白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞炎性損傷和屏障功能障礙的緩解作用

張磊正 馮志華* 龔建剛 郝艷霜 劉觀忠 劉彥慈 馬可為

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,保定 071000;3.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院,保定 071000)

腸道上皮屏障由位于腸道內(nèi)壁的單層腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間連接(緊密連接、黏附連接和橋粒等)組成[1]。腸道上皮屏障破壞會(huì)增加腸道通透性,導(dǎo)致外界不利因素對(duì)內(nèi)環(huán)境的侵襲,這是動(dòng)物發(fā)生消化系統(tǒng)疾病與神經(jīng)退行性疾病的重要原因[2-3]。因此,維持腸道上皮屏障的完整性是預(yù)防腸道相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的組成成分,被證明可破壞緊密連接蛋白、降低細(xì)胞跨膜電阻,是誘發(fā)腸道急性炎癥的主要因素之一[5]。

近年來(lái),在替抗的大背景下,植物來(lái)源多酚因具有類似抗生素的效果且不會(huì)引起抗藥而被認(rèn)為是抗生素的有效替代品[6-7]。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種從虎杖、葡萄和花生等植物中提取的多酚類植物抗毒素[8]。研究已證實(shí),白藜蘆醇在抗病原微生物、抗炎癥、抗氧化和抗癌等方面具有重要作用[9]。另有研究表明,白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白-1(silencing regulatory protein-1,SIRT-1)信號(hào)通路減輕體外產(chǎn)腸毒大腸桿菌引起的豬腸上皮細(xì)胞炎癥損傷[10]。白藜蘆醇預(yù)處理人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞可抑制右旋糖酐硫酸鈉引起的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的產(chǎn)生和炎癥信號(hào)分子的磷酸化[11],盡管白藜蘆醇被證明有緩解動(dòng)物腸道炎癥的潛能[12-13],但關(guān)于白藜蘆醇最適劑量的篩選及其在緩解腸道屏障損傷方面的作用鮮有報(bào)道。因此,本研究通過(guò)使用白藜蘆醇干預(yù)LPS誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)炎癥模型,探討白藜蘆醇在抗炎及改善腸道屏障方面的作用,為白藜蘆醇在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

IPEC-J2細(xì)胞購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司;白藜蘆醇(純度>99%)、MTT試劑盒和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;LPS與二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青-鏈霉素雙抗與0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Biological Industries;TNF-α、IL-8、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser與TB Green Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 溶液配制

白藜蘆醇存儲(chǔ)液與工作液配制:將228.2 mg白藜蘆醇溶于10 mL DMSO中,配制成0.1 mol/L的白藜蘆醇存儲(chǔ)液。將白藜蘆醇存儲(chǔ)液以完全培養(yǎng)基(含10% FBS、2%青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基)稀釋為不同濃度(0、5.0、20.0、35.0和50.0 μmol/L)工作液供后續(xù)使用。白藜蘆醇存儲(chǔ)液過(guò)濾除菌后分裝,-20 ℃保存,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

LPS存儲(chǔ)液與工作液配制:將10 mg LPS溶于10 mL完全培養(yǎng)基中,配制成1 mg/mL的LPS存儲(chǔ)液。將LPS存儲(chǔ)液以完全培養(yǎng)基稀釋為不同濃度(0、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L)工作液供后續(xù)使用。LPS存儲(chǔ)液過(guò)濾除菌后分裝,-20 ℃保存,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-J2細(xì)胞復(fù)蘇后,接種于含完全細(xì)胞培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中,并放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞傳代3次脫毒后,生長(zhǎng)匯合至85%以上時(shí)進(jìn)行分組使用。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-J2細(xì)胞,0.25%胰酶消化重懸后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中,每孔加200 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至85%左右,以非完全培養(yǎng)基(含2%青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基)饑餓培養(yǎng)6 h后,加入不同濃度(0、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L)LPS和白藜蘆醇(0、5.0、20.0、35.0和50.0 μmol/L)處理細(xì)胞18 h(處理時(shí)間由預(yù)試驗(yàn)確定),每組6個(gè)復(fù)孔。后向每孔中添加10 μL噻唑藍(lán)溶液(5 g/L)和90 μL完全培養(yǎng)基,孵育4 h除去上清液,每孔中加入110 μL甲瓚溶解液振蕩10 min,充分混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值,確定不同濃度下藥品對(duì)細(xì)胞的毒性。

根據(jù)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果與前人研究結(jié)果[14],選擇最佳LPS濃度(10.0 mg/L)作為造模濃度,無(wú)細(xì)胞毒性的白藜蘆醇濃度(5.0、20.0、35.0 μmol/L)作為預(yù)處理濃度,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同樣以MTT法檢測(cè)白藜蘆醇預(yù)處理后LPS誘導(dǎo)下的IPEC-J2細(xì)胞活性,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(不添加LPS與白藜蘆醇)與LPS單獨(dú)刺激組(單獨(dú)添加10.0 mg/L LPS)。之后試驗(yàn)均采用上述分組進(jìn)行。

細(xì)胞活性(%)=100×(試驗(yàn)孔490 nm處
吸光度值-試驗(yàn)孔570 nm處吸光度值)/
(對(duì)照孔490 nm處吸光度值-對(duì)照孔
570 nm處吸光度值)。

1.3.3 細(xì)胞遷移率檢測(cè)

IPEC-J2細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,待生長(zhǎng)匯合至85%左右,棄去舊培養(yǎng)液,非完全培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6 h后,以不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞18 h,LPS進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。以200 μL無(wú)菌槍頭在皿底作等寬的直線劃痕,并用無(wú)菌PBS輕柔清洗3次。非完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照并采集圖片,采用Image J V1.8.0軟件分析劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

細(xì)胞遷移率(%)=[(0 h劃痕面積-24 h
劃痕面積)/0 h劃痕面積]×100。

1.3.4 炎癥因子分泌量檢測(cè)

IPEC-J2細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,至細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至85%左右,棄去舊培養(yǎng)液,非完全培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6 h后,以不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞18 h,LPS進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后,小心吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,2 500 r/min離心5 min后仔細(xì)收集上清液。參照IL-8、IL-10和TNF-α的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-8、IL-10和TNF-α含量。

1.3.5 Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路及緊密連接相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

上述1.3.4中細(xì)胞上清液收取后,參照RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)裂解細(xì)胞提取總RNA,采用TB Green反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀對(duì)各組cDNA進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性300 s,之后95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s和72 ℃ 20 s,35個(gè)循環(huán)。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因,引物使用Primer 5.0和NCBI進(jìn)行設(shè)計(jì),NCBI-BLAST驗(yàn)證引物特異性后由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,使用2-ΔΔCt方法分析每個(gè)目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。詳細(xì)引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)以Excel 2019歸納整理后,采用SPSS 22.0軟件對(duì)對(duì)照組與LPS單獨(dú)刺激組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),判斷LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的影響;采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)組間差異,并采用LSD法進(jìn)行多重比較。各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇和LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的量效關(guān)系

由圖1-A可見(jiàn),與對(duì)照組(0 μmol/L白藜蘆醇)相比,5.0、20.0和35.0μmol/L白藜蘆醇對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性無(wú)顯著影響(P>0.05),50.0 μmol/L白藜蘆醇可顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞活性(P<0.05),表明50.0 μmol/L白藜蘆醇對(duì)IPEC-J2細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性,因此選擇5.0、20.0和35.0 μmol/L作為后續(xù)試驗(yàn)濃度。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 不同濃度的白藜蘆醇和LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of RES and LPS on viability of IPEC-J2 cells

由圖1-B可見(jiàn),與對(duì)照組(0 mg/L LPS)相比,0.5和1.0 mg/L LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性無(wú)顯著影響(P>0.05),5.0和10.0 mg/L LPS可顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞活性(P<0.05),表明5.0和10.0 mg/L LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性,但綜合考慮對(duì)細(xì)胞炎性損傷和屏障功能的影響,選擇10.0 mg/L LPS為后續(xù)造模濃度。

2.2 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞活性的影響

由圖2可見(jiàn),與對(duì)照組相比,LPS刺激顯著降低了IPEC-J2細(xì)胞活性(P<0.05)。20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞后顯著提高了由LPS刺激引起的IPEC-J2細(xì)胞活性的降低(P<0.05),但5.0、35.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)LPS刺激下IPEC-J2細(xì)胞活性的影響不顯著(P>0.05)。

“*”表示2組間差異顯著(P<0.05)。下圖同?！?” indicate significant difference between two groups (P<0.05). The same as below.圖2 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of RES on activity of LPS-induced IPEC-J2 cells

2.3 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞遷移率的影響

由圖3可見(jiàn),與對(duì)照組相比,LPS刺激未對(duì)IPEC-J2細(xì)胞遷移率產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。相較于LPS單獨(dú)刺激組,5.0、20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理后IPEC-J2細(xì)胞遷移率顯著提高(P<0.05),但35.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)LPS刺激下IPEC-J2細(xì)胞遷移率的影響不顯著(P>0.05)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞遷移率的影響Fig.3 Effects of RES on migration rate of LPS-induced IPEC-J2 cells

2.4 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響

由圖4可見(jiàn),LPS刺激顯著提高了細(xì)胞上清液中IL-8、TNF-α含量(P<0.05),顯著降低了IL-10含量(P<0.05)。5.0、20.0和35.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞上清液中IL-8、TNF-α含量顯著低于LPS單獨(dú)刺激組(P<0.05),IL-10含量顯著高于LPS單獨(dú)刺激組(P<0.05)。

2.5 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5可見(jiàn),與對(duì)照組相比,LPS單獨(dú)刺激顯著提高了細(xì)胞中IL-8、TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、TLR4和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),顯著降低了IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。相較于LPS單獨(dú)刺激組,5.0、20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)得到改善,表現(xiàn)為IL-8、TNF-α、IL-1β、TLR4和MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),IL-10與NF-κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor protein α,IκBα)的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);此外,35.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理顯著降低了細(xì)胞中IL-8、TNF-α、TLR4和MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),顯著提高了IκBα的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),但未觀察到IL-1β和IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量的顯著變化(P>0.05)。

圖5 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of RES on mRNA relative expression levels of TLR4/NF-κB signaling pathway-related genes in LPS-induced IPEC-J2 cells

2.6 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖6可見(jiàn),與對(duì)照組相比,LPS刺激顯著降低了細(xì)胞中封閉蛋白-1(claudin-1)、閉鎖蛋白(occludin)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。相較于LPS單獨(dú)刺激組,5.0、20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞中claudin-1、occludin和ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。此外,35.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞中ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于LPS單獨(dú)刺激組(P<0.05)。

圖6 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of RES on mRNA relative expression levels of tight junction-related genes in LPS-induced IPEC-J2 cells

3 討 論

炎癥性腸病是獸醫(yī)臨床中常見(jiàn)的一類疾病,以消化機(jī)能障礙、采食量下降和腹瀉為主要特征,嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展和動(dòng)物福利。LPS是被廣泛使用的炎癥誘導(dǎo)劑,對(duì)腸道細(xì)胞屏障功能的損傷作用已在體外研究中被廣泛證實(shí)[15-16]。而白藜蘆醇具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎的功能,有證據(jù)表明白藜蘆醇可以通過(guò)減少黏膜炎癥來(lái)改善腸炎[9,11,13]。因此,本試驗(yàn)以LPS作為誘導(dǎo)試劑,建立豬小腸上皮細(xì)胞屏障炎性損傷模型,以評(píng)估白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞炎性損傷和屏障功能障礙的緩解作用。

腸上皮細(xì)胞參與了腸道屏障的形成,這對(duì)維持動(dòng)物的消化效率與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要,腸上皮細(xì)胞遷移速率能反映腸道損傷修復(fù)的情況[17-18]。已有研究表明,LPS對(duì)細(xì)胞遷移愈合過(guò)程有顯著的負(fù)面作用[19-20]。在本試驗(yàn)中,LPS雖然導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞遷移率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),但影響不顯著,這與上述結(jié)果有所區(qū)別,造成這種結(jié)果的原因可能與不同物種、不同組織的細(xì)胞對(duì)LPS敏感度存在差異有關(guān)。楊凱等[21]發(fā)現(xiàn),以50 μg/mL的白藜蘆醇處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后可有效緩解LPS對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程的抑制作用。同樣,本試驗(yàn)采用5.0、20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞,顯著提高了LPS刺激下IPEC-J2細(xì)胞的遷移能力,這從側(cè)面反映了白藜蘆醇增強(qiáng)了腸上皮單層細(xì)胞炎性損傷愈合的能力。

在革蘭氏陰性菌感染過(guò)程中,LPS作為病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),被最早發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)TLR4識(shí)別后,募集銜接分子MyD88與下游效應(yīng)子白細(xì)胞介素-1家族受體相關(guān)激酶1-4(IL-1 receptor-associated kinases 1 to 4,IRAK1-4)和受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)結(jié)合,經(jīng)過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起NF-κB抑制蛋白激酶β(inhibitor of NF-κB kinase β,IKKβ)的磷酸化和蛋白酶體降解以及主轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的二聚體釋放,而后靶位炎癥基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致發(fā)生促炎因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)[22]。這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)將直接影響上皮細(xì)胞的活性與屏障功能[23]。在本試驗(yàn)中,LPS激活了TLR4/NF-κB信號(hào)通路,改變了炎性因子(IL-8、IL-1β、IL-10和TNF-α)的表達(dá),提高了細(xì)胞上清液中IL-8、TNF-α的含量。袁昊等[24]研究顯示,白藜蘆醇是通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮其抗炎功能的。Zeng等[25]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇通過(guò)調(diào)控miR-34a/SIRT1/NF-κB通路,減輕了煙草焦油提取物誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞炎性損傷。瞿秋紅[26]的研究表明,白藜蘆醇可以顯著降低豬小腸上皮細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá),提示白藜蘆醇有利于改善腸道炎癥反應(yīng)。同樣,本試驗(yàn)中,白藜蘆醇通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng),降低了下游炎癥因子的mRNA表達(dá)與細(xì)胞上清液中促炎因子(IL-8、TNF-α)的含量。在相似的試驗(yàn)中,白藜蘆醇改善了IPEC-J2細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白(IκBα、NF-κB p65)的表達(dá),緩解因LPS引起的炎癥反應(yīng)[26],這佐證了本試驗(yàn)結(jié)果。

早期研究表明,腸道炎癥可破壞腸道屏障的完整性,腸道屏障失效又會(huì)加劇并擴(kuò)大腸道炎癥,而這種屏障功能障礙可能是緊密連接蛋白改變的結(jié)果[27]。有研究發(fā)現(xiàn),LPS能通過(guò)改變緊密連接相關(guān)基因(ZO-1、occludin和claudin家族)的表達(dá),破壞腸上皮屏障功能[28-30]。本試驗(yàn)中,LPS刺激后,IPEC-J2細(xì)胞中緊密連接相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,與上述結(jié)論一致。Mayangsari等[31]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇通過(guò)抑制occludin的酪氨酸磷酸化,改善Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中上皮屏障破壞。還有研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇的濃度為100.0 μmol/L時(shí),可通過(guò)抑制Notch1通路活性來(lái)上調(diào)HT-29細(xì)胞緊密連接蛋白(occludin、ZO-1、claudin-1)的表達(dá)[32]。本研究發(fā)現(xiàn),5.0、20.0 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞后,LPS引起的緊密連接相關(guān)基因(ZO-1、occludin和claudin-1)mRNA相對(duì)表達(dá)量的下降得到顯著緩解。結(jié)合上述白藜蘆醇緩解TLR4/NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度活化和降低促炎因子的分泌,我們推測(cè)白藜蘆醇能通過(guò)緩解炎癥損傷,有效抑制LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)基因ZO-1、claudin-1和occludin表達(dá)的降低,從而維持腸道上皮屏障穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié) 論

綜上所述,5.0和20.00 μmol/L白藜蘆醇可提高IPEC-J2細(xì)胞遷移率,調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子分泌,緩解TLR4/NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度活化,提高緊密連接相關(guān)基因表達(dá),從而緩解LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)與屏障功能障礙。