體外產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)植物提取物對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞樣微生物發(fā)酵特性及甲烷生成的影響

王珊珊 狄寒秋 鐘一帆 陳 斌 施 憲 汪海峰*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,杭州 310058;2.浙江華統(tǒng)肉制品股份有限公司,義烏 322005)

全球變暖已成為世界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。正如聯(lián)合國(guó)政府間氣候變化專(zhuān)門(mén)委員會(huì)(IPCC)第6次評(píng)估報(bào)告所述,全球溫室氣體排放量持續(xù)上升,甲烷(CH4)作為第二大溫室氣體,誘導(dǎo)溫室效應(yīng)能力遠(yuǎn)高于二氧化碳(CO2),目前CH4排放的增長(zhǎng)速度為自20世紀(jì)80年代以來(lái)的最高值[1]。2021年《全球甲烷評(píng)估》報(bào)告指出,畜禽糞便和腸道發(fā)酵的CH4排放量約占全球人為排放總量的32%,僅次于能源生產(chǎn)排放的CH4[2]。反芻動(dòng)物被認(rèn)為是畜禽CH4的主要來(lái)源,雖然豬的腸道CH4產(chǎn)量遠(yuǎn)低于反芻動(dòng)物,但由于其全球種群數(shù)量龐大,尤其我國(guó)是世界主要生豬養(yǎng)殖大國(guó),養(yǎng)殖量占世界1/2以上,所產(chǎn)CH4對(duì)環(huán)境的影響不容小覷。飼糧成本占生豬生產(chǎn)總成本最大,其中能量是最昂貴的組成部分,約占飼糧成本的70%[3]?，F(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中,CH4排放產(chǎn)生的能量損失約占豬飼糧總能的0.7%,更有研究表明飼喂高纖維飼糧的成年母豬產(chǎn)生的CH4能量損耗高達(dá)3.36%消化能[4-5]。因此,研究探索如何減少豬生產(chǎn)過(guò)程中的CH4排放有助于提高其飼糧利用率,降低CH4對(duì)全球變暖的負(fù)面影響。

近年來(lái),有許多研究描述了瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的多樣性,以及在體外和體內(nèi)條件下通過(guò)一系列方法進(jìn)行的緩解CH4排放策略,包括改變動(dòng)物管理、調(diào)整飼糧結(jié)構(gòu)、飼喂微生物制劑及添加化學(xué)抑制劑如三氯乙酰胺、水合氯醛、硝基乙烷、3-硝氧基丙醇和氯仿等,這些方法均可以在反芻動(dòng)物中找到廣泛應(yīng)用,這也可能適用于非反芻動(dòng)物的CH4緩解。但由于一些抑制劑具有毒性,殘留于動(dòng)物體內(nèi)不僅容易引起機(jī)體不良副作用,其排泄物還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染和破壞;更有甚者易蓄積在動(dòng)物產(chǎn)品中,進(jìn)而損害人類(lèi)健康[6-8]。研究表明,植物及其提取物可能間接(影響與產(chǎn)甲烷菌相關(guān)的原生動(dòng)物、細(xì)菌和真菌的數(shù)量)和直接影響產(chǎn)甲烷菌群的生長(zhǎng)、發(fā)育、活性和多樣性來(lái)影響產(chǎn)甲烷菌[9]。研究報(bào)道,一些植物提取物如大蒜、牛至和肉桂等多種植物精油已被證明可以降低體外CH4排放,并具有調(diào)節(jié)瘤胃環(huán)境、改善動(dòng)物性能的潛力[10-12]。其中,含有有機(jī)硫化合物蒜氨酸、二烯丙基硫醚和大蒜素(allicin,ALN)的大蒜油則被認(rèn)為是體外抑制產(chǎn)CH4最有效的植物化合物之一[13]。

體外發(fā)酵產(chǎn)氣法是一種通過(guò)在可控環(huán)境下測(cè)量發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氣體量來(lái)評(píng)估發(fā)酵速度進(jìn)而實(shí)現(xiàn)模擬動(dòng)物體內(nèi)消化的試驗(yàn)方法,具有簡(jiǎn)單易行、通用性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)[14]。Menke等[15]研究發(fā)現(xiàn),體外產(chǎn)氣法所測(cè)得的產(chǎn)氣量與體內(nèi)干物質(zhì)的代謝能及降解率呈顯著正相關(guān),且相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.98。Bauer等[16]研究表明,豬糞便微生物與結(jié)腸微生物區(qū)系相似,且糞便采樣相比于腸道內(nèi)容物采樣更便捷,因此使用豬糞便作為微生物接種源能有效模擬豬體內(nèi)結(jié)腸發(fā)酵。到目前為止,大多數(shù)體外研究的目的是評(píng)估植物提取物對(duì)瘤胃CH4產(chǎn)量的影響,而對(duì)豬腸道CH4調(diào)控研究有限。因此,本研究利用體外產(chǎn)氣的方法,研究不同植物提取物對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞樣微生物發(fā)酵特性與CH4產(chǎn)量的影響,比較了不同濃度、不同種類(lèi)的植物提取物對(duì)豬糞樣微生物產(chǎn)CH4的作用差異,旨在為降低豬腸道CH4排放提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物提取物

3種植物提取物牛至油(origanum oil,ORM)、肉桂油(cinnamon oil,CIN)及大蒜素均購(gòu)自上海某生物科技有限公司。參照張然等[17]所用方法添加樣品:分別稱取100、200和400 mg樣品溶于5 mL無(wú)水乙醇中混勻,使得濃度分別為20、40和80 mg/mL,取0.5 mL上述溶液加入到相應(yīng)的產(chǎn)氣瓶中,使樣品最終在50 mL發(fā)酵液中濃度依次達(dá)到200、400和800 mg/L,對(duì)照(CON)組加入0.5 mL無(wú)水乙醇。

1.1.2 飼糧底物

以浙江省某牧場(chǎng)提供的生長(zhǎng)肥育豬飼糧作為底物,飼糧底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼糧在試驗(yàn)前粉碎并過(guò)1 mm篩,按照1%質(zhì)量濃度稱取0.5 g到產(chǎn)氣瓶中。

表1 飼糧底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the dietary substrate (DM basis) %

1.1.3 接種糞樣采集與處理

隨機(jī)選擇浙江省某牧場(chǎng)5頭日齡、體型相近的平均體重為(55.0±5.0) kg的商品豬,采用直腸刺激法收集新鮮糞樣并立即置于充滿CO2的自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。從5份鮮糞樣中稱取等重量糞樣,在厭氧環(huán)境下混合,并在接種前用39 ℃無(wú)菌生理鹽水按照50%質(zhì)量濃度對(duì)糞樣進(jìn)行稀釋,并用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾得到含糞樣微生物的濾液(以下簡(jiǎn)稱為糞液)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3×3雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),在底物中分別添加不同濃度的植物提取物,使發(fā)酵液中3種植物提取物(牛至油、肉桂油和大蒜素)的濃度分別為200、400和800 mg/L,另設(shè)不添加任何植物提取物的空白對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)7個(gè)重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

參照Theodorou等[18]提出的配方制備培養(yǎng)液,按表2比例和順序混合制備,同時(shí)不斷通入CO2使培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色后按45 mL/瓶迅速分裝至產(chǎn)氣瓶中,并用CO2飽和后密封。

表2 體外發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table 2 Components of medium used for in vitro fermentation

1.2.3 體外發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)參照Menke等[19]提出的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行,將糞液按5 mL/瓶接種于上述含底物、處理和培養(yǎng)基的100 mL產(chǎn)氣瓶中,并迅速將產(chǎn)氣瓶置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后冰浴終止發(fā)酵(在正式培養(yǎng)前將產(chǎn)氣瓶中所產(chǎn)氣體排空,不計(jì)入發(fā)酵產(chǎn)氣量)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)

用壓力傳感器記錄發(fā)酵0、2、6、12、24、48 h的壓力值并用集氣袋收集產(chǎn)氣瓶?jī)?nèi)全部氣體,產(chǎn)氣量由以下公式計(jì)算:

GPt=Pt(V0-50)/(101.3W)。

式中:GPt為t時(shí)的產(chǎn)氣量(mL/g DM);Pt為t時(shí)測(cè)得的壓力值(MPa);V0為產(chǎn)氣瓶體積(mL);W為飼糧底物干物質(zhì)重量(g)。

累積產(chǎn)氣量由各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量相加得到。

利用Origin 2021將各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入Gompertz模型[20]公式對(duì)產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合,公式為:

1.3.2 CH4產(chǎn)量

使用氣密進(jìn)樣針(SGE-008770,Trajan,澳大利亞)從集氣袋中抽取5 mL的氣體注入氣相色譜儀(GC-2010 Plus,島津株式會(huì)社,日本)測(cè)定CH4濃度(色譜柱:毛細(xì)管柱,30 m×0.25 mm×0.25 μm,HP-INNOWAX,19091N-133)。參數(shù)設(shè)定如下:柱溫80 ℃,汽化室100 ℃,檢測(cè)室120 ℃,載氣為高純氮?dú)?N2),壓力179.5 kPa,總流量46.2 mL/min,柱流量2.7 mL/min,分流比15,吹掃流量3 mL/min,循環(huán)流量30 mL/min,氫氣(H2)流量40 mL/min,空氣流量400 mL/min。CH4產(chǎn)量是用生成的氣體總量乘以其在被分析樣品中相應(yīng)的CH4濃度來(lái)計(jì)算的,累積CH4產(chǎn)量由各時(shí)間點(diǎn)CH4產(chǎn)量相加得到。

1.3.3 短鏈脂肪酸(SCFA)

發(fā)酵結(jié)束后抽取1 mL發(fā)酵液,加入250 μL偏磷酸,4 ℃孵育10 min,15 000×g離心10 min,取上清液通過(guò)0.22 μm濾膜后用氣相色譜儀(GC-2010,島津株式會(huì)社,日本)測(cè)定SCFA濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2016進(jìn)行計(jì)算整理后,采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差(one-way AVOVA)分析,利用SAS 9.4進(jìn)行雙因素方差分析,并使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量的變化

不同處理的體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量變化曲線如圖1所示。由圖1-A可知,與對(duì)照組相比,從發(fā)酵12 h開(kāi)始,200 mg/L牛至油組累積產(chǎn)氣量顯著降低(P<0.05);從發(fā)酵24 h開(kāi)始,各200 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著降低(P<0.05),其中200 mg/L大蒜素組下降幅度最大。由圖1-B可知,從發(fā)酵12 h開(kāi)始,各400 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油組下降幅度最大。由圖1-C可知,從發(fā)酵6 h開(kāi)始,各800 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),下降幅度由大到小依次為牛至油組>肉桂油組>大蒜素組。

與對(duì)照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量變化百分比如圖2所示。各濃度植物提取物組48 h累積產(chǎn)氣量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中200 mg/L肉桂油組下降幅度最小,800 mg/L牛至油組下降幅度最大;此外,在200和800 mg/L濃度時(shí),各植物提取物組之間48 h累積產(chǎn)氣量變化百分比差異顯著(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)記*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),數(shù)據(jù)柱之間標(biāo)記*表示差異顯著(P<0.05)。圖4和圖5同。* marked on value columns mean significant difference compared with CON group (P<0.05), and * marked between value columns mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.4 and Fig.5.圖2 不同濃度的3種植物提取物對(duì)體外發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量變化的影響Fig.2 Effects of different concentrations of three plant extracts on cumulative gas production changes at 48 h in in vitro fermentation

2.2 體外發(fā)酵產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

與對(duì)照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異百分比見(jiàn)表3。各植物提取物組的理論最大產(chǎn)氣量均有不同程度的降低,其中200 mg/L大蒜素組、400 mg/L牛至油組、800 mg/L牛至油組和800 mg/L肉桂油組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且上述4組之間差異顯著(P<0.05),800 mg/L牛至油組理論最大產(chǎn)氣量最低。除800 mg/L牛至油組產(chǎn)氣速率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)外,其他植物提取物組產(chǎn)氣速率均有不同程度的降低,其中800 mg/L肉桂油組最低。各200 mg/L植物提取物組產(chǎn)氣延滯時(shí)間與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),400 mg/L肉桂油組400 mg/L大蒜素組產(chǎn)氣延滯時(shí)間顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而400 mg/L牛至油組和各800 mg/L植物提取物組產(chǎn)氣延滯時(shí)間顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油組產(chǎn)氣延滯時(shí)間最低。植物提取物種類(lèi)與濃度對(duì)產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異百分比均有極顯著影響(P<0.01),且均存在極顯著交互作用(P<0.01)。

表3 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化百分比Table 3 Percentage of gas production kinetics parameter changes of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation %

2.3 體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量的變化

不同處理的體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量變化曲線如圖3所示。由圖3-A可知,與對(duì)照組相比,從發(fā)酵24 h開(kāi)始,200 mg/L牛至油組累積CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05);從發(fā)酵6 h開(kāi)始,200 mg/L大蒜油組累積CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05),且200 mg/L大蒜油抑制CH4生成的效果強(qiáng)于200 mg/L牛至油。由圖3-B可知,從發(fā)酵6 h開(kāi)始,各400 mg/L植物提取物組累積CH4產(chǎn)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油抑制CH4生成的效果最好。由圖3-C可知,當(dāng)處理濃度提高至800 mg/L時(shí),3種植物提取物抑制CH4生成的效果均有所增強(qiáng),且不同植物提取物之間差異顯著(P<0.05),其中800 mg/L牛至油組累積CH4產(chǎn)量最低。

圖3 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量變化曲線Fig.3 Cumulative CH4 production curves of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation

與對(duì)照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵48 h累積CH4產(chǎn)量變化百分比如圖4所示。除200 mg/L牛至油組外,各濃度植物提取物組48 h累積CH4產(chǎn)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且200和800 mg/L濃度不同處理之間差異顯著(P<0.05)。3種植物提取物的累積CH4產(chǎn)量下降幅度均隨著處理濃度的增大而增大,其中800 mg/L牛至油組下降幅度最大,其次是800 mg/L肉桂油組。

與對(duì)照組相比,各濃度植物提取物組不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)所產(chǎn)生的氣體中CH4濃度變化百分比見(jiàn)表4。各400 mg/L植物提取物組從發(fā)酵6 h開(kāi)始CH4濃度開(kāi)始顯著下降(P<0.05),各800mg/L植物提取物組從發(fā)酵2 h開(kāi)始CH4濃度開(kāi)始顯著下降(P<0.05),說(shuō)明各800 mg/L植物提取物對(duì)CH4生成的抑制效果更快。此外,各400和800 mg/L植物提取物組在發(fā)酵至48 h時(shí)CH4濃度下降幅度減小,而200 mg/L大蒜素組CH4濃度下降幅度隨著發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸增大,直至發(fā)酵48 h,其CH4濃度下降幅度達(dá)到最大,顯著低于其他組(P<0.05)。植物提取物種類(lèi)與濃度對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的CH4濃度變化百分比均有極顯著影響(P<0.01),且均存在極顯著的交互作用(P<0.01)。

表4 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵CH4濃度變化百分比Table 4 Percentage of CH4 concentration changes of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation %

2.4 體外發(fā)酵SCFA濃度的變化

與對(duì)照組相比,各濃度植物提取物組發(fā)酵48 h終末產(chǎn)物中SCFA濃度變化百分比如圖5所示。由5-A可知,各200 mg/L植物提取物組乙酸濃度相較于對(duì)照組而言有不同程度的提高,其中200 mg/L大蒜素組乙酸濃度顯著高于其他2組(P<0.05);而各800 mg/L植物提取物組乙酸濃度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且不同植物提取物組之間差異顯著(P<0.05)。由5-B可知,與對(duì)照組相比,200 mg/L肉桂油組、200 mg/L大蒜素組和400 mg/L大蒜素組丙酸濃度顯著提高(P<0.05),其中200 mg/L大蒜素組增幅高達(dá)24.38%,其余植物提取物組丙酸濃度則出現(xiàn)不同程度的降低,且各牛至油組丙酸濃度的下降幅度隨著處理濃度的增大而增大。由5-C可知,與對(duì)照組相比,除800 mg/L牛至油組和800 mg/L肉桂油組丁酸濃度顯著降低(P<0.05)外,200 mg/L牛至油組、400 mg/L肉桂油組及各大蒜素組丁酸濃度均顯著提高(P<0.05)。由5-D可知,與對(duì)照組相比,除200 mg/L牛至油組戊酸濃度顯著提高(P<0.05)外,其余植物提取物組均出現(xiàn)不同程度的降低,且下降幅度均隨著處理濃度的增大而增大。由5-E可知,各200 mg/L植物提取物組總SCFA濃度相較對(duì)照組而言都有不同程度的提高,其中200 mg/L大蒜素組總SCFA濃度上升幅度最大(P<0.05);除200 mg/L肉桂油組外,各植物提取物組總SCFA濃度與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),其中各800 mg/L植物提取物組總SCFA濃度均顯著降低(P<0.05),且不同植物提取物組之間總SCFA濃度差異顯著(P<0.05)。由5-F可知,與對(duì)照組相比,不同濃度的大蒜素組乙酸/丙酸值均有不同程度的降低,但只有400 mg/L大蒜素組表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05);而800 mg/L肉桂油組乙酸/丙酸值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),增幅高達(dá)428.80%。

3 討 論

3.1 不同植物提取物對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

目前體外產(chǎn)氣技術(shù)雖已得到了廣泛應(yīng)用,但由于發(fā)酵過(guò)程中不能將代謝產(chǎn)物及時(shí)移除,體外發(fā)酵只能反映較短時(shí)段內(nèi)的微生物代謝情況?；谏L(zhǎng)豬大腸中26～44 h的飼糧轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間,本試驗(yàn)選擇48 h的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng),以期準(zhǔn)確描述豬糞樣微生物發(fā)酵特性[21]。體外研究表明,產(chǎn)氣量與有機(jī)物的消化率呈正相關(guān)[16]。本試驗(yàn)培養(yǎng)初期發(fā)酵速度較快,可能是由于前期底物能夠提供充足的營(yíng)養(yǎng),后期可能會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被分解消耗導(dǎo)致產(chǎn)氣趨于平穩(wěn),這一趨勢(shì)與楊翠鳳[22]的研究一致。此外,本研究結(jié)果與Cobellis等[23]和Zhou等[24]的報(bào)告一致,即肉桂油和牛至油表現(xiàn)出了對(duì)氣體總產(chǎn)量的顯著抑制作用;而大蒜素的處理結(jié)果與Patra等[11]的研究結(jié)果一致,即低、中和高濃度大蒜油處理后發(fā)現(xiàn)高濃度抑制總產(chǎn)氣量效果最強(qiáng),但遠(yuǎn)不及牛至油。這可能是因?yàn)橹参锾崛∥锏目咕钚耘c其主要化合物的類(lèi)型密切相關(guān),如牛至油中的香芹酚和百里香酚、肉桂油中的肉桂醛等化合物具有較強(qiáng)的活性,能夠有效阻止微生物生長(zhǎng)[25]。體外產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)數(shù)學(xué)模型定量描述微生物發(fā)酵及產(chǎn)物生成的過(guò)程,提供對(duì)預(yù)測(cè)飼糧底物消化有用的信息。本研究中,800 mg/L牛至油的理論最大產(chǎn)氣量達(dá)到最低,筆者推測(cè)是牛至油更強(qiáng)的抑菌作用引發(fā)了更低的氣體產(chǎn)量。Bindelle等[26]報(bào)告表明,更小的發(fā)酵產(chǎn)氣速率和較長(zhǎng)的延滯時(shí)間可能與接種物中活菌濃度的降低以及微生物適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在有關(guān)。這或許也解釋了本試驗(yàn)中產(chǎn)氣速率隨著處理濃度提高而降低的現(xiàn)象,但可能還受其他因素的影響,因此還需在以后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證它們對(duì)體外發(fā)酵氣體生成的影響機(jī)制。

3.2 不同植物提取物對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵液中SCFA濃度的影響

碳水化合物在結(jié)腸被微生物發(fā)酵生成的SCFA可被宿主用于自身的能量供應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌增殖[27]。Varel等[28]研究表明,SCFA可以滿足生長(zhǎng)豬15%和母豬30%的維持能量需求。乙酸、丙酸和丁酸是SCFA的主要成分,占總量的90%～95%[29]。其中,乙酸和丙酸參與宿主的能量代謝,且丙酸已被證明可以抑制主要脂肪生成底物如乙酸的代謝,丁酸則是結(jié)腸黏膜細(xì)胞最重要的能量來(lái)源[30-32]。產(chǎn)甲烷菌可以利用腸道中的H2、CO2、乙酸等碳底物合成CH4,而腸道中H2含量可直接受到SCFA發(fā)酵模式的影響,如生成1 mol乙酸能產(chǎn)生2 mol H2,而生成1 mol丙酸只產(chǎn)生1 mol H2[33]。因此,生產(chǎn)上被認(rèn)可的緩解CH4排放的添加劑應(yīng)該在不損害飼糧降解和SCFA產(chǎn)量的情況下減少CH4的生成。

近年來(lái),一些體外研究探討了植物提取物(如精油、大蒜提取物)通過(guò)增加揮發(fā)性脂肪酸的比例來(lái)提高瘤胃發(fā)酵效率的能力,但也存在與之相反的情況[34-35]。Evans等[36]研究發(fā)現(xiàn),百里香酚在濃度為90 mg/L時(shí)能選擇性抑制反芻單胞菌的生長(zhǎng),但不抑制牛鏈球菌的生長(zhǎng),而當(dāng)濃度提高到400 mg/L時(shí),瘤胃微生物活動(dòng)被全面抑制,說(shuō)明添加過(guò)量的植物提取物有可能使其對(duì)微生物種群的選擇性影響轉(zhuǎn)變?yōu)榉翘禺愋缘囊志饔谩１驹囼?yàn)中,各800 mg/L植物提取物均同時(shí)顯著降低了乙酸、丙酸和總SCFA濃度,這可能是由于過(guò)量的植物提取物導(dǎo)致糞便菌群受到了無(wú)差別損傷。Michiels等[37]研究表明,1 000 mg/L香芹酚和百里香酚顯著抑制了體外模擬豬空腸發(fā)酵中所有細(xì)菌的生長(zhǎng),其中厭氧菌總數(shù)均顯著降低。本試驗(yàn)中,200 mg/L牛至油顯著提高了總SCFA濃度,而400 mg/L則結(jié)果相反,說(shuō)明牛至油可能從某一濃度開(kāi)始對(duì)腸道細(xì)菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。但由于牛至油組成比例不同,且豬腸道細(xì)菌對(duì)其敏感性存在差異,因此抑菌臨界值也會(huì)不同[38]。本試驗(yàn)中,各200 mg/L植物提取物均提高了總SCFA濃度,且大蒜素效果最好。大蒜素組總SCFA濃度顯著提高可能是由于細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)增加,促進(jìn)了有機(jī)物的降解,進(jìn)而增加了SCFA,降低了CH4產(chǎn)量[39];且Cremonesi等[40]發(fā)現(xiàn)在仔豬飼糧中添加大蒜油與牛至油混合物后,SCFA生成菌屬中的瘤胃球菌屬顯著增加,這可能也解釋了本試驗(yàn)出現(xiàn)的結(jié)果。

3.3 不同植物提取物對(duì)生長(zhǎng)肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵產(chǎn)CH4的影響

一些研究結(jié)果表明,CH4產(chǎn)量的降低通常伴隨著飼糧消化和發(fā)酵的降低[11]。某些植物精油或其化合物的抗產(chǎn)CH4活性是非特異性的,如香芹酚和百里香酚通過(guò)破壞細(xì)胞膜、增加細(xì)胞對(duì)ATP的通透性等來(lái)發(fā)揮抗菌作用[41]。本試驗(yàn)中,各800 mg/L植物提取物處理后48 h累積CH4產(chǎn)量降低的同時(shí)累積產(chǎn)氣量和總SCFA濃度都降低,這進(jìn)一步驗(yàn)證了上述說(shuō)法。Macheboeuf等[12]研究發(fā)現(xiàn),添加264 mg/L肉桂醛能在不影響總揮發(fā)性脂肪酸含量的同時(shí)減少體外CH4生成,這與本研究中肉桂醛的處理結(jié)果一致。本研究中,大蒜素表現(xiàn)出了最有趣的結(jié)果,因?yàn)樘砑舆m當(dāng)濃度大蒜素后能在減少CH4產(chǎn)量的同時(shí)顯著提高總SCFA濃度。Soliva等[42]研究發(fā)現(xiàn),300 mg/L大蒜油幾乎完全抑制了體外CH4生成,且未顯著降低有機(jī)物表觀消化率。這一研究與本試驗(yàn)的結(jié)果相似,而減少CH4排放的效果則可能取決于大蒜油的不同品種、濃度等因素。Ruiz等[43]研究表明,添加蒜氨酸和大蒜素分解得到的有機(jī)硫化合物能導(dǎo)致體外發(fā)酵豬糞中總厭氧菌表現(xiàn)出劑量依賴性降低,且大蒜油能通過(guò)抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的活性直接抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)和活性[36]。因此,猜測(cè)本試驗(yàn)中大蒜素可能直接影響了產(chǎn)甲烷菌。當(dāng)CH4產(chǎn)量減少時(shí),H2濃度通常會(huì)增加。同型產(chǎn)乙酸菌能夠利用H2和CO2產(chǎn)生乙酸,這在一些非反芻動(dòng)物消化生態(tài)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵H2的再利用具有重要作用[44]。且李耀宇[45]已報(bào)道,同型產(chǎn)乙酸菌在豬糞厭氧發(fā)酵中能通過(guò)消耗H2降低氫分壓,這或許能夠解釋本試驗(yàn)中200 mg/L大蒜素在降低累積CH4產(chǎn)量的同時(shí)顯著提高了乙酸濃度。氫分壓會(huì)因產(chǎn)CH4被抑制而升高,從而導(dǎo)致丁酸的利用和利用丁酸細(xì)菌的生長(zhǎng)都會(huì)受到抑制[46]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度大蒜素在降低累積CH4產(chǎn)量的同時(shí)顯著提高了丁酸濃度,這也支持了Patra等[47]的研究結(jié)果。本研究中,200、400 mg/L大蒜素均在抑制CH4生成的同時(shí)降低了乙酸/丙酸值,且丙酸濃度顯著提高,而丙酸的生成是H2的有效競(jìng)爭(zhēng)途徑[48],這似乎表明伴隨CH4產(chǎn)量減少而來(lái)的可能是更多的H2轉(zhuǎn)移到了丙酸代謝途徑,這也是大多數(shù)研究中抗產(chǎn)CH4化合物的一個(gè)普遍特征[49]。

因此,綜合評(píng)估來(lái)看,大蒜素抑制CH4的效果最佳,盡管800 mg/L大蒜素對(duì)總SCFA濃度的負(fù)面影響不容忽視,但200和400 mg/L大蒜素能夠在體外抑制CH4產(chǎn)生的同時(shí)促進(jìn)SCFA的生成。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)及《省級(jí)溫室氣體清單編制指南(試行)》[50],我國(guó)生豬腸道發(fā)酵CH4排放因子為1 kg/(頭·年),根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果估測(cè),200和400 mg/L大蒜素分別能夠減少0.573和0.860 kg/(頭·年)的豬CH4排放量,從而減少約4 356.028和6 537.102 kcal/(頭·年)(1 kcal≈4.186 kJ)的能量損耗;按照2022年我國(guó)生豬存欄量估測(cè),200和400 mg/L大蒜素分別能夠減少4.011×1014和6.02×1014g的CH4排放,從而減少約3.048×1015和4.575×1015kcal的能量損耗。同時(shí),筆者推測(cè)適宜濃度大蒜素可能是通過(guò)幾種相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制減少CH4產(chǎn)量:1)直接抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)和活性;2)誘導(dǎo)發(fā)酵模式向丙酸化方向轉(zhuǎn)變,與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)系統(tǒng)中的游離H2;3)促進(jìn)能夠利用H2合成乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng),作為系統(tǒng)中游離H2的另一個(gè)替代匯。

不過(guò),筆者認(rèn)為本研究仍存在以下局限性:1)本試驗(yàn)使用糞便微生物替代遠(yuǎn)端結(jié)腸微生物區(qū)系,且假設(shè)樣品只在結(jié)腸后端被消化,因此這可能無(wú)法準(zhǔn)確反映發(fā)生在結(jié)腸的發(fā)酵過(guò)程;2)糞便微生物在體外的濃度低于體內(nèi),為增加添加劑與糞菌相互作用的可能性,體外研究所使用的濃度可能比體內(nèi)實(shí)際可行濃度大;3)由于本試驗(yàn)缺乏各處理的微生物區(qū)系特征,無(wú)法通過(guò)評(píng)價(jià)各處理間是否存在微生物區(qū)系差異來(lái)進(jìn)一步解釋所評(píng)估的植物提取物的作用機(jī)制。目前關(guān)于豬的CH4緩解策略的信息有限,暫無(wú)任何關(guān)于豬的公開(kāi)數(shù)據(jù)能夠驗(yàn)證本研究結(jié)果。因此,后續(xù)可以考慮通過(guò)參考體外發(fā)酵結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)效益,選擇適宜的濃度和條件進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),并結(jié)合宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)等方法了解植物提取物影響生長(zhǎng)肥育豬結(jié)腸微生物組與CH4生成的途徑,確定其是否有望作為調(diào)節(jié)劑來(lái)改善結(jié)腸發(fā)酵特性和生產(chǎn)力,同樣這也可能會(huì)進(jìn)一步支持本研究目前的推測(cè)。

4 結(jié) 論

① 本研究所用的牛至油、肉桂油及大蒜素3種植物提取物均可作為潛在的生長(zhǎng)肥育豬腸道CH4抑制劑,其中800 mg/L濃度的抑制效果最佳。

② 3種植物提取物在200 mg/L濃度下均能提高體外發(fā)酵乙酸和總SCFA濃度,而在800 mg/L濃度下均顯著降低了乙酸、濃度和總SCFA濃度。

③ 在200 mg/L濃度處理下,3種植物提取物中大蒜素的抑制CH4效果最好,且同時(shí)能夠提高乙酸、丙酸、丁酸和總SCFA濃度。從經(jīng)濟(jì)成本和處理效果評(píng)價(jià),200 mg/L大蒜素的綜合效益最佳。