高碳水化合物飼料添加?；撬釋﹄s交鱧生長性能、肝臟糖代謝相關(guān)基因表達(dá)、抗氧化活性及免疫應(yīng)答的影響

李培佳 呂 旦* 李 敏 彭 凱 胡俊茹 黃 文,3 曹俊明 趙紅霞**

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究中心,廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640;2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湛江 524088;3.廣州飛禧特生物科技有限公司,廣州 510640)

?；撬?taurine)首次從牛膽汁中分離出,因此被稱為牛膽素[6]。牛磺酸由膳食攝取或自身合成,其中,水產(chǎn)品及畜禽產(chǎn)品中含量更為豐富[7]。牛磺酸不參與蛋白質(zhì)合成,在水產(chǎn)動物體內(nèi)以游離氨基酸形式分布并發(fā)揮生理功能[8]。?；撬嵩谒a(chǎn)動物體內(nèi)主要用于維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓[9]、清除氧自由基[10]、提高機(jī)體免疫力[11]、改善內(nèi)分泌狀態(tài)[12]及促進(jìn)糖、脂代謝[13]等。研究表明,飼料碳水化合物含量的提高可降低飼料中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的比例,但由于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)含量的下降,?；撬岬暮恳搽S之減少[14]。大黃魚(Larimichthyscrocea)[15]和真鯛(Pagrusmajor)[16]飼料缺乏牛磺酸會降低其生長性能,相反,?；撬岬难a(bǔ)充會改善這種現(xiàn)象,并提高飼料利用率[17]。另外,據(jù)報(bào)道牛磺酸可激活胰島素信號通路,增強(qiáng)胰島素敏感性并降低胰島素抵抗等功能[18]。然而關(guān)于牛磺酸對雜交鱧飼喂高碳水化合物飼料的緩解作用和機(jī)制目前還鮮有報(bào)道。因此,我們假設(shè)?；撬峋哂锌删徑饣蛞种扑鷦游镉筛咛妓衔镲暳弦鸬母闻K代謝性疾病。

長期攝入高碳水化合物飼料會抑制魚類生長,導(dǎo)致肝糖原積累,進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和肝臟功能異常[19-20]。肉食性魚類飼料碳水化合物的添加量通常為20%左右,雜交鱧飼料碳水化合物含量超過25%會導(dǎo)致高血糖和脂質(zhì)氧化積累以及炎癥反應(yīng),進(jìn)而損害免疫和抗氧化能力[19-20]。飼料添加?；撬峥梢燥@著促進(jìn)魚類生長,提高免疫力,激活胰島素信號通路,促進(jìn)糖代謝。日本牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鱸魚(Dicentrarchuslabrax)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[19-20]等水產(chǎn)動物的研究表明,?；撬嵩陲暳现械倪m宜添加量為1%左右。然而,目前關(guān)于牛磺酸在雜交鱧飼料中應(yīng)用的研究較為缺乏。因此,本研究以雜交鱧為試驗(yàn)對象,研究高碳水化合物飼料中添加?；撬釋﹄s交鱧生長性能、糖代謝、肝臟抗氧化活性及免疫應(yīng)答的影響及作用機(jī)制,旨在為?；撬嵩谒a(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)組:低碳水化合物組(LC組,碳水化合物含量為21%)、高碳水化合物組(HC組,碳水化合物含量為27%)及高碳水化合物飼料添加?；撬峤M(HT組,碳水化合物含量為27%,牛磺酸添加量為1%)。?；撬峒兌取?8%。按照飼料配方將不同的飼料原料進(jìn)行稱量,并粉碎過60目篩,逐級混合后拌水,采用B20強(qiáng)力攪拌機(jī)(廣州市番禺力豐食品機(jī)械廠)進(jìn)行混合,混合后采用T52型膨化機(jī)(廣州市華強(qiáng)膨化機(jī)械廠)制成膨化飼料,繼而將磷脂油、豆油和魚油進(jìn)行混合并噴灑到膨化飼料上,噴灑均勻后自然風(fēng)干,風(fēng)干后陰涼保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

1.2 試驗(yàn)魚和養(yǎng)殖管理

在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所白云試驗(yàn)基地進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn),養(yǎng)殖用水需曝氣后使用。從廣州市錦龍漁業(yè)有限公司購買雜交鱧魚苗。第1周在2.5 m×2.5 m×1.5 m的暫養(yǎng)網(wǎng)箱中暫養(yǎng),每天08:00和16:00飽食投喂LC組飼料2次。暫養(yǎng)結(jié)束后禁食24 h,隨機(jī)挑選體格均勻、初始體重為(22.02±0.02) g、活力旺盛的雜交鱧魚苗450尾,隨機(jī)分為3組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50尾,以重復(fù)為單位在1.5 m×1.5 m×1.5 m的網(wǎng)箱中進(jìn)行8周養(yǎng)殖試驗(yàn)。每天08:00和16:00飽食投喂各組試驗(yàn)飼料2次。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水體溶氧含量在8 mg/L左右,pH 8.0左右,氨氮含量<0.1 mg/L,水溫為25～32 ℃,試驗(yàn)采取自然光照。

1.3 生長性能指標(biāo)測定

每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)挑選6尾試驗(yàn)魚進(jìn)行測量,將體重、體長、內(nèi)臟等數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總,并統(tǒng)計(jì)存活率及消耗飼料量,相關(guān)計(jì)算公式如下:

存活率(SR,%)=100×F末/F初;
飼料系數(shù)(FC)=D總/(W末-W初);
蛋白質(zhì)沉積率(PPV,%)=100×(W末×
CP末-W初×CP初)/(D×CP飼料);
特定生長率(SGR,%/d)=100×
(lnW末-lnW初)/T;
增重率(WGR,%)=100×(W末-W初)/W初。

式中:F初為初始尾數(shù);F末為終末尾數(shù);CP初為初始魚體蛋白質(zhì)含量;CP末為終末魚體蛋白質(zhì)含量;W為體重;W初為魚初始體重;W末為魚終末體重;CP飼料為飼料蛋白質(zhì)含量;D總為攝入飼料總重;D為飼料攝入量;T為養(yǎng)殖時(shí)間。

1.4 樣品采集

8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)挑取3尾魚測定體成分;再隨機(jī)挑取8尾魚,采用MS-222(120 mg/L)麻醉,肝素鈉抗凝管采血5 mL,采集后的全血進(jìn)行10 min離心(3 500 r/min),離心后采集血漿進(jìn)行生化指標(biāo)測定。采集血液后,將試驗(yàn)魚放置于冰上迅速進(jìn)行解剖,摘取其中3尾魚肝臟,進(jìn)行糖代謝相關(guān)基因表達(dá)及免疫和抗氧化指標(biāo)的測定,再取3尾魚的肝臟,10%福爾馬林溶液固定,進(jìn)行肝臟切片的制作。

1.5 體成分測定

水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重的方法(GB/T 6435—2014)測定,粗蛋白質(zhì)含量利用半自動凱氏定氮儀,采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)測定,粗脂肪含量采用乙醚抽提的方法(GB/T 6433—2006)測定,粗灰分含量采用550 ℃灼燒至恒重的方法(GB/T 6433—2006)測定。

1.6 血漿生化指標(biāo)測定

采用雙縮脲法測定血漿中總蛋白(TP)含量,分光光度法測定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性,葡萄糖氧化酶法測定血漿GLU含量,酶偶聯(lián)速率法測定血漿尿素氮(UN)含量,酶法測定血漿甘油三酯(TG)含量,分光光度法測定血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性,酶法測定血漿總膽固醇(TCHO)含量。所有指標(biāo)采用全自動化分析儀(廣州金域醫(yī)學(xué)檢測)測定。

1.7 肝臟抗氧化指標(biāo)測定

測定肝臟過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量,肝糖原以及肌糖原含量均采用試劑盒測定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,測定步驟、原理和計(jì)算公式等參考試劑盒說明書。

1.8 肝臟切片

肝臟固定狀態(tài)良好后,對肝臟組織進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片最后鏡檢合格的樣片。在顯微鏡下瀏覽切片,使用成像顯微鏡拍攝或使用CaseViewer 2.2截取對應(yīng)不同的典型病變部位圖,對切片中典型病理改變,如炎癥、壞死、變性、增生以及纖維化等情況采用箭頭標(biāo)識,并反映出不同組之間的差異。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用總RNA提取試劑盒(諾唯贊生物科技股份有限公司)提取雜交鱧肝臟總RNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA完整性,DNA/RNA Calculator測定RNA濃度和純度。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR kit, 諾唯贊生物科技股份有限公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2(上海生工生物技術(shù)有限公司合成),β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因,采用20 μL反應(yīng)體系:上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,組織cDNA模板2 μL,dd H2O 7.2 μL,熒光劑(2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)10 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),陰性對照采用dd H2O作為模板,根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量[21]。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,先對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),滿足方差齊性條件則進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),差異顯著再用Tukey’s檢驗(yàn)方法進(jìn)行多重比較;方差齊性條件不滿足,則用Dunnett’s T3檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能分析

由表3可知,與HC組相比,HT組FC顯著降低(P<0.05),PPV顯著升高(P<0.05);各組間雜交鱧FBW、WGR、SR和SGR無顯著差異(P>0.05)。

表3 高碳水化合物飼料添加牛磺酸對雜交鱧生長性能的影響Table 3 Effects of taurine supplementation in high carbohydrate diet on growth performance of Channa maculata (♀) ×C. argus ()

2.2 血漿生化指標(biāo)分析

由表4可知,與HC組相比,HT組血漿TP含量顯著升高(P<0.05);與LC組和HT組相比,HC組血漿GLU含量顯著升高(P<0.05);與LC組相比,HC組和HT組血漿AST活性顯著升高(P<0.05);與LC組相比,HC組和HT組血漿ALP活性顯著下降(P<0.05);與LC組和HT組相比,HC組血漿ALT活性顯著升高(P<0.05);各組間血漿TG、UN和TCHO含量無顯著差異(P>0.05)。

表4 高碳水化合物飼料添加?；撬釋﹄s交鱧血漿生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of taurine supplementation in high carbohydrate diet on plasma biochemical indices of Channa maculata (♀) ×C. argus ()

2.3 肝臟抗氧化指標(biāo)分析

由表5可知,與HC組相比,HT組肝臟T-AOC顯著升高(P<0.05);與HC組相比,LC組和HT組肝臟GSH-Px活性顯著升高(P<0.05);與HC組相比,HT組肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05);與HC組相比,HT組肝臟MDA含量顯著升高(P<0.05);各組肝臟CAT和POD活性無顯著差異(P>0.05)。

表5 高碳水化合物飼料添加?；撬釋﹄s交鱧肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of taurine supplementation in high carbohydrate diet on liver antioxidant indexes of Channa maculata (♀) ×C. argus ()

2.4 肝臟糖原和胰島素含量分析

由表6可知,與HC組相比,HT組肝臟的肝糖原含量顯著下降(P<0.05);與LC組和HC組相比,HT組肝臟胰島素含量顯著升高(P<0.05);各組間肝臟肌糖原含量無顯著差異(P>0.05)。

表6 高碳水化合物飼料添加?；撬釋﹄s交鱧肝臟糖原和胰島素含量的影響Table 6 Effects of taurine supplementation in high carbohydrate diet on liver glycogen and insulin contents of Channa maculata (♀) ×C. argus () ng/g

2.5 肝臟胰島素信號通路相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖1可知,與HC組相比,HT組肝臟蛋白激酶B(AKT)和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);各組肝臟胰島素受體底物-1(IRS-1)基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Different letters in the data column indicated significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 高碳水化合物飼料添加?；撬釋﹄s交鱧肝臟胰島素信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of taurine supplementation in high carbohydrate diet on expression of genes related to insulin signaling pathway in liver of Channa maculata (♀) ×C. argus ()

2.6 肝臟糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖2可知,與LC組和HC組相比,HT組肝臟丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT2)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);各組間肝臟糖原合成酶(GS)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-磷酸酶(G6P)基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

2.7 肝臟免疫相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖3可知,與HC組相比,HT組肝臟白細(xì)胞介素-8(IL-8)基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);與HC組相比,LC組和HT組肝臟白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);與HC組相比,LC組和HT組肝臟轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與HC組相比,HT組肝臟熱休克蛋白70(HSP70)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與LC組和HC組相比,HT組肝臟熱休克蛋白90(HSP90)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與HC組相比,HT組肝臟白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與HC組相比,LC組和HT組肝臟Toll樣受體4(TLR4)和髓樣分化因子88(MyD88)基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.8 肝臟病理切片分析

由圖4可知,LC組和HT組雜交鱧肝索結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞排列緊密,脂質(zhì)含量豐富,表現(xiàn)為胞漿空白,部分靜脈周圍可見肝胰臟,細(xì)胞形態(tài)正常,組織未見明顯壞死或炎癥反應(yīng)。HC組雜交鱧肝胰臟周圍間隙增寬(黑色箭頭),小葉偶見炎性細(xì)胞小灶性浸潤(紅色箭頭),未見其他明顯異常。

3 討 論

肉食性魚類對飼料碳水化合物利用率較低,通?？刂圃?0%以下[22]。當(dāng)飼料碳水化合物含量過高會導(dǎo)致魚類生長抑制、肝糖代謝異常及炎癥反應(yīng)[22]。Xu等[23]研究表明,雜交鱧碳水化合物含量為11%能夠顯著促進(jìn)生長、提高抗氧化活性和免疫應(yīng)答。本研究表明,高碳水化合物飼料降低了雜交鱧WGR、SGR和PPV,升高FC,但并不顯著,這說明高碳水化合物飼料對雜交鱧產(chǎn)生生長抑制作用。本研究結(jié)果與大黃魚(Pseudosciaenacrocea,Richardson)研究結(jié)果[24]相似。飼料碳水化合物含量較高情況下魚類會通過高采食量維持正常的生長性能,這就解釋了雜交鱧采食高碳水化合物飼料導(dǎo)致的FC高但生長性能降低的原因[25]。在高碳水化合物飼料中添加?；撬岷?雜交鱧FC顯著下降,PPV顯著提高,WGR和SGR也相應(yīng)提高,但并不顯著,說明添加牛磺酸可顯著提高雜交鱧的生長性能。同時(shí)牛磺酸能夠提高PPV,減少蛋白質(zhì)作為能源物質(zhì)損耗[26]。牛磺酸還可刺激魚類采食感受器,增強(qiáng)攝食效率,這充分解釋了雜交鱧FC顯著下降,生長性能顯著提高的原因,同時(shí)也在牙鲆[27]和大菱鲆[28]等多種魚種中得到驗(yàn)證。

血漿生化指標(biāo)關(guān)聯(lián)到魚類的營養(yǎng)代謝及健康狀況[29]。在本試驗(yàn)條件下,雜交鱧攝食高碳水化合物飼料后,血漿GLU含量顯著升高。這可能由于在魚類體內(nèi)進(jìn)行營養(yǎng)代謝過程中,高碳水化合物飼料會導(dǎo)致魚類出現(xiàn)持續(xù)高血糖現(xiàn)象。這與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[30]和歐洲海鱸(Dicentrarchuslabrax)[31]研究結(jié)果相似。當(dāng)高碳水化合物飼料添加?；撬岷??；撬岜憩F(xiàn)出良好的降血糖效果,這可能由于牛磺酸可以促進(jìn)肌細(xì)胞攝取和利用GLU,加速糖酵解,降低血糖濃度,也可以誘導(dǎo)糖原合成酶Ⅰ活性升高,增加糖原的合成,同時(shí)降低糖原磷酸化酶活性,抑制糖原分解[32]。同時(shí)觀察到,飼料添加?；撬岷?血漿TP含量顯著升高,這與雜交鱧PPV結(jié)果一致,表明飼料添加?；撬峥梢燥@著促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)生成,這可能由于?；撬峥梢源龠M(jìn)大量的含硫氨基酸合成蛋白質(zhì)[33]。因此,可以推測出?；撬峥梢源龠M(jìn)雜交鱧的蛋白質(zhì)合成及代謝。血清代謝酶包括ALT、AST和AKP,是檢測動物健康狀況的重要血清標(biāo)志物,ALT、AST、AKP等組織標(biāo)記酶活性的改變與器官特異性細(xì)胞損傷程度有直接關(guān)系[34]。ALP被認(rèn)為參與生長、蛋白質(zhì)合成、營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和運(yùn)輸?shù)萚35]。在本試驗(yàn)中觀察到高碳水化合物飼料飼喂雜交鱧導(dǎo)致血漿AST和ALT活性顯著升高,轉(zhuǎn)氨酶活性升高代表了魚類健康受到高碳水化合物飼料的影響。在高碳水化合物飼料中添加牛磺酸后,雜交鱧血漿ALT活性顯著下降,ALP活性顯著升高,這說明添加?；撬峥杀Ｗo(hù)肝臟功能免受高碳水化合物飼料損害,顯著改善雜交鱧的健康狀況。

機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基,進(jìn)而損壞機(jī)體細(xì)胞,引起疾病的發(fā)生[36]。機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在氧化防御體系,可以清除氧化反應(yīng)產(chǎn)物,使機(jī)體保持氧化動態(tài)平衡狀態(tài)[37]。機(jī)體氧化防御體系包括酶系統(tǒng)(SOD、GSH-Px、T-AOC)和非酶系統(tǒng)(維生素E和維生素C)[38]。T-AOC反映機(jī)體抗氧化能力[39],SOD反映機(jī)體清除氧自由基的能力[40],GSH-Px反映機(jī)體清除過氧化氫的能力[41],MDA反映組織間脂質(zhì)氧化損傷的程度[42]。在本試驗(yàn)條件下,高碳水化合物飼料顯著降低了雜交鱧肝臟GSH-Px的活性,SOD活性和T-AOC也出現(xiàn)降低,但不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明,高碳水化合物飼料可降低機(jī)體的抗氧化能力,這可能由于高碳水化合物飼料降低了肝臟SOD活性,機(jī)體氧自由基顯著增加,肝臟發(fā)生氧化損傷,T-AOC顯著下降。同時(shí)觀察到,當(dāng)在高碳水化合物飼料中添加?；撬岷?雜交鱧肝臟T-AOC、GSH-Px和SOD活性顯著升高,MDA含量顯著下降,對雜交鱧肝臟抗氧化能力的改善尤其明顯,這表明高碳水化合物飼料中添加?；撬峥梢跃徑怆s交鱧的氧化應(yīng)激,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,這可能由于?；撬峥膳c自由基結(jié)合,阻止氧化反應(yīng)的進(jìn)行,直接發(fā)揮抗氧化作用。此外,牛磺酸還可調(diào)節(jié)線粒體蛋白質(zhì)合成,促進(jìn)線粒體呼吸活動,進(jìn)而保護(hù)線粒體,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性[10],這與石首魚(Totoabamacdonaldi)[43]和歐洲鱸魚[44]研究結(jié)果相似。

持續(xù)性高碳水化合物飼料的攝入,會使機(jī)體出現(xiàn)高血糖現(xiàn)象,這種現(xiàn)象也被認(rèn)為機(jī)體胰島素分泌不足[45]。在本試驗(yàn)條件下,HC組的雜交鱧肝臟胰島素含量低于LC組,并表現(xiàn)出高血糖現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果表明,雜交鱧吸收到體內(nèi)的糖類不能很好的利用,因此雜交鱧對糖類的利用效率可能與胰島素的分泌效率相關(guān)。同時(shí)觀察到,在高碳水化合物飼料中添加?；撬峥娠@著提高肝臟胰島素含量,這可能由于?；撬崮芤种埔认貯TP敏感的鉀離子通道活性,使KATP通道關(guān)閉,β細(xì)胞去極化激活電壓依賴性的鈣離子(Ca2+)通道增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+,從而刺激胰島素分泌,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞攝取和利用GLU,加快糖酵解效率,達(dá)到降血糖作用[18]。IRS-1是胰島素通路(IRS-1/PI3K/AKT)的第一信使,當(dāng)IRS-1激活后,胰島素信號會進(jìn)入細(xì)胞并激活PI3K,進(jìn)而通過AKT行使胰島素樣作用[46]。在本試驗(yàn)條件下,HC組雜交鱧肝臟AKT和PI3K的基因表達(dá)水平被顯著抑制,HT組肝臟AKT和PI3K基因相對表達(dá)量顯著上調(diào),這也有力地證明了牛磺酸對雜交鱧表現(xiàn)出的胰島素樣作用,?；撬徇M(jìn)入胰腺β細(xì)胞能夠引起胰島素的釋放,從而使血漿GLU含量降低,以調(diào)控雜交鱧的糖代謝過程[18]。GLU代謝的第1步是GLUT2介導(dǎo)GLU和肝細(xì)胞之間的相互轉(zhuǎn)運(yùn)[46]。PK和GK在糖酵解中發(fā)揮限速酶作用,在本試驗(yàn)中,高碳水化合物飼料抑制了PK和GLUT2的表達(dá),這種抑制會直接影響到GLU在肝臟和血液之間的轉(zhuǎn)運(yùn)速率,這一點(diǎn)從肝臟糖原累積可以表明,高碳水化合物飼料抑制了糖原分解效率,從而造成肝糖原蓄積,影響肝臟糖代謝。?；撬岬奶砑语@著促進(jìn)PK和GK的基因表達(dá),說明?；撬峥梢源龠M(jìn)糖酵解并提高肝臟糖代謝效率。

肝臟對免疫系統(tǒng)的貢獻(xiàn)非常重要,炎癥反應(yīng)作為魚類免疫系統(tǒng)反應(yīng)的重要組成部分,在應(yīng)對各種挑戰(zhàn)方面做出了巨大貢獻(xiàn)[47-48]。炎癥反應(yīng)是先天免疫系統(tǒng)應(yīng)對各種刺激的重要組成部分,主要是由細(xì)胞因子介導(dǎo)(IL-8、IL-1β、TNF-α、TGF-β和IL-10)[49]。IL-8主要促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上并遷移到炎癥部位[50],IL-1β和TNF-α可以通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的表達(dá)來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[51],TGF-β通過抑制炎性細(xì)胞因子的釋放來有效緩解炎癥[52],IL-10抑制T淋巴細(xì)胞的增殖、活化和遷移,限制炎癥反應(yīng)[49]。HSP在促進(jìn)身體細(xì)胞對各種壓力的抵抗力方面起著重要作用,因此常用于水生動物轉(zhuǎn)錄調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)的研究[53]。HSP70和HSP90基因表達(dá)水平的上調(diào)可以顯著增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞對各種應(yīng)激的抵抗力,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[54]。研究表明,攝入高碳水化合物飼料可引起肝臟損傷、脂肪沉積和炎癥反應(yīng)等。在本試驗(yàn)條件下,高碳水化合物飼料顯著上調(diào)了肝臟IL-1β和TNF-α基因相對表達(dá)量,顯著下調(diào)了TGF-β和HSP70基因相對表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,肉食性魚類由于肝糖應(yīng)激,飼料中高碳水化合物直接損傷肝臟,造成肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)。同時(shí)觀察到,在高碳水化合物飼料中添加?；撬?肝臟IL-8、IL-1β、TNF-α、TLR4和MyD88基因相對表達(dá)量顯著下調(diào),IL-10、TGF-β和HSP70基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)。這說明高碳水化合物飼料中添加?；撬峥梢燥@著改善雜交鱧的免疫能力。TLRs是一類跨膜蛋白,具有識別入侵病原體和觸發(fā)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能,MyD88和TLR4參與炎癥過程[55]。在本研究中,高碳水化合物飼料添加牛磺酸顯著下調(diào)了雜交鱧肝臟中MyD88和TLR4基因的表達(dá),結(jié)果表明,?；撬峥杉せ铍s交鱧的Toll樣受體,介導(dǎo)MyD88依賴的信號通路,最終抑制促炎細(xì)胞因子IL-8、IL-1β和TNF-α的釋放,激活獲得性免疫反應(yīng),最終調(diào)節(jié)免疫功能,增強(qiáng)機(jī)體抵抗力,減輕肝臟炎癥反應(yīng)。由此可見,飼料中添加?；撬峥梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來保護(hù)肝臟免受氧化損傷,通過上調(diào)抗炎因子的表達(dá)和抑制促炎因子的表達(dá)來減輕肝臟炎癥反應(yīng)。在本試驗(yàn)條件下,當(dāng)雜交鱧在高碳水化合物應(yīng)激狀態(tài),肝臟進(jìn)入病理狀態(tài),進(jìn)而表現(xiàn)出HSP70基因相對表達(dá)顯著下調(diào),隨著?；撬岬奶砑?肝臟MyD88和TLR4基因相對表達(dá)量顯著上調(diào),TLRs通過MyD88依賴通路誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。綜合分析表明,?；撬峥赏ㄟ^調(diào)節(jié)雜交鱧肝臟TLR4-MyD88信號通路相關(guān)因子減輕炎癥反應(yīng),改善免疫功能。

肝臟組織形態(tài)被認(rèn)為是評價(jià)魚類營養(yǎng)狀況、代謝和肝臟健康的良好指標(biāo)[56]。為了評估補(bǔ)充?；撬釋Ω咛妓衔镲暳弦鸬慕M織病理學(xué)改變的有效性,制作了肝臟切片。先前的研究表明,高碳水化合物飼料會損害肝臟,例如組織間隙增寬、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞核破裂等[57]。在本研究的高碳水化合物組中也可以觀察到炎性細(xì)胞浸潤癥狀。同樣,在本研究中,飼料中添加?；撬釡p少了由高碳水化合物飼料引起的肝臟組織學(xué)異常。由此可見,飼料中添加?；撬峥删徑怆s交鱧高碳水化合物飼料所誘導(dǎo)的肝臟炎癥病理狀態(tài)。

4 結(jié) 論

綜上所述,高碳水化合物飼料的攝入誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖代謝紊亂甚至肝臟形態(tài)改變,顯著降低了雜交鱧的生長性能。高碳水化合物飼料中添加?；撬犸@著降低了FC,這可使雜交鱧養(yǎng)殖飼料成本降低。此外,在高碳水化合物飼料中添加?；撬崽岣吡穗s交鱧肝臟的抗氧化能力,促進(jìn)了肝臟胰島素信號通路(PI3K和AKT)的激活,并通過調(diào)控TLR4-MyD88免疫信號通路,抑制促炎癥因子(IL-1β和TNF-α)基因表達(dá),緩解肝臟炎癥反應(yīng)。