3②、F4-5①、F4-5②、F4-2③、F4-2④)。將羊瘤胃內(nèi)容物樣品用MRS肉湯培養(yǎng)基富集后,首先在MRS瓊脂培養(yǎng)基的平板上劃線分離,在含5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至長出單克隆后用接種環(huán)無菌挑取白色黏液樣單克隆接種到3 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,繼續(xù)在含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以上;如此重復(fù)3次,直至劃線出形態(tài)相似,均一大小,邊緣整齊不透明,具有白色黏液樣的單克隆,做革蘭氏鏡檢,得到9株疑似乳酸菌(N1-1①、N1-1②、N2-1①、N3-1①、N4-1①、N4-1②、N5-1①、N5-1②、N7-1①)。按照羊瘤胃內(nèi)容物菌株分離方法處理青貯飼料樣品,分離得到2株細(xì)菌(S1-1①、S2-1①)。對上述29株分離細(xì)菌分別擴增16S rDNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.2 16S rDNA測序鑒定

PCR擴增體系:5.0 μL 10×PCR Buffer,1 μL正向引物27F,1 μL反向引物1492R,2 μL模板基因組DNA,0.5 μL 5 U/μL Pfu DNA聚合酶,加ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,72 ℃延伸10 min,擴增34個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定

參照崔棹茗等[11]的試驗方法進行乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定。對分離純化并經(jīng)16S rDNA測序的疑似乳酸菌的4株分離菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①活化后按照995 μL MRS肉湯培養(yǎng)液加5 μL菌液的接種量接種,37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,每個樣品制備3管,以空白培養(yǎng)基為對照,通過實時微生物生長分析系統(tǒng)連續(xù)測定600 nm波長下的吸光度(OD600 nm)值,同時測定菌液在培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、24、36 h時的pH,以菌液培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD600 nm值和pH為縱坐標(biāo)分別繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線。同時對上述菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗。

1.2.4 Nisin效價標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照文獻[12]的方法,準(zhǔn)確稱取1.00 g的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品,溶于1 mL滅菌蒸餾水中,配成1 000 mg/mL的母液。再用滅菌蒸餾水稀釋成500、250、100、50、25 mg/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液。采取牛津杯雙層瓊脂平板法測定稀釋后的各濃度Nisin標(biāo)準(zhǔn)液對金黃色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌圈直徑,以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo),以Nisin濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 乳酸菌抑菌試驗及抑菌物質(zhì)效價測定

參照文獻[13]的方法制備1.5%的瓊脂平板,等間距放入4個經(jīng)過高溫滅菌后的牛津杯。將金黃色葡萄球菌ATCC29213株接種在TSB培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。制備200 mL含0.7%瓊脂的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基(0.7% TSA培養(yǎng)基),冷至50 ℃左右,將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC29213株調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷?1.5×108CFU/mL),按1%的接種量接種2 mL稀釋后的金黃色葡萄球ATCC29213株菌液,混勻。在放置牛津杯的素瓊脂平板上倒入15 mL含有金黃色葡萄球菌ATCC29213株的0.7% TSA培養(yǎng)基,晾干后用無菌鑷子取出牛津杯,在孔中加入100 μL分離的乳酸菌無菌發(fā)酵上清液(按照1.2.6中原液組的方法制備),在超凈工作臺中鼓風(fēng)擴散3 h后,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h觀察,并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑,計算抑菌物質(zhì)效價。

1.2.6 不同處理下的抑菌試驗

原液組:將分離純化后的N3-1①以1%接種量接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,在含5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600 nm值≥1.9),4 ℃下12 000×g離心15 min,收集上清液(即無菌發(fā)酵上清液[13]),對上清液采用0.22 μm濾膜無菌過濾,在-50 ℃條件冷凍干燥過夜。凍干后的固體用1 mL滅菌蒸餾水吹懸(濃縮至1/10體積),放置于-20 ℃冰箱中備用。采用1.2.5中所述牛津杯法進行抑菌試驗。

氫氧化鈉(NaOH)處理組:將分離純化后的N3-1①以1%接種量接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,在含5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600 nm值≥1.9),4 ℃下12 000×g離心15 min,收集上清液,用6 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.5,以中和上清液中有機酸的干擾。后續(xù)步驟同上述原液組。

NaOH+CAT處理組:用pH為6.5的0.02 mol/L的醋酸鉀將CAT配成50 mg/mL的母液,在NaOH處理組所得無菌發(fā)酵上清液的基礎(chǔ)上,將母液加入到上清液中進行10倍稀釋,使上清液中CAT的終濃度為5.0 mg/mL,37 ℃水浴2 h。后續(xù)步驟同上述原液組。

1.2.7 不同pH乳酸抑菌試驗

將具有一定抑菌活性的分離乳酸菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①、屎腸球菌5號株按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃培養(yǎng)24 h后,不經(jīng)過1/10體積濃縮,測定無菌發(fā)酵上清液的pH。用NaOH溶液將1/2的無菌發(fā)酵上清液調(diào)整至pH為6.5,另1/2不作處理。經(jīng)牛津杯法檢測上述2份無菌發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌作用。將乳酸溶液用無菌蒸餾水調(diào)整到pH分別為1.4、2.1、3.0、3.8,參照步驟1.2.5制備含有金黃色葡萄球菌ATCC29213株的0.7%TSA培養(yǎng)基平板,在對應(yīng)的牛津杯孔中分別加入上述不同pH的乳酸溶液100 μL,37 ℃培養(yǎng)16 h,測量抑菌圈直徑,并計算抑菌物質(zhì)效價。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019整理數(shù)據(jù)并繪制圖片。采用CurveExpert 1.4 漢化版軟件進行線性方程的擬合。

2 結(jié) 果

2.1 疑似乳酸菌16S rDNA測序鑒定

將從牛糞中分離的18株、從羊瘤胃內(nèi)容物中分離的9株和從青貯飼料中分離的2株共29株細(xì)菌的16S rDNA進行擴增,擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。將這29株分離菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對,選取序列同源性最高的菌株作為測序菌株的疑似菌株,其中有11株疑似乳酸菌(表1)。

1:F3-1①;2:F3-1②;3:F3-2①;4:F3-2②;5:F3-3①;6:F3-3②;7:F3-5①;8:F3-5②;9:F4-1①;10:F4-1②;11:F4-2①;12:F4-2②;13:F4-3①;14:F4-3②;15:F4-5①;16:F4-5②;17:F4-2③;18:F4-2④;19:N1-1①;20:N1-1②;21:N2-1①;22:N3-1①;23:N4-1①;24:N4-1②;25:N5-1①;26:N5-1②;27:N7-1①;28:S1-1①;29:S2-1①;M:DL2000 Marker。圖1 29株分離菌的16S rDNA擴增電泳圖Fig.1 16S rDNA amplification electrophoretogram of 29 isolated strains

2.2 疑似乳酸菌的生長特性與產(chǎn)酸能力

如圖2所示,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①均呈現(xiàn)白色黏液樣菌落,符合乳酸菌菌落的典型形態(tài)。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn),除N3-1①、N5-1①由于伊紅復(fù)染充分,顏色偏紅以外,N4-1①、N7-1①均呈藍(lán)色,顯微鏡下形態(tài)均呈短桿狀或棒狀球菌,直徑0.5～2.0 μm,以單個或成對分布為主,部分成短鏈狀或成團狀分布。上述菌株革蘭氏染色均呈陽性,同時過氧化氫酶接觸顯示陰性,可初步確定為乳酸菌。

圖2 4株疑似乳酸菌的菌落及革蘭氏染色Fig.2 Bacterial colonies and Gram staining of 4 strains of suspected lactic acid bacteria

由生長曲線(圖3)可知,N3-1①達到平臺期為16.15 h;N4-1①達到平臺期為16.53 h,在4株菌中最晚到達平臺期;N5-1①達到平臺期為15.77 h,在4株菌中最早到達平臺期;N7-1①達到平臺期為16.15 h,與N3-1①相同,表明這2株菌的生長特性比較接近。

A:N3-1① 28 h內(nèi)OD600 nm值變化;B:N4-1① 28 h內(nèi)OD600 nm值變化;C:N5-1① 28 h內(nèi)OD600 nm值變化;D:N7-1① 28 h內(nèi)OD600 nm值變化。A: change of OD600 nm value of N3-1① within 28 h; B: change of OD600 nm value of N4-1① within 28 h; C: change of OD600 nm value of N5-1① within 28 h; D: change of OD600 nm value of N7-1① within 28 h.圖3 4株疑似乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of 4 strains of suspected lactic acid bacteria

產(chǎn)酸曲線(圖4)表明,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中,0 h時pH均為6.2,培養(yǎng)24 h后,pH均在3.5左右,此時各菌株產(chǎn)酸能力已到達平臺期;繼續(xù)培養(yǎng)至36 h,pH沒有發(fā)生變化,表明乳酸菌生長達到穩(wěn)定期后,其產(chǎn)酸能力不再隨時間的延長而增加。

A:N3-1① 36 h內(nèi)pH變化;B:N4-1① 36 h內(nèi)pH變化;C:N5-1① 36 h內(nèi)pH變化;D:N7-1① 36 h內(nèi)pH變化。A: pH change of N3-1① within 36 h; B: pH change of N4-1① within 36 h; C: pH change of N5-1① within 36 h; D: pH change of N7-1① within 36 h.圖4 4株疑似乳酸菌的產(chǎn)酸曲線Fig.4 Acid production curve of 4 strains of suspected lactic acid bacteria

2.3 抑菌物質(zhì)效價計算公式

Nisin濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,線性擬合方程為:Y=1.179 3+5.177 1X(R2=0.928)。根據(jù)此方程可計算抑菌試驗中乳酸菌無菌發(fā)酵上清液所對應(yīng)的細(xì)菌素當(dāng)量對數(shù)值[lg(mg/mL)]。由于乳酸菌無菌發(fā)酵上清液經(jīng)過10倍濃縮,且商品化Nisin效價單位為900 IU/mg,最終計算公式為:

乳酸菌無菌發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)效價(IU/mL)=10X/10×Nisin效價單位(900 IU/mg)。

2.4 分離乳酸菌的抑菌活性及抑菌物質(zhì)效價

對分離的乳酸菌F3-1①、N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①以及屎腸球菌5號株、戊糖乳桿菌12號株,通過牛津杯法對金黃色葡萄球菌ATCC29213株進行抑菌試驗。由圖6可知,在相同條件下,N3-1①產(chǎn)生的抑圈菌直徑最大,達到了22.68 mm,具有最強的抑菌活性;F3-1①、屎腸球菌5號株、戊糖乳桿菌12號株、N4-1①、N5-1①、N7-1①具有一定的抑菌活性。根據(jù)抑菌物質(zhì)效價公式,計算出各菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)效價,見表2。結(jié)果表明,糞腸球菌N3-1①具有最高的抑菌物質(zhì)效價,數(shù)值為1.28×106IU/mL;其次為戊糖乳桿菌12號株,抑菌物質(zhì)效價達到了1.21×105IU/mL;再次為屎腸球菌5號株,抑菌物質(zhì)效價達到了3.58×104IU/mL。

F3-1①:糞腸球菌;N3-1①:糞腸球菌;N4-1①:屎腸球菌;N5-1①:屎腸球菌;N7-1①:未知菌株;5:屎腸球菌5號株;12:戊糖乳桿菌12號株;MSR:MSR肉湯培養(yǎng)基;ddH2O:雙蒸水。下圖同。F3-1①: Enterococcus faecalis; N3-1①: Enterococcus faecalis; N4-1①: Enterococcus faecium; N5-1①: Enterococcus faecium; N7-1①: unknown strain; 5: Enterococcus faecalis No.5; 12: Lactobacillus pentosus No.12; MSR: MRS broth medium; ddH2O: double distilled water. The same as below.圖6 不同乳酸菌抑菌作用觀察Fig.6 Observation of antibacterial effects of different lactic acid bacteria

2.5 不同處理下抑菌試驗結(jié)果

牛津杯試驗表明,在分離的乳酸菌中N3-1①對金黃色葡萄球菌ATCC29213株具有最強的抑菌活性。在此基礎(chǔ)上,通過制備不同處理下的N3-1①無菌發(fā)酵上清液,開展進一步抑菌試驗,探究乳酸菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的種類。由圖7和表3可知,N3-1①的無菌發(fā)酵上清液經(jīng)冷凍干燥、1/10體積濃縮后表現(xiàn)出較強的抑菌活性,抑菌圈直徑達23.36 mm;經(jīng)NaOH調(diào)pH至6.5左右,抑菌圈消失,表明發(fā)揮抑菌作用的活性物質(zhì)可能為有機酸類等酸性物質(zhì);本試驗未觀察到H2O2在NaOH對無菌發(fā)酵上清液的處理中發(fā)揮進一步的作用。

表3 N3-1①在不同處理下的抑菌效果比較Table 3 Comparison of antibacterial effects of N3-1① under different treatments

圖7 N3-1①在不同處理下的抑菌作用觀察Fig.7 Observation of antibacterial effects of N3-1① under different treatments

2.6 不同pH乳酸抑菌試驗結(jié)果

抑菌試驗結(jié)果顯示,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①、戊糖乳桿菌5號株按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃培養(yǎng)24 h后,無論是否經(jīng)過NaOH處理,上述乳酸菌無菌發(fā)酵上清液(未經(jīng)過1/10體積濃縮)經(jīng)牛津杯檢測未能觀察到抑菌現(xiàn)象(圖8)。由表4可知,除N3-1①無菌發(fā)酵上清液pH為4.1外,其余4株乳酸菌無菌發(fā)酵上清液pH均為3.8,該結(jié)果表明乳酸菌無菌發(fā)酵上清液pH高于3.8時,不能有效抑制指示菌金黃色葡萄球菌ATCC29213株的生長。將乳酸溶液采用滅菌蒸餾水稀釋至4個不同的pH,分別為1.4、2.1、3.0、3.8,采用牛津杯法進行抑菌試驗,結(jié)果(表5)顯示,當(dāng)pH為1.4時,乳酸溶液對金黃色葡萄球菌ATCC29213株表現(xiàn)出強抑制作用;當(dāng)pH為2.1時,乳酸溶液對指示菌表現(xiàn)出一定的抑制作用;當(dāng)pH為3.0和3.8時,沒有觀察到乳酸溶液對指示菌的抑制作用。

表4 5株乳酸菌在NaOH處理下的抑菌作用Table 4 Antibacterial effect of 5 strains of lactic acid bacteria under NaOH treatment

表5 不同pH乳酸抑菌試驗結(jié)果Table 5 Results of different pH lactic acid antibacterial test

F:未經(jīng)NaOH處理;C:經(jīng)NaOH處理。F: not treated with NaOH; C: treated with NaOH.圖8 NaOH處理及乳酸抑菌試驗結(jié)果Fig.8 Results of NaOH treatment and lactic acid antibacterial test

3 討 論

本試驗從牛糞、羊瘤胃內(nèi)容物及青貯飼料中總計分離出了29株細(xì)菌,其中來自牛糞的疑似大腸桿菌18株,來自羊瘤胃內(nèi)容物的疑似乳酸菌9株,來自青貯飼料的疑似乳酸菌2株。我們通過NCBI序列比對鑒定出細(xì)菌的種屬,挑選生長性能較好的4株疑似乳酸菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①分離純化后對菌株進行革蘭氏鏡檢,顯示均為革蘭氏陽性菌株,過氧化氫酶接觸試驗均為陰性。

牛津杯雙層平板法試驗結(jié)果表明,從羊瘤胃內(nèi)容物中分離的糞腸球菌N3-1①具有最強的抑菌活性,其他試驗菌株培養(yǎng)24 h后的無菌發(fā)酵上清液所形成的抑菌圈直徑較小,具有一定的抑菌活性。何江波等[14]從羊瘤胃內(nèi)容物中分離出22株乳酸菌(包括戊糖乳桿菌、糞腸球菌、蒙氏腸球菌、海氏腸球菌等),在排除酸效應(yīng)后,所有菌株發(fā)酵上清液均未檢測到抑菌活性。本試驗所得結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

Korhonen等[15]證明,乳酸菌中發(fā)揮主要抑菌作用的是乳酸和醋酸,與本研究的結(jié)果有相似之處。研究顯示,乳酸菌產(chǎn)酸能力強,能快速產(chǎn)生大量乳酸等有機酸,形成低pH環(huán)境,抑制有害菌的生長[16-17]。陳宏偉等[12]研究表明,乳酸菌通過細(xì)菌素發(fā)揮主要抑菌作用,在乳酸形成的有機酸性環(huán)境中,細(xì)菌素發(fā)揮的效果更好。有研究表明,乳酸菌可通過細(xì)菌素、H2O2等發(fā)揮抑菌效果[18]。

有機酸可以通過酸(未電離形式)的擴散穿過細(xì)胞膜,解離和酸化細(xì)胞質(zhì)[19-20]。此外,解離的有機酸也會使細(xì)菌的酶、蛋白質(zhì)和DNA變性,從而抑制細(xì)菌生長[21]。李雪莉等[22]研究表明,乳酸菌主要通過有機酸來發(fā)揮抑菌作用。葉青[23]對云南建水酸漿豆腐中是乳酸菌進行了分離與鑒定,研究發(fā)現(xiàn)酸漿中主要微生物自然發(fā)酵后的有機酸產(chǎn)物主要為L-乳酸。我們后續(xù)將對上述有抑菌活性的乳酸菌作進一步研究,以明確其主要抑菌物質(zhì)。

4 結(jié) 論

本試驗從羊瘤胃內(nèi)容物中分離出了1株對金黃色葡萄球菌ATCC29213株有良好抑菌活性的乳酸菌——糞腸球菌N3-1①,其發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)為有機酸類。通過不同pH乳酸抑菌試驗得出乳酸對金黃色葡萄球菌ATCC29213株發(fā)揮抑菌作用的最適pH為1.4～2.1。