姜黃提取物與石榴皮提取物的復(fù)合物對(duì)文昌雞生長(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)和盲腸微生物的影響

張諺鵬 林 苗 肖亞紅 溫劉發(fā)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642)

我國(guó)是肉雞產(chǎn)業(yè)大國(guó),禽飼用添加劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。自“禁抗”以來(lái),不少學(xué)者都在研究開(kāi)發(fā)替代抗生素的添加劑來(lái)穩(wěn)定或提高肉雞生長(zhǎng)性能,此前已開(kāi)發(fā)出諸多可行的植物提取物[1]。其中,姜黃提取物與石榴皮提取物具有多種生物學(xué)活性,可作為抗生素的替代物應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)中。

姜黃提取物含有姜黃素類與揮發(fā)油類化合物,還含有黃酮類、糖類、多肽類、脂肪酸和微量元素[2]。姜黃乙醚和甲醇提取物對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌存在抑菌潛力[3],其中的揮發(fā)油類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸埃希菌等有較強(qiáng)的抑菌活性[4]。此外,姜黃素類化合物對(duì)炎癥性疾病(關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、牛皮癬、皮炎)和神經(jīng)病理性疼痛有良好的預(yù)防和治療作用[5]。研究顯示,飼糧中添加487.5 mg/kg的姜黃素能顯著提高舍飼羔羊的平均日增重[6]。石榴皮提取物主要成分是鞣質(zhì)類、黃酮類和生物堿類,次要成分有氨基酸、糖類等。有體外試驗(yàn)表明,鞣質(zhì)類成分鞣花酸對(duì)白色念珠菌、新生隱球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、煙曲霉菌和胞內(nèi)分枝桿菌等具有抗菌活性[7]。石榴皮煎劑能降低炎癥模型小鼠的血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和分泌型免疫球蛋白(sIgA)的含量,提高小鼠免疫力[8]。另有研究顯示,50 mg/kg石榴皮甲醇提取物對(duì)胃潰瘍模型大鼠潰瘍的抑制率達(dá)到65.87%[9],表明石榴皮甲醇提取物能緩解消化道疾病;飼糧中添加2.0%的石榴皮粉能提高拜城油雞的平均日增重和屠宰率[10],有利于禽類養(yǎng)殖。

目前的研究報(bào)道多是單一的姜黃提取物、石榴皮提取物或二者分別與其他植物提取物聯(lián)合應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中,有關(guān)二者聯(lián)合應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖則鮮有報(bào)道。與此同時(shí),單獨(dú)應(yīng)用某一種植物提取物的效果很少能與抗生素相當(dāng),且不同的試驗(yàn)條件和動(dòng)物模型導(dǎo)致結(jié)果差別很大。本研究擬將姜黃提取物和石榴皮提取物聯(lián)合應(yīng)用于文昌雞的養(yǎng)殖中,探究其對(duì)文昌雞生長(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)和盲腸微生物的影響,期望能在飼養(yǎng)效果上有良好、穩(wěn)定地表現(xiàn),使其作為無(wú)害有效的飼料添加劑投入到實(shí)際生產(chǎn)中,以期為多種植物提取物聯(lián)合應(yīng)用于禽業(yè)養(yǎng)殖中提供借鑒和依據(jù),豐富復(fù)合提取物的研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

石榴皮提取物(10∶1,即10 kg石榴皮通過(guò)水提得到1 kg提取物),其主要成分是鞣質(zhì)類、黃酮類和生物堿類,次要成分為氨基酸和糖類等;姜黃提取物(10∶1,即10 kg姜黃通過(guò)水提得到1 kg提取物),主要成分是姜黃素類與揮發(fā)油類化合物,次要成分有黃酮類、糖類、多肽類、脂肪酸和微量元素。以上二者均購(gòu)自西安某生物工程有限公司。姜黃提取物與石榴皮提取物的提取工藝流程為:挑選原料→粉碎→水提→濃縮→浸膏→溶劑萃取→濃縮→浸膏→噴霧干燥→粉碎→提取物。按1∶1的比例將石榴皮提取物與姜黃提取物混合均勻制成復(fù)合提取物,在飼糧中添加時(shí)以玉米芯粉和麥飯石為載體配制成預(yù)混劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取57日齡文昌雞母雞1 260只,隨機(jī)分為7組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)36只,開(kāi)始試驗(yàn)前各重復(fù)體重差異不顯著(P>0.05),均勻度整齊。對(duì)照組飼喂不添加復(fù)合提取物的基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加100、200、400、800、1 600和3 200 g/t復(fù)合提取物的試驗(yàn)飼糧,試驗(yàn)期為35 d?；A(chǔ)飼糧依據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) kg/t

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在惠州京基智農(nóng)畜牧有限公司雞場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)雞采用籠養(yǎng)模式,各組飼養(yǎng)管理方式、飼養(yǎng)環(huán)境條件一致。試驗(yàn)期間試驗(yàn)雞自由采食粉料,保證料槽余料充足;自由飲水,除了開(kāi)始試驗(yàn)時(shí)使用多維抗應(yīng)激外,未使用其他添加劑或藥物;每天24 h光照(白天自然光照,晚上開(kāi)照明燈補(bǔ)光);疫苗接種按照雞場(chǎng)的免疫程序執(zhí)行;定期配制試驗(yàn)飼糧,定期進(jìn)行水線的清潔、地面的沖洗。

1.4 樣品采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)稱量試驗(yàn)雞空腹體重,記為初始體重,飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量試驗(yàn)雞空腹體重,記為終末體重。在飼養(yǎng)試驗(yàn)期間,每天觀察雞群的健康狀況,記錄每日投料、余料及雞只死淘情況。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù),計(jì)算試驗(yàn)雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死亡率(MR)。

1.4.2 血清的采集與免疫指標(biāo)的檢測(cè)

挑選每個(gè)重復(fù)中最接近該重復(fù)平均體重的5只雞進(jìn)行采樣,采樣前進(jìn)行12 h的饑餓處理。通過(guò)頸動(dòng)脈放血,用10 mL離心管接血液(2/3容積),避免污染,每只雞采集2管血液;將盛有血液的離心管置于離心管架上,室溫傾斜放置1～2 h后,用離心機(jī)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,完畢后取上清1.5 mL,裝于2只2 mL離心管中,標(biāo)明組別后放到樣品袋,轉(zhuǎn)到干冰箱暫存后存入-20 ℃冰箱,待測(cè)血清免疫指標(biāo)。

血清中免疫球蛋白G(IgG)、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-1β、IL-6、脂多糖(LPS)含量均采用對(duì)應(yīng)試劑盒(IgG、LPS、IFN-γ試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn),IL-1β、IL-6試劑盒由廣州東林生物科技有限公司生產(chǎn))通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 盲腸微生物樣采集與檢測(cè)

1.4.3.1 采集

將采血后的雞只屠宰,剪下每只雞的2條盲腸,用棉線在回盲韌帶處結(jié)扎,一條盲腸置于5 mL離心管中,編號(hào),置于有干冰的泡沫箱中,并于當(dāng)日轉(zhuǎn)至-20 ℃冰箱中保存;另一條盲腸剪開(kāi)后用鑷子擠壓收集內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管內(nèi),將無(wú)菌凍存管放入干冰中,之后于-80 ℃保存,待檢。

1.4.3.2 盲腸微生物檢測(cè)

本試驗(yàn)所有盲腸微生物樣本的擴(kuò)增、測(cè)序和物種注釋流程均由深圳微生太科技有限公司完成,具體流程如下。

(1)DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?soi試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提,用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量;用338F(5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR儀:ABI geneamp?9700型),擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL,包含4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶,10 ng DNA模板,由超純水補(bǔ)至20 μL。

(2)文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行定量檢測(cè),根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

(3)物種注釋

將原始序列fastq文件通過(guò)qiime tools import插件轉(zhuǎn)化文件格式,然后運(yùn)用QIIME2 dada2插件進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接和去嵌合體得到特征序列。運(yùn)用QIIME2 feature-classifier插件將擴(kuò)增特征序列(ASV)的代表序列(根據(jù)338F/806R引物對(duì)將數(shù)據(jù)庫(kù)修剪到V3～V4區(qū)域)與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),得到物種的分類信息表。

(4)α多樣性及相關(guān)性分析

α多樣性及相關(guān)性分析主要用qiime2 diversity插件完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,并使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行方差分析,組間多重比較采用Duncan氏法,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,試驗(yàn)開(kāi)始前各組間初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,添加200、400 g/t復(fù)合提取物顯著提高了文昌雞的終末體重和平均日增重(P<0.05);添加400 g/t復(fù)合提取物顯著提高了文昌雞的平均日采食量(P<0.05);添加200 g/t復(fù)合提取物顯著降低了文昌雞的料重比(P<0.05)。

表2 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of compound extract on growth performance of Wenchang broilers

以復(fù)合提取物添加量100、200、400、800 g/t為自變量(M),分別以平均日增重、平均日采食量和料重比為因變量(N)展開(kāi)線性分析,其調(diào)整后R2、P值及線性回歸方程如表3所示。由表3可知,平均日增重?zé)o法建立線性模型,不能進(jìn)一步分析;平均日采食量和料重比可以建立線性方程,但從調(diào)整后R2及P值可知,這2個(gè)指標(biāo)的線性分析預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不高,無(wú)法下定結(jié)論。因此,又以復(fù)合提取物添加量100、200、400、800 g/t為自變量(X),分別以平均日增重、平均日采食量和料重比為因變量(Y)進(jìn)行二次曲線分析,3個(gè)指標(biāo)調(diào)整后R2、P值及二次曲線方程如表4所示,二次回歸圖如圖1所示。由表4可知,平均日采食量和料重比與復(fù)合提取物的二線曲線調(diào)整后R2較低,擬合程度低,而平均日采食量是這3個(gè)指標(biāo)中二次曲線擬合度最好的;從3個(gè)指標(biāo)的P值來(lái)看,均無(wú)顯著性差異,但平均日采食量更加有線性的趨勢(shì);由圖1可知,平均日采食量的數(shù)據(jù)點(diǎn)更接近曲線。綜上所述,復(fù)合提取物添加量通過(guò)影響3個(gè)指標(biāo)中的平均日采食量,進(jìn)而影響生長(zhǎng)性能的解釋更科學(xué)合理,由其二次曲線方程得出,當(dāng)復(fù)合提取物添加量為481.45 g/t時(shí),平均日采食量最高,生長(zhǎng)性能最好。

圖1 平均日增重、平均日采食量和料重比與復(fù)合提取物添加量的二次回歸圖Fig.1 Quadratic regression diagram of ADG, ADFI, F/G and compound extract supplemental level

表3 平均日增重、平均日采食量和料重比(N)與復(fù)合提取物添加量(M)的線性分析Table 3 Linear analysis of ADG, ADFI, F/G (N) and compound extract supplemental level (M)

表4 平均日增重、平均日采食量和料重比(Y)與復(fù)合提取物添加量(X)的二次曲線分析Table 4 Quadratic curve analysis of ADG, ADFI, F/G (Y) and compound extract supplemental level (X)

2.2 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知,與對(duì)照組相比,添加3 200 g/t復(fù)合提取物顯著提高了文昌雞血清中IFN-γ含量(P<0.05),顯著降低了血清中IL-1β含量(P<0.05);各添加復(fù)合提取物組文昌雞血清中IgG、IL-6、LPS含量均顯著降低(P<0.05)。

表5 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞血清免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of compound extract on serum immune indexes of Wenchang broilers

2.3 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞盲腸微生物的影響

2.3.1 測(cè)序結(jié)果

經(jīng)Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,40個(gè)樣本得到全部原始序列數(shù)為2 656 290,進(jìn)行質(zhì)量控制、去噪、拼接、去嵌合體,形成操作分類單元(OTU)。所有原始序列得到OTU數(shù)為2 082 884,質(zhì)量控制比例為78.41%。

2.3.2 注釋信息基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)物種絕對(duì)豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息,全部樣本的Feture sequence從2個(gè)界[細(xì)菌界(Bacteria)、古細(xì)菌界(Archaea)]中共篩選出13個(gè)門,22個(gè)綱,30個(gè)目,46個(gè)科,79個(gè)屬和113個(gè)種。

根據(jù)門相對(duì)豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息得到所有樣本門水平的注釋信息,如圖2所示。由圖2可知,相對(duì)豐度排在前6的門有擬桿菌門(Bacteroidetes,48.37%)、厚壁菌門(Firmicutes,41.77%)、變形菌門(Proteobacteria,4.28%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes,1.66%)、放線菌門(Actinobacteria,1.56%)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres,0.61%)。

Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Proteobacteria:變形菌門;Synergistetes:互養(yǎng)菌門;Actinobacteria:放線菌門;Deferribacteres:脫鐵桿菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Elusimicrobia:迷蹤菌門;Spirochaetes:螺旋體門;Verrucomicrobia:疣微菌門;Lentisphaerae:黏膠球形菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Unclassified:未分類。圖2 文昌雞盲腸微生物門水平物種組成Fig.2 Species composition of cecal microbiota at phylum level of Wenchang broilers

根據(jù)屬相對(duì)豐度表,基于Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息,得到所有樣本屬水平的注釋信息,如圖3所示。由圖3可知,相對(duì)豐度排在前8的屬有擬桿菌屬(Bacteroides,24.40%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus,6.59%)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella,5.60%)、巨單胞菌屬(Megamonas,5.17%)、Papillibacter(3.40%)、普氏菌屬(Prevotella,2.96%)、梭菌屬(Clostridium,2.77%)、糞桿菌屬(Faecalibacterium,2.61%)。

Unclassified:未分類;Bacteroides:擬桿菌屬;Ruminococcus:瘤胃球菌屬;Barnesiella:巴恩斯氏菌屬;Megamonas:巨單胞菌屬;Prevotella:普氏菌屬;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Dethiosulfovibrio:脫硫代硫酸鹽弧菌屬;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌屬;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Alistipes:另枝菌屬;Selenomonas:月形單胞菌屬;Butyricicoccus:丁酸球菌屬;Lactobacillus:乳桿菌屬;Oscillospira:顫螺旋菌屬;Gemmiger:芽殖菌屬;Sporobacter:孢桿菌屬;Other:其他。圖3 文昌雞盲腸微生物屬水平物種組成Fig.3 Species composition of cecal microbiota at genus level of Wenchang broilers

2.3.3 α多樣性分析

由表6中的Goods_coverage指數(shù)可以得出,所有樣本的注釋情況良好,此次測(cè)序結(jié)果能反映出樣本中微生物的真實(shí)情況。與對(duì)照組相比,各添加復(fù)合提取物組的Chao1、Ace、Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。與添加100 g/t復(fù)合提取物組相比,添加3 200 g/t復(fù)合提取物組Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表6 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞盲腸微生物α多樣性的影響Table 6 Effects of compound extract on cecal microbial α diversity of Wenchang broilers

2.3.4 菌屬差異性

由表7可知,與對(duì)照組相比,添加100 g/t復(fù)合提取物組文昌雞的乳桿菌屬(Lactobacillus)相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05),而添加400、3 200 g/t復(fù)合提取物組無(wú)顯著性差異(P>0.05),但有提高其相對(duì)豐度的趨勢(shì);添加400、3 200 g/t復(fù)合提取物組的顫螺旋菌屬(Oscillospira)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。與添加100 g/t復(fù)合提取物組相比,添加400 g/t復(fù)合提取物組的優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)相對(duì)豐度顯著增高(P<0.05)。

表7 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞9個(gè)菌屬相對(duì)豐度的影響Table 7 Effects of compound extract on relative abundances of 9 bacterial genera of Wenchang broilers %

2.3.5 相關(guān)性分析

Pheatmap可用于分析環(huán)境因子或其他臨床表型數(shù)據(jù)與微生物群落或物種之間是否顯著相關(guān)。對(duì)文昌雞盲腸微生物中部分菌屬的相對(duì)豐度與復(fù)合提取物添加量、文昌雞平均日增重進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,文昌雞盲腸微生物中Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬(Olsenella)的相對(duì)豐度與平均日增重呈顯著正相關(guān)(P<0.05),文昌雞盲腸微生物中瘤胃球菌科梭菌屬(Ruminococcaceae_Clostridium)、Papillibacter、Desulfosporosinus、顫螺旋菌屬、羅氏菌屬(Roseburia)、毛螺菌科梭菌屬(Lachnospiraceae_Clostridium)的相對(duì)豐度與復(fù)合提取物添加量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

X軸為影響因子,Y軸為物種,同時(shí),左邊的色條標(biāo)注了物種所屬門分類。通過(guò)計(jì)算獲得R值(秩相關(guān))和P值。R值在圖中以不同顏色展示,右側(cè)圖例是不同R值的顏色區(qū)間。P值小于0.05表示存在顯著相關(guān),其中0.01≤P<0.05用*標(biāo)注,0.001≤P<0.01用**標(biāo)注。The X-axis represents the influencing factor and the Y-axis represents species. The color bar on the left marks the classification of the phylum to which the species belongs. R value (rank correlation) and P-value were obtained by calculation. Wherein, the R value is displayed in different colors in the graph, and the legend on the right shows the color range of different R values. A P-value less than 0.05 indicates a significant correlation. 0.01≤P<0.05 is marked with *, and 0.001≤P<0.01 is marked with **.ADG:平均日增重 average daily gain;AL:復(fù)合提取物添加量 compound extract supplemental level;Phylum:門;Actinobacteria:放線菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Asteroleplasma:無(wú)甾醇原體屬;Eubacterium:優(yōu)桿菌屬;Olsenella:歐陸森氏菌屬;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌屬;Oscillospira:顫螺旋菌屬;Roseburia:羅氏菌屬;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌屬。圖4 文昌雞盲腸微生物相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of cecal microbiota of Wenchang broilers

3 討 論

3.1 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞生長(zhǎng)性能的影響

目前植物提取物在肉雞上的應(yīng)用效果已初步顯現(xiàn),如山香圓葉、夜交藤、絲蘭、博落回、五味子和連翹等[11-12]。單一使用某些植物提取物對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能存在無(wú)提升或提升不明顯的現(xiàn)象。例如,周璐麗等[13]在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg/kg姜黃提取物飼養(yǎng)文昌雞9周,其平均日增重?zé)o顯著提升;樊祥宇等[14]在飼糧中添加100或200 mg/kg姜黃素顯著降低了29～70日齡中速型黃羽肉雞的平均日采食量,但試驗(yàn)全期平均日增重?zé)o顯著變化。此外,某些植物提取物需要添加過(guò)高劑量才發(fā)揮效果。例如,李婉雁等[15]的研究顯示,在基礎(chǔ)飼糧中添加5 000 mg/kg姜黃粉才能顯著提高試驗(yàn)雞的全期增重和降低料重比;黃飄飄等[10]報(bào)道,在飼糧中添加2%(20 000 mg/kg)的石榴皮粉時(shí)拜城油雞的平均日增重才顯著高于對(duì)照組。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,添加200、400 g/t復(fù)合提取物顯著提高了文昌雞的平均日增重;添加400 g/t復(fù)合提取物顯著提高了文昌雞的平均日采食量;添加200 g/t復(fù)合提取物顯著降低了文昌雞的料重比。這是因?yàn)榻S提取物中的姜黃素具有較好的抗炎活性,能減少胃腸道炎癥來(lái)保護(hù)腸道,有利于腸腔對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16];石榴皮中的鞣花酸的抑菌譜廣[7],能降低胃腸道疾病發(fā)生率[9],促進(jìn)腸道健康,使機(jī)體蛋白質(zhì)沉積加快,促進(jìn)生長(zhǎng)。上述試驗(yàn)結(jié)果也表明姜黃提取物與石榴皮提取物聯(lián)合使用效果良好,中、低添加劑量就能提升文昌雞的生長(zhǎng)性能,比起二者單獨(dú)使用的效果要好,復(fù)合提取物有著使用劑量小、效果優(yōu)的特點(diǎn)。根據(jù)二次曲線分析數(shù)據(jù)可知,以復(fù)合提取物添加量為自變量、平均日采食量為因變量二次回歸分析的調(diào)整后R2較高,二次回歸方程擬合度較好,其呈現(xiàn)出的規(guī)律性較強(qiáng)且P值相對(duì)而言更接近顯著;以平均日增重為因變量時(shí),調(diào)整后R2較低,二次回歸方程擬合度較差,其呈現(xiàn)出的規(guī)律性弱且P值較大;而以料重比為因變量時(shí),調(diào)整后R2為負(fù)數(shù),在此不做討論。因此,本試驗(yàn)以平均日采食量進(jìn)行分析更加科學(xué)、合理,通過(guò)二次回歸方程計(jì)算得出,當(dāng)復(fù)合提取物添加量為481.45 g/t時(shí),文昌雞的平均日采食量最高,生長(zhǎng)性能最好。姜黃提取物與石榴皮提取物聯(lián)合使用可能存在某種正向靶點(diǎn),不僅提高采食量,還使文昌雞擁有良好的腸道環(huán)境和健康水平,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收,最終提高文昌雞的生長(zhǎng)性能。

3.2 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞血清免疫指標(biāo)的影響

免疫球蛋白(Ig)由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,能和抗原特異性結(jié)合,廣泛分布于動(dòng)物血清、組織液,從Ig含量的變化可以看出動(dòng)物的免疫水平[17]。本研究中,添加400 g/t復(fù)合提取物顯著降低了文昌雞血清中IgG含量,而荀文娟等[18]在基礎(chǔ)飼糧添加300或400 mg/kg姜黃素均能顯著提高早期斷奶仔豬血清中IgG含量,Hosseini-Vashan等[19]在飼糧中添加15、30或50 g/kg經(jīng)尿素處理的石榴皮至熱應(yīng)激肉雞42日齡,其血清中IgG含量顯著上升。本結(jié)果與上述學(xué)者試驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因可能是本試驗(yàn)所用復(fù)合提取物含有的功效成分姜黃素與鞣花酸發(fā)揮出與IgG類似的作用,當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)就不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的IgG,而由姜黃素、鞣花酸發(fā)揮作用,這使得機(jī)體用于合成免疫的蛋白質(zhì)減少,用于生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)量增加,有利于雞的增重。本試驗(yàn)中,添加3 200 g/t復(fù)合提取物組血清中IFN-γ含量顯著升高,表明添加高水平的復(fù)合提取物促進(jìn)了機(jī)體IFN-γ的表達(dá),進(jìn)而提高機(jī)體的免疫能力。李云等[20]在研究石榴皮多糖的免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn),石榴皮多糖組中干擾素的含量比模型組顯著增高,且石榴皮多糖濃度越高,改善的效果越明顯,呈劑量效應(yīng)關(guān)系,本試驗(yàn)結(jié)果與此相符。

IL-1β為促炎因子,與細(xì)胞繁殖、分化和凋亡相關(guān)[21]。本試驗(yàn)中,添加3 200 g/t復(fù)合提取物顯著降低了文昌雞血清中IL-1β含量,但添加400 g/t復(fù)合提取物顯著增加了文昌雞血清中IL-1β含量,這可能與該組雞平均日采食量、平均日增重較高有關(guān),當(dāng)機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度快時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更多的IL-1β。IL-6有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、造血功能等功能[22]。在本研究中,添加100、400、3 200 g/t復(fù)合提取物均顯著降低了血清中IL-6含量,表明飼糧中復(fù)合提取物的添加使得文昌雞保持在較低的炎癥水平,具有良好免疫應(yīng)答能力。孫慧男等[23]的試驗(yàn)表明,5～30 μmoL/L的姜黃素顯著抑制LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞炎癥產(chǎn)生的IL-6;飼糧中添加300或400 mg/kg姜黃素可顯著降低斷奶仔豬空腸黏膜中IL-1β、IL-6的相對(duì)表達(dá)量[24]。本結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,飼糧添加適量的復(fù)合提取物能降低文昌雞血清中IL-6、IL-1β含量,減少機(jī)體炎癥發(fā)生,促進(jìn)機(jī)體健康,提高生長(zhǎng)性能。其作用機(jī)制為,姜黃素能夠阻斷核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路,抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體聚集,從而中斷IL-1β釋放,達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的效果[25]。

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,在細(xì)菌死亡或快速生長(zhǎng)時(shí)釋放,能誘導(dǎo)畜禽產(chǎn)生炎癥。本試驗(yàn)中,添加100、400、3 200 g/t復(fù)合提取物均顯著降低了文昌雞血清中LPS含量,表明添加復(fù)合提取物能降低文昌雞的炎癥水平,提高其免疫能力。Rajput等[26]給雛雞飼喂含200 mg/kg姜黃素的基礎(chǔ)飼糧,在42 d時(shí)顯著提高LPS誘導(dǎo)的雛雞B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活性,且飼喂含姜黃素飼糧的雛雞表現(xiàn)出更好的免疫反應(yīng);飼糧中添加β-胡蘿卜素、姜黃素、大蒜素能夠顯著上調(diào)蛋白酶激活亞基3(PSME3)、蛋白酶激活亞基4(PSME4)基因的表達(dá),增強(qiáng)雛雞空腸免疫力[27];鞣花酸在體內(nèi)與體外試驗(yàn)中均可調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá),阻斷LPS-Toll樣受體4(TLR4)-NF-κB信號(hào)通路[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加復(fù)合提取物能降低由LPS所致的腸屏結(jié)構(gòu)損傷,減少腸道炎癥的發(fā)生,促進(jìn)文昌雞機(jī)體健康。

3.3 復(fù)合提取物對(duì)文昌雞盲腸微生物的影響

3.3.1 注釋信息統(tǒng)計(jì)分析

腸道是畜禽最大的細(xì)菌庫(kù),隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,我們可以研究實(shí)驗(yàn)室不能培養(yǎng)出的腸道微生物。注釋信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,文昌雞的盲腸微生物優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(48.37%)、厚壁菌門(41.77%)、變形菌門(4.28%)、互養(yǎng)菌門(1.66%)、放線菌門(1.56%)。家禽的腸道微生物是復(fù)雜而多樣的,家禽從出生至第4周盲腸微生物多樣性呈增加趨勢(shì),從第4周到第16周開(kāi)始下降,而4周后厚壁菌門的相對(duì)豐度增加,變形菌門的相對(duì)豐度降低[29],本試驗(yàn)結(jié)束于文昌雞的93日齡,因而從菌門比例上看,厚壁菌門較高而變形菌門較低。

3.3.2 α多樣性分析

α多樣性能反映一個(gè)群落內(nèi)物種的多樣性,在本研究中則反映某個(gè)樣品中物種的復(fù)雜程度。α多樣性通過(guò)α多樣性指數(shù)呈現(xiàn),Chao1、Ace指數(shù)可以評(píng)估一個(gè)樣本中OTU數(shù)目的多少,是反映菌群豐度的指數(shù),其數(shù)值越大,代表OTU數(shù)目越多,某種群數(shù)目越多;Shannon、Simpson指數(shù)是用來(lái)估計(jì)樣品中物種多樣性的指數(shù),二者數(shù)值越大,其物種多樣性越高;Goods_coverage指數(shù)是測(cè)序深度指數(shù),反映的是樣品特征序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋情況,其數(shù)值越大,注釋水平越好,最大值為1。

本試驗(yàn)中,從Goods_coverage指數(shù)可以看出,所有樣本的注釋情況良好,此次測(cè)序結(jié)果能反映出樣本中微生物的真實(shí)情況。各組Chao1、Ace、Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異,而添加3 200 g/t復(fù)合提取物組的Shannon指數(shù)比添加100 g/t復(fù)合提取物組顯著降低,表明過(guò)高劑量的添加復(fù)合提取物會(huì)使文昌雞盲腸微生物的多樣性降低,從Chao1、Ace、Simpson指數(shù)的數(shù)值上看也能推測(cè)出該推論。

3.3.3 菌屬差異分析

擬桿菌門是腸道生態(tài)系統(tǒng)中非常成功的競(jìng)爭(zhēng)者,具有強(qiáng)大的營(yíng)養(yǎng)靈活性和宿主腸道環(huán)境適應(yīng)能力,其組成和代謝活動(dòng)在很大程度上受飼糧調(diào)節(jié),與脂肪和蛋白質(zhì)的攝入量有關(guān)。菌屬差異分析結(jié)果顯示,文昌雞盲腸微生物中擬桿菌門占比最高,可能與文昌雞后期飼糧油脂含量偏高有一定關(guān)系。厚壁門大多屬于有益菌,乳桿菌屬于該門類,高纖維的飼糧可以增加腸道中厚壁菌門的數(shù)量。變形菌門是革蘭氏陰性菌,大多屬于病原菌,如大腸桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等著名的致病菌屬均屬于該門類。放線菌門因在某一發(fā)育階段形成分枝細(xì)絲而得名,該門有益菌和有害菌都包含。

正常菌群與宿主之間、正常菌群之間通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、代謝產(chǎn)物等相互制約,維持著良好的生存平衡,當(dāng)這種平衡被打破,有些正常菌群就會(huì)變成致病菌群,這類菌群稱為條件致病菌。本研究中,我們統(tǒng)計(jì)了5種有益菌屬(雙歧桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、顫螺旋菌屬)和4種條件致病菌屬(鏈球菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、腸球菌屬)的相對(duì)豐度,分析其組間差異,以尋找腸道有益菌群、條件致病菌群與復(fù)合提取物添加量的關(guān)系。由試驗(yàn)結(jié)果可知,4種條件致病菌的相對(duì)豐度在各組間均無(wú)顯著差異,表明試驗(yàn)期間飼糧添加復(fù)合提取物并不會(huì)給肉雞盲腸中條件致病菌創(chuàng)造有利條件而產(chǎn)生腸道危害,利于肉雞腸道微生態(tài)和諧。對(duì)于有益菌而言,優(yōu)桿菌屬的許多菌種可產(chǎn)生的短鏈脂肪酸、保護(hù)腸道黏膜屏障、降低炎癥水平和增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)機(jī)能,對(duì)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝和維持腸道平衡有重要的作用。添加400 g/t復(fù)合提取物組優(yōu)桿菌屬的相對(duì)豐度比添加100 g/t復(fù)合提取物組顯著增高,雖與較對(duì)照組相比無(wú)顯著差異,但有增加的趨勢(shì)。顫螺菌屬可以產(chǎn)生丁酸鹽等,被稱為下一代益生菌的候選者,有研究發(fā)現(xiàn)它與體質(zhì)變瘦呈正相關(guān),顫螺菌可能具有減肥、降脂、緩解代謝綜合征等作用。本試驗(yàn)中,添加400、3 200 g/t復(fù)合提取物組顫螺旋菌屬的相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著降低,顫螺旋菌屬數(shù)量減少,有利于試驗(yàn)雞增重的提升。乳桿菌屬能與腸道黏膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合形成“占位性”保護(hù),并且通過(guò)增加頂端緊密連接的細(xì)胞間完整性來(lái)維持腸道滲透性;在與腸道上皮細(xì)胞的聯(lián)合作用下,乳桿菌會(huì)刺激腸上皮杯狀細(xì)胞,使杯狀細(xì)胞產(chǎn)生大量黏液,阻止致病菌侵入腸上皮[30]。添加100 g/t復(fù)合提取物組乳桿菌屬的相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著增高,添加400、3 200 g/t復(fù)合提取物組與對(duì)照組無(wú)顯著差異,但有提高的趨勢(shì),這表明飼糧添加適量的復(fù)合提取物能夠提高文昌雞腸道微生物中乳桿菌屬的相對(duì)豐度,改善腸道健康,提高免疫能力,促進(jìn)其健康生長(zhǎng)。

目前,有關(guān)研究已表明肉雞腸道微生物的組成與宿主生長(zhǎng)和健康密切相關(guān),腸道菌群的競(jìng)爭(zhēng)和自我調(diào)節(jié)影響著肉雞腸道穩(wěn)態(tài)與體重變化,微生物可能通過(guò)自身的碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝影響肉雞的免疫水平和能量代謝水平,進(jìn)而影響體重。

在本試驗(yàn)中,基于屬水平相對(duì)豐度表,對(duì)文昌雞盲腸微生物部分菌屬的相對(duì)豐度與復(fù)合提取物添加量、文昌雞的平均日增重的相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬這3個(gè)菌屬的相對(duì)豐度與文昌雞的平均日增重顯著正相關(guān),推測(cè)飼糧中添加復(fù)合提取物能夠提高文昌雞盲腸微生物中這3個(gè)菌屬的相對(duì)豐度,這3個(gè)菌屬通過(guò)菌群互作或產(chǎn)生有益于宿主的物質(zhì)對(duì)文昌雞腸道健康、營(yíng)養(yǎng)吸收產(chǎn)生有利影響,從而提高平均日增重,促進(jìn)文昌雞的生長(zhǎng)。隨著復(fù)合提取物添加量的提升,文昌雞盲腸微生物中瘤胃球菌科梭菌屬、Papillibacter、Desulfosporosinus、顫螺旋菌屬、羅氏菌屬、毛螺菌科梭菌屬的相對(duì)豐度降低,推測(cè)高劑量添加復(fù)合提取物會(huì)使文昌雞盲腸微生物豐富度降低,這與復(fù)合提取物中功效成分姜黃素、鞣花酸的抑菌生物活性有關(guān),另一種可能是姜黃素、鞣花酸對(duì)這些菌屬存在“特異性”抑制,使得其相對(duì)豐度降低。

4 結(jié) 論

飼糧中添加400 g/t的復(fù)合提取物能改善文昌雞腸道微生態(tài),增強(qiáng)機(jī)體免疫能力,使文昌雞的平均日采食量得到改善,進(jìn)而提高平均日增重,最終提高生長(zhǎng)性能;通過(guò)二次回歸方程得出,當(dāng)復(fù)合提取物添加量為481.45 g/t時(shí),文昌雞的平均日采食量最高。此外,文昌雞盲腸微生物中Asteroleplasma、優(yōu)桿菌屬、歐陸森氏菌屬的相對(duì)豐度與平均日增重呈顯著正相關(guān),過(guò)高添加量的復(fù)合提取物會(huì)降低文昌雞盲腸微生物的豐富度。