滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)攝食、生長(zhǎng)及非特異性免疫的影響

周志斌 趙麗麗 王藝超 王魯波 代明琴 張西超 馬 強(qiáng) 梁萌青 徐后國(guó) 程鎮(zhèn)燕 衛(wèi)育良*

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津 300392;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島 266071;3.青島海大生物集團(tuán)股份有限公司,青島 266114)

滸苔(Enteromorphaprolifera)是“海上草原”的罪魁禍?zhǔn)?在各沿海國(guó)家近海廣泛分布,有著極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力與繁殖能力[1]。滸苔爆發(fā)給沿岸生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大危害[2],所造成的經(jīng)濟(jì)損失也非常大[3]。但是滸苔也并非沒(méi)有價(jià)值,相反,其富含多種生物活性物質(zhì),如多糖、酚類(lèi)、多肽、生物堿等[4]。因此,開(kāi)發(fā)利用滸苔資源,更好地挖掘其生物資源價(jià)值對(duì)滸苔治理具有重要意義。

滸苔屬藻類(lèi),可作為食品添加劑供人類(lèi)食用[5]。在畜禽上,研究發(fā)現(xiàn)其作為飼料原料能夠促進(jìn)肉兔[6]、肉雞[7]、肉鴨[8]的生長(zhǎng)并提高免疫功能,提高蛋雞[9]、蛋鴨[10]的產(chǎn)蛋性能以及蛋品質(zhì),增加奶牛的產(chǎn)奶量[11]。在水產(chǎn)動(dòng)物上,大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[12]、羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus×Oreochromisniloticus)[13]、皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)[14]、鱸魚(yú)(Lateolabraxjaponicus)[15]、珍珠龍膽石斑(Epinepheluslanceolatus)[16]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[17]、刺參(Stichopusjaponicus)[18]、鯽魚(yú)(Carassiusauratus)[19]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[20]等也已開(kāi)展研究,并發(fā)現(xiàn)滸苔粉(EPM)對(duì)這些水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、消化酶活性、肌肉品質(zhì)、非特異性免疫等方面具有重要作用。但是,這些研究大都以單一的EPM作為研究對(duì)象,滸苔的加工工藝過(guò)于簡(jiǎn)單,無(wú)法充分發(fā)揮滸苔含有的生物活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、免疫等方面的重要作用。因此,有必要通過(guò)優(yōu)化加工工藝,進(jìn)一步提高滸苔的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用EPM(粗蛋白質(zhì)含量為9.26%,粗脂肪含量為1.70%,總糖含量為39.37%)是黃海海域采集的天然滸苔經(jīng)剪切破碎、烘干粉碎所得;EPH(粗蛋白質(zhì)含量為7.93%,粗脂肪含量為0.28%,總糖含量為43.72%)是采用專(zhuān)一的滸苔細(xì)胞壁多糖降解酶對(duì)滸苔進(jìn)行生物破壁,然后通過(guò)滸苔多糖裂解酶將細(xì)胞內(nèi)糖鏈定向酶切,獲得高免活性低聚糖片段,并通過(guò)噴霧干燥而來(lái);EPP(粗蛋白質(zhì)含量為5.74%,粗脂肪含量為0%,總糖含量為50.40%)是滸苔經(jīng)酶解提取、純化、濃縮、噴霧干燥而成的水溶性硫酸多糖。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)以魚(yú)粉、磷蝦粉、豆粕為主要蛋白質(zhì)源,魚(yú)油為主要脂肪源,配制成粗蛋白質(zhì)含量為48%左右、粗脂肪含量為10%左右的等氮等脂的飼料。本試驗(yàn)主要比較云龍石斑魚(yú)對(duì)不同滸苔生物制品的利用差異,試驗(yàn)設(shè)計(jì)7個(gè)組(每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)25尾魚(yú)),分別飼喂無(wú)添加的基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)及分別添加0.2%的EPH(EPH0.2%組)、0.4%的EPH(EPH0.4%組)、0.03%的EPP(EPP0.03%組)、3.0%的EPM(EPM3.0%組)、0.1%二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT0.1%組)和1.0%魷魚(yú)膏(SP1.0%組)的試驗(yàn)飼料。不同滸苔生物制品在飼料中的添加量是基于滸苔生物制品加工工藝的難易程度及滸苔生物制品的成本確定的,使不同滸苔生物制品在飼料中添加成本接近,同時(shí),設(shè)計(jì)2個(gè)水平的EPH組,以便更好地理解云龍石斑魚(yú)對(duì)滸苔生物制品的利用情況,DMPT0.1%組和SP1%組的設(shè)置是用于研究滸苔生物制品的誘食性。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

試驗(yàn)飼料的制作采用黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室的小型飼料制粒機(jī)制粒,制粒開(kāi)始前,先將所有原料粉碎過(guò)80目篩網(wǎng),按照飼料配方逐級(jí)充分混勻,加水后用制粒機(jī)制成直徑為3 mm的飼料,加水量為飼料總重的35%,最后放入50 ℃烘箱烘8 h,在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司進(jìn)行,試驗(yàn)所用云龍石斑魚(yú)幼魚(yú)也購(gòu)于山東省海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司。試驗(yàn)開(kāi)始前,先將所有石斑魚(yú)魚(yú)苗放入飼養(yǎng)桶內(nèi),進(jìn)行1周的暫養(yǎng)試驗(yàn),暫養(yǎng)期間飼喂商品飼料(購(gòu)自青島賽格林生物工程有限公司,其中粗蛋白質(zhì)含量大約為50%,粗脂肪含量大約為10%),使石斑魚(yú)適應(yīng)飼養(yǎng)條件。飼養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始前,停食24 h,選擇大小均勻的石斑魚(yú)幼魚(yú)[初始體重為(7.47±0.03) g]進(jìn)行稱(chēng)重。然后,隨機(jī)將魚(yú)放入21個(gè)飼養(yǎng)桶內(nèi)(7個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù)),飼養(yǎng)桶體積為200 L,有效水體為180 L,每桶放25尾,流水養(yǎng)殖,持續(xù)充氧氣,每天人工飽食投喂2次(07:30和18:30),并記錄殘餌質(zhì)量,飼養(yǎng)試驗(yàn)周期為63 d。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)養(yǎng)殖水體狀況進(jìn)行了持續(xù)監(jiān)測(cè),飼養(yǎng)期間溫度為22.5～24.5 ℃、鹽度為22～29、pH為7.5～8.0、溶解氧含量為6～8 mg/L。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)開(kāi)始前,在暫養(yǎng)桶中隨機(jī)取10尾石斑魚(yú)幼魚(yú),用于魚(yú)體常規(guī)成分分析。試驗(yàn)結(jié)束后,停食24 h,分別稱(chēng)量每桶魚(yú)的總重量,記錄魚(yú)的尾數(shù),計(jì)算每桶魚(yú)的平均重量。在每桶中隨機(jī)取4尾魚(yú),用MS222(1∶10 000體積比)麻醉試驗(yàn)魚(yú)。從尾靜脈取血液,將取出的血液樣本置于4 ℃靜置3 h,3 500 r/min離心15 min,取上層血清,置于液氮中保存。然后,將魚(yú)解剖后收集同一部位頭腎、肝臟和肌肉樣品。接著,取部分肝臟組織,放入固定液中,用于肝臟組織切片分析。將頭腎、肝臟和肌肉的所有樣品立即置于液氮中保存,再轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取樣結(jié)束后,每桶隨機(jī)挑選2尾全魚(yú)放入-20 ℃?zhèn)溆?用于體成分分析。

1.5 相關(guān)計(jì)算公式

存活率(%)=[試驗(yàn)結(jié)束每桶魚(yú)尾數(shù)/
試驗(yàn)開(kāi)始每桶魚(yú)尾數(shù)]×100;
增重率(WGR,%)=[(終末體重-初始體重)/
初始體重]×100;
特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=[(ln終末體重-
ln初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)]×100;
攝食率(FI,%/d)={總干物質(zhì)攝食量/[飼養(yǎng)
天數(shù)×(初始體重+終末體重)/2]}×100;
飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)=攝入飼料總量/(終末
體重-初始體重);
蛋白質(zhì)效率(PER)=(終末體重-初始
體重)/(攝入飼料總量×飼料粗蛋白質(zhì)含量);
蛋白質(zhì)沉積率(PPV,%)=[(終末體重×終末
魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量-初始體重×
初始魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量)/(攝入飼料
總量×飼料粗蛋白質(zhì)含量)]×100;
脂肪沉積率(LPV,%)=[(終末體重×
終末魚(yú)體粗脂肪含量-初始體重×
初始魚(yú)體粗脂肪含量)/(攝入
飼料總量×飼料粗脂肪含量)]×100;
累積攝食量(CFI,g)=攝入飼料總量/魚(yú)尾數(shù);
相對(duì)累積攝食量(RCF,g)=A組的累積攝食量-
B組的累積攝食量。

1.6 樣品分析

飼料、魚(yú)體組成的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量參照AOAC(1984)[21]方法進(jìn)行測(cè)定。其中水分含量是將樣品放入烘箱105 ℃烘干至恒重,用失重法測(cè)定;粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(FOSS 2300,瑞典)測(cè)定;肝臟粗脂肪含量通過(guò)氯仿甲醇法測(cè)定,其余粗脂肪含量采用索氏抽提法(FOSS 2050,瑞典)測(cè)定;粗灰分含量采用失重法測(cè)定,將樣品在電磁爐上碳化后利用馬弗爐高溫(550 ℃)灼燒8 h測(cè)定。

血清或肝臟中糖、脂代謝相關(guān)指標(biāo):葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量;血清抗氧化指標(biāo):總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量;血清免疫指標(biāo):谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)活性,以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.7 RNA提取與基因表達(dá)測(cè)定

使用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa,日本)提取頭腎中的總RNA,使用Evo M-MLV RT Mix試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RNA的純度和濃度由超微量分光光度計(jì)(Colibri,德國(guó))檢測(cè)。所有RNA樣品的260/280 nm的吸光度比值均在1.8～2.0,表明提取的RNA樣品的純度較高,可以滿(mǎn)足后續(xù)分析。利用Evo M-MLV RT Mix試劑盒合成cDNA,保存于-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit Ⅱ(湖南艾科瑞生物工程有限公司)和定量PCR儀(Roche Light Cycler 96,瑞士)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系由1 μL cDNA模板、5 μL 2×SYBR Green Pro Taq HS Premix Ⅱ、0.3 μL正向引物、0.3 μL反向引物和3.4 μL無(wú)菌水組成。程序如下: 95 ℃預(yù)變性30 s,然后依次進(jìn)行“95 ℃變性5 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s”的40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增階段后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析(從65 ℃增加到97 ℃,6.4 ℃/min),以確認(rèn)唯一的產(chǎn)物條帶。根據(jù)2-ΔΔCt法[22]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Table 2 Primers sequences

1.8 攻毒試驗(yàn)

本試驗(yàn)所用哈維氏弧菌菌株來(lái)自中國(guó)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所。菌種經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后連續(xù)稀釋,獲得不同濃度的菌液用于攻毒試驗(yàn)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn),獲得哈維氏弧菌對(duì)云龍石斑魚(yú)的半數(shù)致死量(LD50,7 d)為1×10-6CFU/mL。樣品采集結(jié)束后,每個(gè)重復(fù)取10尾魚(yú)進(jìn)行攻毒試驗(yàn),取0.2 mL半數(shù)致死量的哈維氏弧菌菌液注射到試驗(yàn)魚(yú)腹腔中。統(tǒng)計(jì)云龍石斑魚(yú)被攻毒后7 d的死亡數(shù)量,計(jì)算累積死亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 26.0軟件,對(duì)試驗(yàn)各數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),當(dāng)方差分析顯著時(shí),采用Tukey氏法進(jìn)行組間多重比較,所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 滸苔生物制品在云龍石斑魚(yú)上的誘食效果

由表3可知,在初始體重接近的情況下,攝食第1餐DMPT0.1%組的攝食量(每組每尾魚(yú)平均攝食的飼料質(zhì)量)最大,顯著高于對(duì)照組、EPH0.4%和EPP0.03%組(P<0.05)。

表3 飼喂21 d后各組每尾魚(yú)的累積攝食量Table 3 Cumulative feed intake per fish in each group after 21 days of feeding g

由圖1可知,在攝食3 d后,除EPP0.03%組外,與對(duì)照組相比的其余組的相對(duì)累積攝食量均為正值,而攝食10到21 d后,與對(duì)照組相比,所有滸苔生物制品組的相對(duì)累積攝食量均為正值。

橫坐標(biāo)中,數(shù)字1代表第1餐相對(duì)攝食量,數(shù)字2代表第1天相對(duì)攝食量,數(shù)字3代表前3天相對(duì)累積攝食量,數(shù)字4代表前5天相對(duì)累積攝食量,數(shù)字5代表前7天相對(duì)累積攝食量,數(shù)字6代表前10天相對(duì)累積攝食量,數(shù)字7代表前14天相對(duì)累積攝食量,數(shù)字8代表前21天相對(duì)累積攝食量。圖2同。On the horizontal axis, No.1 represents the amount of relative feed intake of the first feeding (FF) meal, No.2 represents the amount of relative feed intake on day 1, No.3 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 3 days, No.4 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 5 days, No.5 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 7 days, No.6 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 10 days, No.7 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 14 days, and No.8 represents the amount of relative cumulative feed intake on first 21 days. The same as Fig.2.圖1 DMPT、滸苔生物制品與對(duì)照組攝食后21 d相對(duì)累積攝食量Fig.1 Relative cumulative feed intake of DMPT, E. prolifera bio-products compared with control group after 21 days of feeding

由圖2可知,在攝食21 d后,相對(duì)累積攝食量在DMPT0.1%組與對(duì)照組之間均為正值;但是DMPT0.1%組與EPM3.0%組之間相對(duì)累積攝食量在攝食7 d之前為正值,攝食7 d以后為負(fù)值,且差距逐漸拉大;DMPT0.1%組與EPP0.03%組或EPH0.4%組之間的相對(duì)累積攝食量的變化趨勢(shì)與DMPT0.1%組與EPM3.0%組之間的變化趨勢(shì)相似,但是轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在攝食10 d后。

圖2 DMPT與滸苔生物制品組攝食后21 d相對(duì)累積攝食量Fig.2 Relative cumulative feed intake of DMPT and E. prolifera bio-products groups after 21 days of feeding

2.2 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表4可知,根據(jù)終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率的結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加0.1%DMPT的云龍石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能最差,顯著低于EPM3.0%組(P<0.05),與對(duì)照組相比,添加EPH、EPM和EPP有升高生長(zhǎng)性能的趨勢(shì),且依次為EPM3.0%組>EPH0.2%組>EPH0.4%組>EPP0.03%組,但均無(wú)顯著差異(P>0.05)。EPM3.0%組的攝食率最高,顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。此外,攝食率在所有試驗(yàn)組均高于對(duì)照組。飼料轉(zhuǎn)化率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率在各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 4 Effects of E. prolifera bio-products on growth performance of Yunlong grouper

2.3 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)魚(yú)體成分組成及糖、脂代謝的影響

由表5可知,云龍石斑魚(yú)魚(yú)體水分、粗脂肪和粗灰分含量在各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),但與EPP0.03%組相比,魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量在EPH0.2%組和SP1.0%組顯著升高(P<0.05)。

與對(duì)照組相比,飼料中添加EPH,特別是添加0.2%時(shí)會(huì)顯著降低血清和肝臟中甘油三酯的含量(P<0.05),但是對(duì)飼料脂肪沉積率有提高的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,EPM3.0%組血清和肝臟甘油三酯含量分別降低19.5%和25.4%,EPP0.03%組血清和肝臟甘油三脂含量分別降低2.9%和38.0%,但均差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比,EPH0.4%組血清高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高(P<0.05),血清低密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低(P<0.05),而EPP0.3%組和EPM3.0%組血清低密度脂蛋白膽固醇含量也顯著降低(P<0.05)。此外,EPP0.3%組血清葡萄糖含量相比EPH0.2%組顯著升高(P<0.05)。

2.4 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)血清抗氧化、免疫指標(biāo)的影響

由表6可知,與對(duì)照組相比,滸苔生物制品對(duì)血清還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05),但提升了總抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性,特別是EPH,與對(duì)照組相比,EPH0.2%組血清總抗氧化能力顯著提高(P<0.05),EPH0.4%組血清超氧化物歧化酶的活性顯著提高(P<0.05)。此外,與對(duì)照組相比,所有滸苔生物制品均顯著降低了血清丙二醛的含量(P<0.05)。血清酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性在各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,EPH0.4%組顯著提高了血清溶菌酶活性(P<0.05)。

表6 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)血清抗氧化、免疫指標(biāo)的影響Table 6 Effects of E. prolifera bio-products on serum antioxidant and immune indexes of Yunlong grouper

2.5 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)肝臟的影響

由圖3可知,所有組肝臟切片中肝細(xì)胞形態(tài)完整、胞核正常、肝小葉形態(tài)完整,未發(fā)現(xiàn)肝臟損傷或病變。

A～G依次為對(duì)照、EPH0.2%、EPH0.4%、EPP0.03%、EPM3.0%、DMPT0.1%、SP1.0%組。From A to G, the control, EPH0.2%, EPH0.4%, EPP0.03%, EPM3.0%, DMPT0.1%, SP1.0% groups.圖3 云龍石斑魚(yú)肝臟切片(HE染色)Fig.3 Liver section of Yunlong grouper (HE stain)

2.6 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)頭腎組織免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4可知,與對(duì)照組相比,所有滸苔生物制品均有降低促炎因子IL-1β和IL-6基因相對(duì)表達(dá)量的趨勢(shì),特別是EPH0.2%組,顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。另外,所有滸苔生物制品組促炎因子TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。EPH0.4%組和EPP0.03%組抑炎因子IL-10的基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、EPH0.2%組、EPM3.0%組和SP1.0%組(P<0.05)。

IL-1β:白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β;IL-6:白細(xì)胞介素-6 interleukin-6;IL-8:白細(xì)胞介素-8 interleukin-8;TNF-α:腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α;IL-10:白細(xì)胞介素-10 interleukin-10。柱狀圖中不同字母表示不同組間有顯著差異(P<0.05)。Bars with different letters mean significant difference between groups (P<0.05).圖4 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)頭腎組織免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of E. prolifera bio-products on expression of immune-related genes in head kidney of Yunlong grouper

2.7 攻毒結(jié)果

由圖5可知,在對(duì)云龍石斑魚(yú)攻毒后,魚(yú)的死亡開(kāi)始出現(xiàn)在第2天,結(jié)束在第5天,死亡率在10%～40%。其中EPM3.0%組累積死亡率最低,為10%,其次為EPH0.4%組,累積死亡率為20%;累計(jì)死亡率最高組為DMPT0.1%組,為40%,其次為對(duì)照組,累積死亡率為37%。

圖5 哈維氏弧菌攻毒后的7 d累積死亡率Fig.5 Cumulative mortality rate of 7 days after Vibrio harveyi challenge

3 討 論

3.1 滸苔生物制品在云龍石斑魚(yú)上的誘食效果

滸苔作為飼料中誘食劑成分已經(jīng)在多種水產(chǎn)動(dòng)物上開(kāi)展研究,如在大菱鲆上,王曉蘭等[23]用攝食率法和迷宮法,均發(fā)現(xiàn)滸苔的誘食作用;在錦鯉(Cyprinuscarpio)上,關(guān)洪斌等[24]的研究表明,滸苔的誘食性雖然低于大蒜,但是強(qiáng)于江蘺、陳皮、海星等。基于此,本研究通過(guò)觀察石斑魚(yú)前21天攝食量的變化,開(kāi)展?jié)G苔對(duì)云龍石斑魚(yú)誘食性的系統(tǒng)研究。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),攝食率的結(jié)果與之前研究相似,EPM、EPH和EPP 3種滸苔生物制品都具有誘食作用,但是通過(guò)對(duì)21 d攝食量的觀察,發(fā)現(xiàn)滸苔生物制品與DMPT的誘食方式不同,DMPT對(duì)石斑魚(yú)的誘食作用在攝食后第1餐就非常明顯,但是隨著攝食時(shí)間的推移,其誘食作用在減弱,而滸苔生物制品的誘食作用則是隨著攝食時(shí)間的增加逐漸增加的,EPM在攝食后7 d體現(xiàn)出來(lái),而EPH和EPP則是在攝食后10 d開(kāi)始體現(xiàn)。滸苔這種不同于DMPT的誘食方式可能是多種因素作用的結(jié)果,一方面可能是其富含二甲巰基丙酸(DMSP),根據(jù)王亮[25]的研究,滸苔所屬的綠藻中DMSP含量是紅藻和褐藻的幾十倍;另一方面,可能是其富含甜菜堿,根據(jù)Han等[26]的研究,滸苔所屬的綠藻中甜菜堿的含量也是紅藻和褐藻的幾倍到十幾倍;最后,滸苔還富含多糖、膳食纖維、某些促進(jìn)攝食的氨基酸等,這些可能也會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的攝食產(chǎn)生影響[24,27-28]。因此,我們猜測(cè),相比DMPT,滸苔的誘食作用是受到多種誘食成分的影響,再加上滸苔生物制品在飼料中的添加量本來(lái)就很低,所以這些誘食成分在整個(gè)飼料中的水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)合成的DMPT直接添加到飼料中的含量,從而導(dǎo)致誘食作用效果比DMPT緩慢,但是長(zhǎng)期飼喂純的DMPT可能會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似于誘食疲勞效應(yīng),使得誘食效果有所降低,而滸苔生物制品由于含有多種誘食成分,不會(huì)產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)疲勞效應(yīng),這使得最終對(duì)石斑魚(yú)的誘食作用會(huì)逐步超過(guò)DMPT。基于此,接下來(lái)有必要從誘食機(jī)制方面開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

3.2 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能和魚(yú)體成分的影響

滸苔作為一種飼料原料,已經(jīng)在水產(chǎn)動(dòng)物上開(kāi)展了大量研究,并發(fā)現(xiàn)適宜添加水平能夠提高大黃魚(yú)[12]、羅非魚(yú)[29]、墨吉明對(duì)蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)[30]、鯽魚(yú)[19]、大菱鲆[31]等水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。此外,在石斑魚(yú)上,徐安樂(lè)等[16,32]先后報(bào)道,發(fā)酵滸苔和超微粉碎滸苔可以顯著提高珍珠龍膽石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能,且最適添加量分別是2%和4%。因此,本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí),EPM的添加量設(shè)計(jì)為3.0%,與在珍珠龍膽石斑魚(yú)上的結(jié)果類(lèi)似,即與對(duì)照組相比,飼料中添加滸苔生物制品(包括EPH、EPP和EPM),云龍石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能均有升高的趨勢(shì)。同時(shí),本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),添加0.2%的EPH與添加3.0%的EPM在添加量上相差15倍,但是生長(zhǎng)效果接近,這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)酶解工藝可以有效提高滸苔制品活性物質(zhì)的利用率,從而更好地促進(jìn)云龍石斑魚(yú)生長(zhǎng)。類(lèi)似的結(jié)果也在羅非魚(yú)上發(fā)現(xiàn),發(fā)酵滸苔相比超微粉碎的滸苔,在該魚(yú)上的適宜添加水平有降低的趨勢(shì)[33]。這表明滸苔作為飼料原料,可以通過(guò)加工工藝的改進(jìn),提高其在魚(yú)類(lèi)上的利用效率。

3.3 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)脂代謝的調(diào)節(jié)作用

滸苔除了具有誘食和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用外,在哺乳動(dòng)物的研究中,還發(fā)現(xiàn)滸苔,特別是其中的EPP對(duì)脂肪的調(diào)節(jié)具有重要作用[34-35],例如,對(duì)飼喂高脂飼料的小鼠,進(jìn)行灌喂EPP,不僅可以有效降低小鼠的肝臟脂肪和血清甘油三酯的含量[36],而且也能有效降低血清低密度脂蛋白膽固醇的含量[37],表明EPP在降血脂方面的重要作用;此外,將EPP添加到飼糧中直接飼喂肉雞,也能夠起到降低血清甘油三酯含量,提高血清高密度脂蛋白含量的作用[38]。而在魚(yú)類(lèi)上,也發(fā)現(xiàn)了滸苔的降血脂作用,胡曉偉[39]的研究表明,飼料中添加2%、3.5%的粉碎滸苔顯著降低了黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)幼魚(yú)血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量,添加5%、6.5%的粉碎滸苔顯著升高了血清高密度脂蛋白膽固醇含量。與上述結(jié)果類(lèi)似,在本研究中,發(fā)現(xiàn)3種滸苔生物制品均能不同程度降低血清甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇含量,并提高高密度脂蛋白膽固醇含量,且發(fā)現(xiàn)添加0.2%～0.4%的EPH,降脂作用好于添加0.03%的EPP和3.0%的EPM,考慮到EPH、EPP和EPM在飼料中的添加量差異,這表明不同加工方式可以在降低滸苔使用量的同時(shí)提高其降血脂方面的功效。此外,添加0.2%～0.4% EPH還有效降低了肝臟中甘油三酯的含量,但卻提高了魚(yú)體脂肪沉積率,特別是EPH0.2%組,這表明EPH可能導(dǎo)致攝食的脂肪在降低肝臟中的脂肪后再在體內(nèi)重新分布,因此提高了體脂肪的沉積率。

3.4 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)抗氧化能力的影響

當(dāng)機(jī)體抗氧化能力減弱,不足以清除氧化自由基時(shí),就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[40],而有學(xué)者利用自由基體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法,發(fā)現(xiàn)滸苔具有較強(qiáng)的抗氧化活性,甚至可作為潛在的抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用[41],因此,當(dāng)EPM添加到水產(chǎn)飼料中,可能會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化能力產(chǎn)生重要的影響。在隨后的研究中得到證明,大量的研究發(fā)現(xiàn),EPM能夠提高羅非魚(yú)[29]、墨吉明對(duì)蝦[30]、鯽魚(yú)[19]、花鱸[42]等水產(chǎn)動(dòng)物血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性,并降低脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛的含量。而本研究中,不但證實(shí)滸苔生物制品包括EPH、EPP和EPM,均能一定程度提高血清中總抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性,并降低丙二醛含量;而且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),滸苔的加工形式會(huì)影響滸苔活性成分含量,從而影響?hù)~(yú)類(lèi)抗氧化能力的提高,在本試驗(yàn)條件下,添加0.2%～0.4% EPH的抗氧化能力強(qiáng)于添加0.03% EPP和3.0% EPM,這一點(diǎn)從EPH添加組具有最高的血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性和最低的丙二醛含量中可以看出。

3.5 滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)免疫指標(biāo)的影響

滸苔因其富含EPP,而多糖是一種重要的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì),因此,其被認(rèn)為在提高機(jī)體免疫上具有重要作用[43]。本研究中,為探究滸苔生物制品對(duì)云龍石斑魚(yú)免疫力的影響,首先,分析了肝臟健康狀況,通過(guò)對(duì)組織切片的觀察發(fā)現(xiàn),包括對(duì)照組在內(nèi),所有試驗(yàn)組的肝臟的細(xì)胞形態(tài)完整,無(wú)肝臟損傷或病變,表明所有肝臟的健康狀況良好,為了進(jìn)一步驗(yàn)證肝臟組織切片的結(jié)果,本試驗(yàn)測(cè)定了評(píng)估肝臟健康狀況的重要指標(biāo)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有組均無(wú)顯著差異。在紅鰭東方鲀[17]上,也發(fā)現(xiàn)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性沒(méi)有受到飼料中添加滸苔生物制品的影響。原因可能是,本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)飼料配方時(shí),盡量使飼料原料和營(yíng)養(yǎng)組成接近石斑魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)需求,加上飼養(yǎng)條件良好,所以所有魚(yú)的生長(zhǎng)都非常健康,沒(méi)有出現(xiàn)肝臟損傷情況,這點(diǎn)也從98.67%～100.00%的成活率得到驗(yàn)證。

溶菌酶在魚(yú)體內(nèi)廣泛分布,具有裂解革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的活性,被認(rèn)為是評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)非特異性免疫的重要指標(biāo)[44-45]。本研究中,添加滸苔生物制品,特別是0.4%的EPH,血清溶菌酶活性顯著升高,類(lèi)似的結(jié)果在珍珠龍膽石斑魚(yú)[32]、花鱸[42]、羅非魚(yú)[13]等魚(yú)類(lèi)的研究中也發(fā)現(xiàn),這提示攝食滸苔后,魚(yú)類(lèi)的抗菌能力可能增強(qiáng)。因此,進(jìn)一步進(jìn)行了哈維氏弧菌攻毒試驗(yàn),結(jié)果進(jìn)一步證明,飼料中添加滸苔生物制品可以提高云龍石斑魚(yú)的抗病力,降低死亡率,其中,添加3.0%的EPM組存活率最高,抗病力最強(qiáng),其次是添加0.4%的EPH組,這與血清溶菌酶活性的結(jié)果相似,證明了滸苔生物制品在提高云龍石斑魚(yú)抗菌能力方面的作用。

在畜禽研究中,發(fā)現(xiàn)飼料中添加滸苔能夠影響炎性因子如TNF-α、IL-1β等的表達(dá)[46],而對(duì)炎性因子的測(cè)定是監(jiān)測(cè)機(jī)體炎性反應(yīng)及免疫力的有效手段[47]。因此,本研究也測(cè)定了云龍石斑魚(yú)頭腎促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)和抑炎因子(IL-10)的基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),滸苔生物制品對(duì)促炎因子中IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表達(dá)都有顯著降低或降低趨勢(shì),而添加0.4%的EPH和0.03%EPP顯著增加了抑炎因子IL-10的基因表達(dá),相似的結(jié)果也在皺紋盤(pán)鮑[14]中發(fā)現(xiàn),這表明飼料中添加滸苔生物制品后,云龍石斑魚(yú)發(fā)生炎癥的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)有一個(gè)顯著的降低。

4 結(jié) 論

綜上所述,EPM、EPH和EPP 3種滸苔生物制品在對(duì)云龍石斑魚(yú)的攝食、生長(zhǎng)、降血脂、增強(qiáng)抗氧化能力、提高免疫力等方面均有一定的有益作用,且通過(guò)酶解工藝等對(duì)滸苔進(jìn)行處理后,可在降低飼料中滸苔使用量的同時(shí),達(dá)到或超過(guò)傳統(tǒng)EPM的作用效果。