宋 丹 段 濤 陳炳旭 陳麗仙 王薇薇* 閔育娜*
(1.西北農林科技大學動物科技學院,楊陵 712100;2.國家糧食和物資儲備局科學研究院糧食品質營養(yǎng)研究所,北京 100037)
隨著人們對肉蛋奶需求的增加,集約化養(yǎng)殖成為畜禽生產的主要養(yǎng)殖模式,但該養(yǎng)殖模式會產生大量的動物糞便,而動物糞便處理不當會嚴重污染環(huán)境,同時傳播病原菌[1]。在需求增加的同時,畜禽產品的品質也日益受到關注,抗生素的限制使用加劇了動物感染細菌性炎癥的風險,進而會影響畜禽產品的品質。家禽糞便中的臭味物質排放和抗生素替代品的選擇已成為家禽業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn),因此尋找既能減少臭味物質排放又能增強機體免疫能力的高效環(huán)保策略具有巨大的生態(tài)和科學價值。飼糧中添加益生菌和益生元是目前應用最為廣泛的策略之一,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和低聚果糖是常見的益生菌和益生元。Qiao等[2]研究表明,飼糧中添加植物乳桿菌能夠顯著提高蛋雞產蛋率和糞便乳酸菌數(shù)量,產蛋率比對照組提高了2.8%。大量研究指出,飼糧中添加植物乳桿菌能夠增強機體免疫和抗氧化能力,改善腸道屏障功能和腸道微生物組成[3-5],降低氨氣的排放[6]。Shang等[7]研究表明,低聚果糖能夠顯著提高肉雞回腸絨毛高度、隱窩深度和黏膜總厚度,提高回腸中白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)mRNA表達量,提高肉雞的免疫能力。除此之外,飼糧中添加低聚果糖可以改善腸道菌群[8-9]。但是,低聚果糖對蛋雞的影響研究很少,同時植物乳桿菌和低聚果糖對臭味物質糞臭素、吲哚的影響尚未研究。同時,植物乳桿菌的抗逆性差是目前限制其使用的關鍵因素之一,微囊化包被和保護劑可以有效增強其抗逆性[10],但微囊化和保護劑雙層包被植物乳桿菌對蛋雞的影響尚未可知。低聚果糖為植物乳桿菌提供能量,促進其定植,二者聯(lián)合使用效果是否優(yōu)于單獨使用也未有報道。因此,本試驗旨在研究雙層包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞生產性能、蛋品質、免疫能力、糞便臭味及盲腸微生物的影響,為植物乳桿菌和低聚果糖在蛋雞養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。
本試驗所用植物乳桿菌LP15-1為本課題組保藏菌種,包被植物乳桿菌采用國家糧食和物資儲備局科學研究院專利技術(ZL202011208280.7)生產,該技術利用多層包被技術提高了植物乳桿菌的抗逆性,其中活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g;低聚果糖來自山東某生物股份有限公司,其中主要成分為35%蔗果三糖、50%蔗果四糖和10%蔗果五糖。
試驗選取360只健康的34周齡海蘭褐蛋雞,隨機分為4組(基礎產蛋率分別為96.86%、96.47%、96.86%和96.86%),每組6個重復,每個重復15只。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧,試驗組分別飼喂在基礎飼糧的基礎上添加1 g/kg包被植物乳桿菌(MLP組)、1 g/kg低聚果糖(FOS組)以及1 g/kg包被植物乳桿菌+1 g/kg低聚果糖(SYN組)的飼糧?;A飼糧為參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制的玉米-豆粕型飼糧,其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期24周。
表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %
本試驗在天津畜牧獸醫(yī)研究所武清基地進行,試驗采用3層階梯籠養(yǎng),每籠3只雞,雞舍環(huán)境溫度維持在21~24 ℃,采用16 h人工光照,按正常免疫程序進行免疫接種。試驗期間,雞只自由采食和飲水,每天07:00、12:00和17:00各投料1次,全程監(jiān)測雞群健康狀況并記錄死淘雞數(shù)。試驗結束當天,每重復隨機選取1只雞,翅靜脈采血于抗凝管中,2 000×g、4 ℃離心15 min,制備血漿;同時,收集新鮮糞便于離心管中,存于-20 ℃待測。雞只采血后,采用二氧化碳(CO2)窒息后頸靜脈放血致死,取盲腸食糜于離心管中,于-80 ℃保存待測。
1.4.1 生產性能和蛋品質
試驗期間,每天按重復記錄產蛋數(shù)、蛋重、喂料量和破蛋數(shù),在試驗結束后計算各組的產蛋率、平均日采食量、平均蛋重、料蛋比和破蛋率。試驗結束當天,每重復收集5枚雞蛋進行蛋品質分析,其中蛋殼強度采用蛋殼強度測定儀EFG-0503測定,蛋殼厚度采用蛋殼厚度測定測量儀ETG-1061測定,蛋黃顏色、哈氏單位和蛋白高度采用蛋品質分析儀EMT-5200測定,蛋形指數(shù)采用游標卡尺測定。
1.4.2 血漿免疫指標和糞便臭味物質含量
采用雞特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(北京中科凱澤科技有限公司)檢測血漿INF-γ、白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-10含量。根據(jù)Zhu等[11]描述的方法,采用高效液相色譜法測定糞便中臭味物質吲哚和糞臭素含量。
1.4.3 盲腸微生物
盲腸微生物采用16S rRNA高通量測序方法進行分析,包括DNA提取、PCR擴增、熒光定量以及Illumina文庫構建和測序[12]。其中,測序采用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進行,隨后在美吉生信云平臺(https://cloud.majorbio.com)上進行數(shù)據(jù)分析。利用操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)信息,采用Mothur 1.30.1軟件計算盲腸微生物α多樣性指數(shù),包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)。通過線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)和線性判別分析效應大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析,確定不同類群間細菌從門到屬顯著富集的類群(LDA評分>2,P<0.05)[13]。
試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2016進行初步處理,然后采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析,隨后采用Duncan氏法進行多重比較檢驗,試驗結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示,P<0.05表示差異顯著。
由表2可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞產蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和破蛋率均無顯著影響(P>0.05)。不過,與對照組(CON組)相比,試驗組產蛋率和破蛋率均有改善,其中MLP組改善最為明顯,其次是SYN組;MLP組產蛋率較對照組提高了2.68%,破蛋率降低了43.40%。
表2 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞生產性能的影響Table 2 Effects of coated Lactobacillus plantarum and fructooligosaccharide on performance of laying hens
由表3可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋白高度和哈氏單位有顯著影響(P<0.05),對蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、蛋殼強度和蛋殼厚度均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比,FOS組和SYN組蛋白高度和哈氏單位顯著提高(P<0.05);MLP組蛋品質各項指標均無顯著差異(P>0.05),但蛋殼強度、蛋白高度、蛋黃顏色和哈氏單位均有所提高(P>0.05)。
表3 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞蛋品質的影響Table 3 Effects of coated Lactobacillus plantarum and fructooligosaccharide on egg quality of laying hens
由表4可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞血漿免疫指標均有顯著影響(P<0.05)。與對照組相比,MLP組和FOS組蛋雞血漿INF-γ、IL-6和IL-2含量顯著降低(P<0.05),SYN組血漿IL-10和IL-6含量顯著提高(P<0.05),且SYN組血漿IL-10、IL-6和IL-2含量顯著高于MLP組和FOS組(P<0.05)。
表4 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞血漿免疫指標的影響Table 4 Effects of coated Lactobacillus plantarum and fructooligosaccharide on plasma immune indices of laying hens pg/mL
由表5可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞糞便臭味物質含量有顯著影響。與對照組相比,試驗組蛋雞糞便中吲哚和糞臭素含量均顯著降低(P<0.05),其中FOS組降低效果最好,糞便中吲哚和糞臭素含量比對照組均降低87%以上,其次是MLP組,降低79%以上。
表5 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞糞便臭味物質含量的影響Table 5 Effects of coated Lactobacillus plantarum and fructooligosaccharide on fecal odorous substance contents of laying hens ng/mg
2.5.1 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞盲腸微生物α多樣性的影響
由表6可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞盲腸微生物α多樣性各項指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。不過,與對照組相比,FOS組Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)有所降低,Simpson指數(shù)有所升高,表明飼糧中添加低聚果糖降低了蛋雞盲腸微生物的多樣性和豐富度;SYN組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)有所升高,表明飼糧同時添加包被植物乳桿菌和低聚果糖提高了盲腸微生物的豐富度。
表6 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞盲腸微生物α多樣性的影響Table 6 Effects of coated Lactobacillus plantarum and fructooligosaccharide on α diversity of cecal microbiota of laying hens
2.5.2 包被植物乳桿菌和低聚果糖對蛋雞盲腸微生物組成的影響
由圖1可知,在門水平上,與對照組相比,MLP組蛋雞盲腸厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度有所提高,FOS組盲腸擬桿菌門(Bacteroidota)相對豐度有所提高,試驗組盲腸螺旋菌門(Spirochaetota)和脫硫菌門(Desulfobacterota)相對豐度有所降低,其中MLP組盲腸螺旋菌門和FOS組盲腸脫硫菌門相對豐度降低最多,分別較對照組降低了89.18%和71.28%。在屬水平上,與對照組相比,MLP組盲腸乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度有所提高,盲腸擬桿菌屬(Bacteroides)和理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相對豐度有所降低;FOS組盲腸擬桿菌屬和羅姆布茨菌屬(Romboutsia)相對豐度有所提高;SYN組盲腸瘤胃球菌屬扭鏈群(Ruminococcus_torques_group)和考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)相對豐度有所提高。
2.5.3 蛋雞盲腸差異微生物LDA和LEfSe分析
由圖2可知,對照組蛋雞盲腸顯著富集的微生物是鱗球菌屬(Sphaerochaeta)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)(LDA評分>2,P<0.05),MLP組顯著富集的微生物是未分類消化鏈球菌科(unclassified_f_Peptostreptococcaceae)(LDA評分>2,P<0.05),FOS組顯著富集的微生物是假黃桿菌屬(Pseudoflavonifractor)和雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae),SYN組顯著富集的微生物是霍氏真桿菌屬(Eubacterium_hallii_group)和韋榮氏球菌屬(Veillonella)(LDA評分>2,P<0.05)。綜上可知,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖改變了蛋雞盲腸微生物的組成,表現(xiàn)為提高了有益菌(如雙歧桿菌科、霍氏真桿菌屬等)相對豐度,降低了有害菌(如脫硫弧菌屬)相對豐度。
A:線性判別分析效應大小分析 LEfSe analysis;B:線性判別分析 LDA。Desulfobacterota:脫硫菌門;Actinobacteria:放線菌綱;Desulfovibrionia:脫硫弧菌綱;Bifidobacteriales:雙歧桿菌目;Desulfovibrionales:脫硫弧菌目;Bifidobacteriaceae:雙歧桿菌科;Desulfovibrionaceae:脫硫弧菌科;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Eubacterium_hallii_group:霍氏真桿菌屬;Lachnospiraceae_NK4A136_group:毛螺菌科NK4A136群;Pseudoflavonifractor:假黃桿菌屬;Sphaerochaeta:鱗球菌屬;Veillonella:韋榮氏球菌屬;unclassified_f_Peptostreptococcaceae:未分類消化鏈球菌科。圖2 蛋雞盲腸差異微生物LDA和LEfSe分析Fig.2 LDA and LEfSe analysis of differential cecal microbiota of laying hens
植物乳桿菌和低聚果糖是目前應用廣泛的益生菌和益生元,但研究主要集中在肉雞上,且飼糧中添加植物乳桿菌和低聚果糖可以提高肉雞的生長性能[14-17]。但Ding等[18]和Al-Khalaifa等[19]分別在飼糧中添加植物乳桿菌和低聚果糖未顯著改善肉雞生長性能。Qiao等[2]在飼糧中添加植物乳桿菌顯著提高蛋雞產蛋率和采食量。Feng等[20]在飼糧中添加低聚果糖可以提高黃羽肉種雞的產蛋率、蛋重和料蛋比。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖未顯著影響蛋雞生產性能,但是產蛋率和破蛋率均有改善。生產性能的改善可能是因為包被植物乳桿菌和低聚果糖提高了機體的免疫能力和改善了腸道微生物組成,進而促進了營養(yǎng)物質的消化和吸收[3]。而飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖對生產性能的影響不同的原因可能是因為菌株類別和活性、動物品種以及飼養(yǎng)環(huán)境不同所致[21]。隨著生活水平的提升,人們不僅僅關注生產性能,蛋品質的優(yōu)劣也是重點關注之一。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中聯(lián)合添加包被植物乳桿菌和低聚果糖(SYN組)顯著提高蛋白高度和哈氏單位,這與Xu等[3]研究益生菌(枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌)提高產蛋高峰期和產蛋后期的蛋白高度和哈氏單位的結果一致,其原因有待進一步研究。
細胞因子主要由Th1細胞和Th2細胞分泌,在調節(jié)免疫和炎癥方面具有重要意義[22]。細胞因子IL-2和INF-γ是由Th1細胞在病毒或細胞內細菌感染后產生,具有促進炎癥和細胞吞噬作用;而IL-10是由Th2細胞分泌產生,有助于抗體合成并抑制炎癥[23-24];IL-6既是促炎細胞因子又是抗炎細胞因子,在單核細胞和巨噬細胞中產生[25]。有研究指出,植物乳桿菌可減少Th1類細胞因子(降低血清IFN-γ含量和回腸IL-6表達),上調Th2類細胞因子IL-4在回腸中表達[24]。飼糧中添加低聚果糖能提高肉雞回腸中IL-10的mRNA表達量[26]。上述結果與本研究一致,本研究結果表明,飼糧中單獨添加包被植物乳桿菌或低聚果糖顯著降低了蛋雞血漿IL-6、IL-2和INF-γ含量,聯(lián)合添加則顯著提高了血漿IL-10含量。植物乳桿菌和低聚果糖增強機體免疫能力是通過升高IL-10含量,調節(jié)先天性和適應性T細胞反應,有效抑制炎癥反應實現(xiàn)的[25];同時,其能夠通過減少IL-6、IL-2和INF-γ炎癥細胞因子,抑制腸道結構和屏障功能受損,從而提高機體對營養(yǎng)物質的消化和吸收能力[27];此外,還有可能是其能夠平衡促炎因子和抗炎因子,保護機體免受病原體入侵,并且維持腸道內環(huán)境的穩(wěn)定[28]。
惡臭排放已成為畜牧業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)之一,糞臭素和吲哚是導致雞排泄物惡臭的主要原因,二者導致多種生物體疾病,并且不易生物降解[1]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌能夠降低糞便糞臭素和吲哚含量分別達20.0%和36.0%[10]。Zhu等[11]在飼糧中添加低聚糖顯著降低了肉雞排泄物中的吲哚和糞臭素含量。本研究中,植物乳桿菌經過新工藝包被后添加,蛋雞糞便糞臭素和吲哚含量降低了79%以上,飼糧中添加低聚果糖使糞便糞臭素和吲哚含量降低了87%以上,但二者聯(lián)合使用未出現(xiàn)協(xié)同效果。吲哚和糞臭素是由微生物活動對L-色氨酸進行多步降解產生的,因此,糞臭素和吲哚的產生受可用L-色氨酸水平、腸道微生物組成和飼糧組成的調節(jié)[11]。高濃度的吲哚和糞臭素可能通過解偶聯(lián),從而抑制氧化磷酸化在線粒體中形成,對蛋雞的生產性能產生不利影響[29]。飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖降低臭味物質含量可能是因為其能夠增加腸道內有益菌數(shù)量,降低腸道pH,促進更多的蛋白質和氨基酸消化吸收,從而抑制色氨酸轉化為糞臭素和吲哚,最終降低臭味物質的排放。
維持腸道微生物群落的動態(tài)平衡對于減輕炎癥和改善動物腸道健康具有重要意義[25]。本研究結果表明,飼糧中聯(lián)合添加包被植物乳桿菌和低聚果糖能夠提高蛋雞盲腸微生物Chao1指數(shù)和ACE指數(shù),表明包被植物乳桿菌和低聚果糖聯(lián)合添加提高了盲腸菌群的豐富度,菌群豐富度提高可能是因為包被植物乳桿菌和低聚果糖降低了臭味物質含量,減少了其對腸道上皮細胞的氧化損傷,從而能夠維護腸道氧化還原穩(wěn)態(tài);還有可能是因為低聚果糖促進了植物乳桿菌的增殖,增加了有益菌的數(shù)量。
本試驗中,飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖在門和屬水平上均改變了蛋雞盲腸微生物組成。在門水平,與對照組相比,MLP組盲腸厚壁菌門相對豐度提高,試驗組盲腸螺旋菌門和脫硫菌門相對豐度降低。厚壁菌門在恢復腸道穩(wěn)態(tài)和營養(yǎng)物質消化利用方面發(fā)揮著重要作用,其豐度與能量和營養(yǎng)物質吸收呈正相關[30]。研究指出,飼糧中添加植物乳桿菌能夠提高北京鴨腸道厚壁菌門相對豐度,促進其生長性能提高并降低血清促炎因子白細胞介素-1β含量[24]。因此,本研究飼糧中添加包被植物乳桿菌可能通過提高厚壁菌門豐度而改善了蛋雞的營養(yǎng)利用和抗炎狀態(tài),并最終改善了產蛋性能和降低了臭味物質的排放。螺旋菌門豐度的提高會降低飼料轉化率,進而影響繁殖和生產性能[31]。脫硫菌門可能釋放脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)到腸道引起炎癥反應,同時擾亂腸道能量代謝,誘導腸上皮細胞的異常增殖,損傷腸道屏障[32]。飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖可能是通過降低螺旋菌門和脫硫菌門豐度,提高飼料轉化率,降低腸道炎癥和腸道屏障損傷,從而提高蛋雞的生產性能和機體免疫能力。
已有研究報道,乳桿菌屬通過產生有機酸(乳酸和乙酸)提高機體免疫能力和腸道完整性,從而抵抗沙門氏菌等病原體的感染,并促進營養(yǎng)吸收,進而改善生長性能[33-34];擬桿菌屬會導致腸道炎癥并降低營養(yǎng)物質消化吸收[30]。Lan等[35]指出,理研菌科RC9腸道群與高脂飲食誘導的“有害菌”呈正相關,與“有益菌”呈負相關,其豐度的提高可能會進一步誘導菌群紊亂。本研究中,與對照組相比,MLP組蛋雞盲腸乳桿菌屬相對豐度提高,盲腸擬桿菌屬和理研菌科RC9腸道群相對豐度降低,這就進一步解釋了飼糧中添加包被植物乳桿菌可能是通過改變微生物組成提高了營養(yǎng)物質的利用率,并降低了機體的炎癥反應,進而提高了生產性能。有研究指出,盲腸中擬桿菌屬、嗜膽菌屬(Bilophila)和埃希氏桿菌屬(Escherichia)相對豐度的下降導致腸道糞臭素減少[36],這也就解釋了MLP組臭味物質含量降低是通過降低擬桿菌屬和理研菌科RC9腸道群豐度實現(xiàn)的。大量研究指出,雙歧桿菌科有利于樹突狀細胞的成熟以及T細胞和T輔助細胞發(fā)育的調節(jié),并產生宿主產生能量所需的必需短鏈脂肪酸[37-38]。飼糧中添加果聚糖能夠提高雙歧桿菌豐度,并通過促進肉雞盲腸的低pH來抑制病原體(大腸桿菌和沙門氏菌)增殖[38];低聚果糖能夠增強腸道發(fā)酵,增加短鏈脂肪酸的產生,刺激雙歧桿菌等有益菌的生長[8],這與本研究結果一致,本研究飼糧中添加低聚果糖顯著富集了雙歧桿菌科。
瘤胃球菌屬扭鏈群通過增加脫氧膽酸的產生和通過膽汁酸-脂肪-G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體Gpbar1(TGR5)軸改善肥胖而有益于代謝[39];考拉桿菌屬通過產丙酸降低LPS結合蛋白和C反應蛋白的水平來減少炎癥和保護腸道黏膜屏障[40]。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加聯(lián)合包被植物乳桿菌和低聚果糖提高了蛋雞盲腸瘤胃球菌屬扭鏈群和考拉桿菌屬相對豐度,進一步進行LEfSe多級物種差異判別分析發(fā)現(xiàn),SYN組顯著富集霍氏真桿菌屬和韋榮氏球菌屬。韋榮氏球菌屬是短鏈脂肪酸乙酸鹽和丙酸鹽的生產者,可以維持能量穩(wěn)態(tài),其豐度的提高可以增強腸道菌群的能量代謝[41]?;羰险鏃U菌屬在調節(jié)加強腸道屏障功能和調節(jié)全身炎癥的生物途徑中發(fā)揮有益作用[42]。因此,飼糧中聯(lián)合添加包被植物乳桿菌和低聚果糖可能是通過改變微生物組成,減少炎癥和改善腸道屏障功能,進而促進代謝。
飼糧中添加包被植物乳桿菌和低聚果糖能夠提高蛋雞蛋品質和免疫能力,改善盲腸微生物組成,降低糞便臭味物質含量;其中,低聚果糖在改善蛋品質和降解臭味物質方面效果較佳,包被植物乳桿菌和低聚果糖聯(lián)合添加在提高機體免疫能力和改善盲腸微生物組成方面效果較佳。