小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的生物學(xué)特征、影響因素及對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的調(diào)控

馬春來 楊小軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,楊凌 712100)

最初的蛋白質(zhì)營養(yǎng)理論認(rèn)為,動(dòng)物采食的蛋白質(zhì)被消化道中的蛋白酶和肽酶降解為游離氨基酸才能被機(jī)體直接吸收利用。但是,近幾年逐漸發(fā)現(xiàn)不同來源的飼料即使氨基酸組成相同,但機(jī)體對(duì)氨基酸的利用率仍存在差異,因此蛋白質(zhì)的利用并不完全取決于氨基酸。蛋白質(zhì)在動(dòng)物腸腔內(nèi)經(jīng)過胰蛋白酶、糜蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶等多種消化酶的降解后,最終的水解產(chǎn)物除了氨基酸還有大量的二肽與三肽,這些小肽可以被腸黏膜直接吸收進(jìn)入血液被機(jī)體利用,與氨基酸吸收系統(tǒng)相比,小肽吸收系統(tǒng)耗能低且易飽和、吸收速度快是動(dòng)物提高對(duì)飼糧蛋白質(zhì)利用的最佳方式[1]。因此,小肽的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)在蛋白質(zhì)營養(yǎng)中占據(jù)了重要的位置,也成為了動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)消化吸收機(jī)制的研究熱點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn),用化學(xué)、微生物或酶處理方法將動(dòng)物副產(chǎn)品和植物源中的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)先處理后去飼喂幼齡動(dòng)物,這種預(yù)先處理可以提高具有營養(yǎng)或生理調(diào)節(jié)功能的多肽的含量,而多肽在動(dòng)物腸道中水解為小肽后被吸收利用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以提高幼齡動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料利用率,小肽促進(jìn)幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)的原因可能如下[2]:1)在動(dòng)物的消化道中,小肽的吸收系統(tǒng)與氨基酸的吸收系統(tǒng)是獨(dú)立發(fā)揮作用的,而在腸道中小肽的吸收速率是大于等量的游離氨基酸的吸收速率;2)小腸中的細(xì)菌對(duì)小肽的分解速率低于等量的游離氨基酸,從而降低氨基酸在動(dòng)物腸道的損失;3)與特定的氨基酸相比,特定的肽可以通過改善腸道形態(tài)及腸道的功能保護(hù)腸道健康;4)可提供功能性肽,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化力和肌肉蛋白質(zhì)的沉積[3-4]。然而,小肽在動(dòng)物腸道的吸收是通過小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)的,這種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾緩?。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在機(jī)體小肽營養(yǎng)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用,此外其在調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)與腸道炎癥中也扮演重要的角色,因此,肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成為了營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)方面的研究熱點(diǎn)問題。

1 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的生物學(xué)特征

飼料中的蛋白質(zhì)或多肽被動(dòng)物采食后,經(jīng)過消化道酶水解成小肽或游離氨基酸被吸收利用,這一過程需要小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的參與。

1.1 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的種類

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的屬于質(zhì)子依賴型寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(POT)家族的轉(zhuǎn)運(yùn)載體有4種,分別為小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PepT1)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(PepT2)、小肽組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PhT1)、小肽組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(PhT2)。

1.2 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

1.2.1 PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

單胃動(dòng)物主要在小腸吸收小肽,包括3種吸收方式:1)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生在腸細(xì)胞膜上,通過PepT1與氫離子(H+)協(xié)同是二肽和三肽吸收的主要途徑[5](圖1)。小肽分子和H+通過PepT1一同轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),為保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),H+則由細(xì)胞頂膜側(cè)的H+/鈉離子(Na+)交換途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外側(cè)。小肽以易化擴(kuò)散的形式進(jìn)入細(xì)胞后,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH降低,進(jìn)而激活細(xì)胞膜上的H+/Na+交換通道,H+被釋放出細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)的pH又回歸至原水平。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)的主要驅(qū)動(dòng)力來自于質(zhì)子的電化學(xué)梯度形成的能量。由PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的小肽被細(xì)胞內(nèi)肽酶降解為游離氨基酸,再由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至血液中,被機(jī)體吸收。2)依靠H+或鈣離子(Ca2+)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),需要消耗ATP。3)谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),由于GSH在生物膜內(nèi)有抗氧化的功能,所以GSH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)機(jī)體而言具有特殊的生理意義。

Intestinal lumen:腸腔;PepT1:小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 peptide transporter 1;Bacteria:細(xì)菌;di,tripeptides:二/三肽;NOD:模式識(shí)別受體 pattern recognition receptor;RICK:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 serine/threonine protein kinase;NF-κB activation:核因子-κB活化;MAPK activation:絲裂原活化蛋白激酶活化;Hydrolysis:酶解;Amino acid:氨基酸;Amino acid transporters:氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體;NHE3:鈉氫交換因子3 sodium-hydrogen exchange factor 3;fMLP: N-甲酰基-Leu-Met-Phe N-formyl Leu-Met-Phe;MDP: 胞壁酰二肽 muramyl dipeptide;Tri-DAP:促炎三肽 pro-inflammatory tripeptide;Na+:鈉離子 sodion;H+:氫離子 hydrion;K+:鉀離子 potassium;ATP:三磷酸腺苷 adenosine triphosphate。圖1 腸上皮細(xì)胞PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)不同肽的作用模式Fig.1 Action modes of intestinal epithelial PepT1 transport of different peptides[5-7]

動(dòng)物機(jī)體對(duì)肽的吸收機(jī)制與氨基酸吸收機(jī)制完全不同,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)是通過Na+泵或非Na+泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行的,并以Na+泵耗能轉(zhuǎn)運(yùn)方式為主。研究表明,肽與氨基酸的吸收存在2種獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相比,肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有耗能低且不易飽和的特點(diǎn)[5]。

1.2.2 PepT2的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

PepT1和PepT2具有不同的功能和物理化學(xué)性質(zhì),PepT1是一種低親和力高容量轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可以從腸腔中高效的吸收二肽和三肽,而PepT2是二肽和三肽的高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。PepT1和PepT2對(duì)二肽和三肽或結(jié)構(gòu)相關(guān)的底物吸收伴隨著質(zhì)子的易位。PepT2由12個(gè)結(jié)構(gòu)域(TMDs)構(gòu)成,其中TM1～TM6構(gòu)成N端束,TM7～TM12構(gòu)成C端束,N端與C端面向細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞外側(cè)由來自N端的TM1和TM2及C端TM7和TM8來調(diào)節(jié)細(xì)胞外肽靠近結(jié)合位點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)側(cè)由TM4和TM5及TM10和TM11折疊調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肽和質(zhì)子的釋放。哺乳動(dòng)物PepT2的TM2是保守的組氨酸(His),TM1和TM7是天冬氨酸-精氨酸(Asp-Arg)鹽橋,質(zhì)子結(jié)合促進(jìn)了PepT2由向內(nèi)開放的狀態(tài)向外定向,進(jìn)而再重新定向的變化[8]。PepT2轉(zhuǎn)運(yùn)中性或陰離子二肽時(shí)以2∶1的質(zhì)子與底物化學(xué)計(jì)量運(yùn)輸,細(xì)胞外的pH在底物的結(jié)合親和力中起到至關(guān)重要的作用,較低的pH有利于陰離子化合物的結(jié)合,而陽離子化合物的結(jié)合隨著pH的升高而增加,不帶凈電荷的底物是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的首選[8]。

目前對(duì)于PhT1和PhT2的驅(qū)動(dòng)力、傳輸方式、底物特異性沒有系統(tǒng)的分析,然而,觀察到的His轉(zhuǎn)運(yùn)的pH依賴性和所使用的模型肽表明了與PepT1相似的轉(zhuǎn)運(yùn)模式。

1.3 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)組織

1.3.1PepT1的表達(dá)組織

PepT1主要在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的頂端表達(dá)[9]。PepT1在腎近端小管、膽管上皮中也有表達(dá),在胰腺中也有發(fā)現(xiàn)[10-11]。PepT1在組織中的分布也證實(shí)了大量的二肽和三肽在腸腔中被廣泛吸收到腸細(xì)胞中,繼而被機(jī)體利用。在腸腔中PepT1的表達(dá)從小腸的近端到遠(yuǎn)端逐漸增加,但是PepT1功能的發(fā)揮依賴于細(xì)胞膜上的H+/Na+離子泵(圖1),跨質(zhì)膜的pH梯度在腸道近端強(qiáng)于遠(yuǎn)端,故PepT1的功能活性沿著腸道近端到遠(yuǎn)端存在差異,Jappar等[12]評(píng)估了野生型小鼠(WT)和PepT1敲除小鼠小腸和大腸對(duì)二肽(Gly-Sar)的通透性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)十二指腸與空腸對(duì)二肽的通透性能力相當(dāng),顯著高于回腸和結(jié)腸。此外,在絨毛尖端檢測(cè)到更高的PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),而在杯狀細(xì)胞和下隱窩細(xì)胞中檢測(cè)不到[11]。PepT1的這種表達(dá)模式會(huì)使在近端腸腔區(qū)域和腸道絨毛尖端快速吸收食糜中的二肽和三肽。

1.3.2PepT2的表達(dá)組織

PepT2廣泛存在于各種組織中,Zwarycz等[9]研究發(fā)現(xiàn),PepT2在肉雞的腎臟和大腦中的高表達(dá)水平與哺乳動(dòng)物的分布一致。在腎臟中,PepT2主要存在于近端小管的后段,而PepT1存在于近端小管的S1和其他曲段[13]。PepT2也在大腦中廣泛表達(dá),包括大腦皮層、后腦和小腦。有研究證實(shí),脈絡(luò)膜叢是血腦屏障的位置,PepT2在該屏障有所表達(dá)[14]。Takano等[15]研究發(fā)現(xiàn),PepT2在肺臟中也有所表達(dá)。此外,它還在人、豬、牛的乳腺中表達(dá)[16]。Sun等[17]發(fā)現(xiàn),PepT2在人和小鼠的脾臟中表達(dá)。

1.3.3PhT1和PhT2的表達(dá)組織

Bhardwaj等[18]應(yīng)用免疫組化分析顯示,在胃腸道和Caco-1細(xì)胞中觀察到人肽/His轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hPHT15,屬于POT家族,SLC4A2)mRNA的表達(dá),而且在hPHT1-COS-7細(xì)胞中,hPHT1對(duì)His和肌肽的攝取在15 min內(nèi)與時(shí)間呈線性關(guān)系,并且發(fā)現(xiàn)有pH依賴性。在大腦中檢測(cè)到組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PhT1和PhT2,但其功能及重要性尚不清楚。Wang等[19]用體外切片和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)方法研究PhT1對(duì)腦中1-His的轉(zhuǎn)運(yùn)作用,與野生型小鼠相比,PhT1缺陷小鼠切片中1-His的攝取在腦實(shí)質(zhì)中減少50%,而在腦脊液中沒有,這些研究結(jié)果表明,PhT1可能在大腦His轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用,從而對(duì)神經(jīng)肽調(diào)節(jié)和His/組胺穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響。Agu等[20]研究發(fā)現(xiàn),在人鼻上皮細(xì)胞中,PepT1、PepT2、PhT1和PhT2在mRNA水平上均有所表達(dá)。PhT1在眼睛和脾臟中表達(dá)[21],PhT2在肺臟、脾臟和胸腺中表達(dá)[22]。在小鼠和人脾臟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到PepT2、PhT1和PhT2的表達(dá),而未檢測(cè)到PepT1的表達(dá)[17]。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的組織分布見表1。

表1 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族組織分布Table 1 Tissue distribution of small peptide transporters family[9-22]

1.4 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的結(jié)構(gòu)及同源性

PepT1有12個(gè)跨膜螺旋(TM1～12)(圖2)。TM1-6形成N端結(jié)構(gòu)域(NTD),TM7～12形成C端結(jié)構(gòu)域(CTD)。肽結(jié)合位點(diǎn)大約位于膜的中間,由NTD的TM1、2、4和5以及CTD的TM7、8和10的殘基排列[23]。哺乳動(dòng)物的PepT1有1個(gè)由200個(gè)氨基酸殘基組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD),位于第9和第10結(jié)構(gòu)域之間[24]。

PKC:蛋白激酶C protein kinase C;PKA:蛋白激酶A protein kinase A;-NH2:氨基 amidogen;-COOH:羧基 carboxyl。圖2 PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)載體的跨膜結(jié)構(gòu)Fig.2 Transmembrane structure of PepT1 transporter[27]

人的PepT2包含729個(gè)氨基酸,涉及12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TMDS)(圖3),在第9和第10結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)大的細(xì)胞外環(huán)[25]。Terada等[26]研究發(fā)現(xiàn),hPepT2的His57、His121、Tyr56、Tyr64、Tyr167對(duì)其功能及底物結(jié)合至關(guān)重要,PepT1和PepT2有50%的氨基酸同源性,細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的氨基酸相比跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列更加具有多樣性。

essential for transport activity and substrate binding:對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性和底物結(jié)合至關(guān)重要;loop:胞外環(huán);not responsible for substrate binding:對(duì)底物結(jié)合無責(zé)任;extracellular:細(xì)胞外域;membrane TMDs:膜結(jié)構(gòu)域;intracellular:細(xì)胞內(nèi)的;-NH2:氨基 amidogen;-COOH:羧基 carboxyl。圖3 PepT2的跨膜結(jié)構(gòu)Fig.3 Transmembrane structure of PepT2[8]

哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PhT1在大鼠組織中被鑒定出來,并在大鼠大腦cDNA文庫中被克隆出來。大鼠PhT1的cDNA全長(zhǎng)2 751 bp,編碼572個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為64.9 ku[21]。PhT2和PhT1具有47%的同源性,PhT2最初是在免疫細(xì)胞中克隆出來的,據(jù)報(bào)道是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中起溶酶體His轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用[7]。

1.5 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的底物

圖4 PepT1與底物識(shí)別的二維特征及其底物模塊Fig.4 Two-dimensional features of PepT1 recognition with substrates and their substrate modules[28]

PepT2具有廣泛的底物特異性,可以吸收大小和電荷不同的二肽和三肽,可以轉(zhuǎn)運(yùn)近400種二肽和8 000種三肽,盡管PepT2可以介導(dǎo)所有三肽和二肽的轉(zhuǎn)運(yùn),但是它們具有顯著不同的親和性,含有L-氨基酸殘基的肽比含有D-氨基酸殘基的肽具有更高的親和力[29]。PepT2還可以轉(zhuǎn)運(yùn)具有藥理活性的擬肽藥物[30]。

目前,尚不清楚PhT1和PhT2是否可以運(yùn)輸與PepT1和PepT2相同譜的二肽和三肽,但是可以將游離His作為底物,除此之外,POT家族還能夠識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)擬肽和類肽藥物。

2 影響小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的因素

2.1 PepT1表達(dá)的調(diào)控

2.1.1 營養(yǎng)因素的調(diào)控

2.1.2 肽酶和信號(hào)因子的調(diào)控

細(xì)胞內(nèi)和全身氨基酸穩(wěn)態(tài)的變化對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)有顯著的影響。胞質(zhì)刷狀緣肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間存在直接或間接的影響,Benner等[34]研究發(fā)現(xiàn),肽酶抑制劑(阿伐他汀、貝司他汀)誘導(dǎo)肽酶活性降低,胞漿中小肽積累,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度降低和PepT1的表達(dá)和功能的下降。Rexhepaj等[35]使用Using Chamber技術(shù)發(fā)現(xiàn)在小鼠小腸組織中加入磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制劑可以下調(diào)由Gly-Gly引起的跨膜電流,從而推斷PI3K可以調(diào)控小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過在瓜蟾卵母細(xì)胞中與酪氨酸激酶[Janus激酶(JAK)2或JAK3]共表達(dá)肽轉(zhuǎn)運(yùn)體PepT1和PepT2,發(fā)現(xiàn)JAK2或JAK3可以正向調(diào)控PepT1和PepT2的功能和表達(dá),這2種激酶都參與JAK/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路[36]。

2.1.3 microRNA和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控

microRNA在哺乳動(dòng)物小腸、大腸的分化、發(fā)育、免疫和屏障功能中發(fā)揮著許多作用[37-38]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn),PepT1的表達(dá)介導(dǎo)microRNA延絨毛軸的差異表達(dá)來調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài),PepT1敲除小鼠的空腸隱絨軸的microRNA顯著減少。Okamura等[39]研究表明,膽汁酸通過過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)的活性調(diào)節(jié)PepT1的表達(dá),在攝食期間釋放的膽汁酸抑制PPARα,導(dǎo)致小鼠小腸中PepT1在夜間低表達(dá),而在白天高表達(dá),從而導(dǎo)致小腸中小肽的表達(dá)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的變化。

2.1.4 跨膜質(zhì)子的調(diào)控

細(xì)胞膜PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能的發(fā)揮嚴(yán)格依賴于跨膜質(zhì)子濃度梯度,細(xì)胞外質(zhì)子濃度梯度為PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)二肽及三肽提供驅(qū)動(dòng)力。PepT1在轉(zhuǎn)運(yùn)小肽時(shí)會(huì)激活腸細(xì)胞膜上的Na+/H+交換蛋白(NHE)1、NHE2、NHE3。有研究表明,在哺乳動(dòng)物腸上皮細(xì)胞中NHE3對(duì)PepT1功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用[40],而PepT2功能的發(fā)揮依賴于腸上皮細(xì)胞上的NHE1、NHE2[41]。

2.1.5 激素的調(diào)控

激素可以調(diào)節(jié)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的功能和表達(dá)。據(jù)報(bào)道,胰島素處理降低了非糖尿病雄性大鼠的腸道PepT1 mRNA的表達(dá),但糖尿病雄性大鼠的腸道PepT1 mRNA表達(dá)被增加,同時(shí)胰島素處理后雌性大鼠和雄性大鼠腸道PepT1 mRNA表達(dá)是不同的,所以胰島素對(duì)PepT1的影響仍需進(jìn)一步探究[42]。

2.1.6 發(fā)育階段和晝夜節(jié)律的調(diào)控

發(fā)育階段和晝夜規(guī)律也是影響PepT1表達(dá)的因素。動(dòng)物在其孵化或出生階段及哺乳動(dòng)物的斷奶期,腸道消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變,腸道中的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物腸道的PepT1在胚胎期時(shí)已經(jīng)有所表達(dá),出生后其表達(dá)水平會(huì)有所上升,但隨著年齡和個(gè)體發(fā)育,PepT1的表達(dá)水平會(huì)逐漸降低[43]。晝夜節(jié)律也參與了PepT1的轉(zhuǎn)錄和功能的調(diào)節(jié),有研究發(fā)現(xiàn),在光周期維持在12 h以上的大鼠中,PepT1的底物Gly-Sar在黑暗環(huán)境下的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)[44]。

2.2 PepT2表達(dá)的調(diào)控

2.2.1 底物因素的調(diào)控

由于PepT2具有廣泛的底物特異性,能夠轉(zhuǎn)運(yùn)400種二肽和8 000種三肽以及一些擬肽類化合物。底物是影響動(dòng)物機(jī)體PepT2表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。PepT2的底物對(duì)PepT2具有調(diào)控作用,且不同底物對(duì)PepT2的活性不同。Wang等[45]研究發(fā)現(xiàn),將Met-Met的細(xì)胞外濃度從20 μg/mL增加到160 μg/mL處理牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)后,PepT2的表達(dá)會(huì)依賴性的增加。

2.2.2 激素的調(diào)控

PepT2的活性受激素,如胰島素、催乳素、表皮生長(zhǎng)因子和甲狀腺激素等的影響。Zhou等[46]研究發(fā)現(xiàn),用不同濃度催乳素、氫化可的松以及胰島素處理增強(qiáng)了BMECs中PepT2的表達(dá)。此外,表皮生長(zhǎng)因子(EGF)處理大鼠近端小管細(xì)胞系SKPT細(xì)胞時(shí)導(dǎo)致PepT2的表達(dá)和運(yùn)輸活性呈現(xiàn)劑量依賴性的下降,EGF是通過降低SKPT細(xì)胞中PepT2的轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性來抑制PepT2的表達(dá)[47]。PepT2位于近端小管的遠(yuǎn)端,它參與原代尿液中的肽的重吸收[8]。S?ndergaard等[48]研究發(fā)現(xiàn),用EGF處理豬腎細(xì)胞系LLC-PK2細(xì)胞增強(qiáng)了PepT2的肽轉(zhuǎn)運(yùn)活性,并導(dǎo)致LLC-PK2細(xì)胞的總蛋白含量、堿性磷酸酶活性和細(xì)胞密度的上調(diào)。Lu等[49]研究表明,雄性大鼠甲狀腺切除后腎臟中PepT2 mRNA表達(dá)上調(diào),而用甲狀腺激素替代品處理后抑制了這種上調(diào)。

2.2.3 生理因素的調(diào)控

PepT2的表達(dá)受到動(dòng)物生理狀態(tài)的調(diào)控,已被證實(shí)發(fā)育階段和年齡會(huì)調(diào)控動(dòng)物機(jī)體PepT2的表達(dá)[8]。Alghamdi等[50]研究發(fā)現(xiàn),PepT2的表達(dá)受到衰老的調(diào)控,在老年大鼠腎臟中的PepT2的表達(dá)相較于青年和中年大鼠均有所增加,大鼠腎臟中PepT2的表達(dá)水平呈年齡依賴性。在肺臟組織中,PepT2在Ⅱ型細(xì)胞中表達(dá),在分化過程中表達(dá)減少,在Ⅰ型樣細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[15]。

2.2.4 疾病因素的調(diào)控

PepT2的表達(dá)也受到病理狀態(tài)的調(diào)控,有研究表明,在哺乳動(dòng)物中,炎癥可以調(diào)控包括PepT2在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Karimian等[51]研究表明,病毒炎癥會(huì)影響大鼠PepT2及其他藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腎臟中的表達(dá)。在人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)下調(diào)了PepT2的mRNA水平,表明炎癥對(duì)前列腺上皮細(xì)胞中PepT2的表達(dá)有影響[52]。

2.2.5 細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控

PI3K/蛋白激酶B(AKt)通路可以改變細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[53]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn),PI3K和AKt的抑制顯著降低了PepT2的表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMECs中的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)受到PI3K/AKt信號(hào)通路的控制。Takano等[54]發(fā)現(xiàn),核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路可在H441細(xì)胞中調(diào)控由PepT2轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)菌多肽引起的先天免疫反應(yīng)。大量的研究證明,PepT2的表達(dá)受到很多蛋白因素的影響,但是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)在多種因素刺激后如何進(jìn)行的,以及哪些轉(zhuǎn)錄因子參與PepT2的調(diào)控尚不清楚。

目前國內(nèi)外對(duì)PhT1和PhT2蛋白調(diào)控因素的研究較少,所以對(duì)其調(diào)控因素尚不清楚。

3 PepT1調(diào)控動(dòng)物腸道穩(wěn)態(tài)和腸道炎癥的研究進(jìn)展

3.1 PepT1在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用

PepT1在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。PepT1調(diào)控的作用機(jī)制如圖5所示,PepT1可轉(zhuǎn)運(yùn)的底物多樣性導(dǎo)致其在動(dòng)物腸道中不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)小肽,也可以轉(zhuǎn)運(yùn)腸道致病菌的產(chǎn)物細(xì)菌寡肽,從而使PepT1通過細(xì)菌-上皮之間的相互作用,調(diào)控腸道炎癥,在調(diào)控機(jī)體腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。Dalmasso等[55]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌肽聚糖分解的促炎三肽(Tri-DAP)可以被PepT1轉(zhuǎn)運(yùn),轉(zhuǎn)運(yùn)后的Tri-DAP會(huì)誘導(dǎo)NF-κB和MAPK的活化,從而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生。細(xì)菌產(chǎn)物胞壁酰二肽(MDP)被證明也是PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)底物,MDP在被PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)后激活細(xì)胞內(nèi)NOD2,從而誘導(dǎo)NF-κB和MAPK的活化[56]。另外,Ayyadurai等[57]研究發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,PepT1敲除小鼠在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中,體重減輕較低,直腸出血較少,且炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平較低。細(xì)菌產(chǎn)物像促炎三肽Tri-DAP和MDP均會(huì)被PepT1轉(zhuǎn)運(yùn),從而調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的分泌,誘導(dǎo)腸道炎癥,從而影響腸道穩(wěn)態(tài)。

Bacteria attach to lipid rafts:細(xì)菌結(jié)合在脂筏;PepT1:小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 proton-dependent oligopeptide transporter 1;Increased PepT1 mRNA and protein expression :增強(qiáng)PepT1的mRNA和蛋白的表達(dá);Low NF-κB pathway activity: 降低NF-κB信號(hào)通路活性;Low MAPK pathway activity: 降低MAPK信號(hào)通路活性;Anti-inflammatory: 抗炎;fMLF:N-甲?；?Met-Leu-Pro N-formyl-Met-Leu-Pro;MDP: 胞壁酰二肽 muramyl dipeptide;Tri-DAP:促炎三肽 pro-inflammatory tripeptide;NF-κB:核因子-κB nuclear factor-κB;MAPK:絲裂原活化蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase; KPV:α-促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)的C端序列Lys-Pro-Val C-terminal sequence of alpha-melanocyte-stimulating hormone (alpha-MSH) Lys-Pro-Val;VPY:膳食大豆三肽Val-Pro-Tyr dietary soy tripeptide Val-Pro-Tyr;High NF-κB pathway activity: 增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路活性;High MAPK pathway activity: 增強(qiáng)MAPK信號(hào)通路活性;Macrophages:巨噬細(xì)胞;Proinflammatory cytokines:促炎細(xì)胞因子;Inflammation:炎癥。圖5 PepT1在腸道穩(wěn)態(tài)中的調(diào)控作用Fig.5 Regulatory role of PepT1 in intestinal homeostasis[5]

另外,腸致病菌會(huì)通過腸道脂筏特異性地附著在腸細(xì)胞上,誘導(dǎo)腸細(xì)胞脂筏中的PepT1的表達(dá),而脂筏中PepT1的高表達(dá)反過來會(huì)抑制腸道致病菌與腸細(xì)胞上脂筏的特異性附著,從而表現(xiàn)出抗炎的作用[7,58]。此外,PepT1也可以轉(zhuǎn)運(yùn)在生物活性寡肽像α-促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)的C端序列Lys-Pro-Val(KPV)和膳食大豆三肽Val-Pro-Tyr(VPY)以及益生菌產(chǎn)物N-甲?；?Met-Leu-Pro(fMLF),在PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)這些生物活性成分后,會(huì)降低與腸道炎癥相關(guān)的NF-κB和MAPK的激活,從而抑制炎癥因子的表達(dá),達(dá)到抗炎的作用,調(diào)控機(jī)體腸道穩(wěn)態(tài)[59-61]。

綜上所述,PepT1在腸道中轉(zhuǎn)運(yùn)底物不同時(shí)發(fā)揮的作用也會(huì)不同,當(dāng)PepT1通過轉(zhuǎn)運(yùn)具有抗炎活性的益生菌產(chǎn)物及寡肽,或者腸致病菌特異性地結(jié)合在腸細(xì)胞中脂筏上時(shí),發(fā)現(xiàn)機(jī)體與腸道炎癥相關(guān)的NF-κB和MAPK的信號(hào)通路被抑制,從而在抗炎中發(fā)揮作用;當(dāng)PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)腸道中細(xì)菌產(chǎn)物(Tri-DAP和MDP)時(shí),發(fā)現(xiàn)NF-κB和MAPK的信號(hào)通路被激活,誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥。PepT1通過轉(zhuǎn)運(yùn)不同底物參與腸道的抗炎過程或者誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生腸道炎癥,從而在調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。

3.2 PepT1在調(diào)控腸道炎癥中的作用

3.2.1 對(duì)反芻動(dòng)物腸道炎癥的調(diào)控作用

當(dāng)機(jī)體處于疾病或在外界條件刺激下腸道中的細(xì)菌大量繁殖或菌群失調(diào)的狀態(tài)下,腸道菌群會(huì)釋放大量的細(xì)菌寡肽產(chǎn)物MDP,PepT1不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)二肽與三肽,同時(shí)可以將細(xì)菌寡肽產(chǎn)物MDP轉(zhuǎn)運(yùn)入腸道細(xì)胞,從而引發(fā)機(jī)體發(fā)生腸道炎癥反應(yīng)(圖5)。MDP是肽聚糖的降解產(chǎn)物,是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種成分[7]。嚴(yán)康[62]的研究表明,高精料瘤胃液能夠顯著上調(diào)原代瘤胃上皮細(xì)胞(BRECs)的PepT1的表達(dá),這可能由于高精料組的大量細(xì)菌分解產(chǎn)生的細(xì)菌小肽的大量積累,導(dǎo)致瘤胃上皮細(xì)胞的PepT1對(duì)其的轉(zhuǎn)運(yùn)增加,細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌小肽產(chǎn)物會(huì)激活炎癥信號(hào)通路,從而引發(fā)炎癥。

3.2.2 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物腸道炎癥的調(diào)控作用

在高等動(dòng)物中,細(xì)菌產(chǎn)物寡肽MDP會(huì)由PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)至腸細(xì)胞中,激活PepT1-NOD2-RICK信號(hào)通路,繼而通過NF-κB和MAPK這2條途徑激活轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)腸細(xì)胞炎癥因子的表達(dá),從而引起腸道炎癥(圖5)。唐建洲[63]采用生物信息技術(shù)對(duì)PepT1與小肽的結(jié)合模式進(jìn)行模擬發(fā)現(xiàn),PepT1與小肽及MDP的結(jié)合是通過氨基酸殘基與之形成氫鍵實(shí)現(xiàn)的,草魚腹腔注射MDP后上調(diào)了腸道PepT1的表達(dá),同時(shí)上調(diào)了各種炎癥因子的mRNA的表達(dá)水平,草魚中這種炎癥反應(yīng)也是通過PepT1-NOD2-RICK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

3.2.3 對(duì)小鼠和人腸道炎癥的調(diào)控作用

雖然PepT1通常在結(jié)腸中的表達(dá)很低,但在結(jié)腸炎和短腸綜合征中,小腸和結(jié)腸中的PepT1的表達(dá)均會(huì)上調(diào),這種上調(diào)可能是由于疾病狀態(tài)下的炎癥因子和激素水平的變化會(huì)調(diào)控PepT1的表達(dá)和功能[64-65]。有研究表明,PepT1在結(jié)腸炎癥中呈現(xiàn)區(qū)域性表達(dá),近端結(jié)腸低表達(dá)或者無表達(dá),而在遠(yuǎn)端結(jié)腸高表達(dá),這種高表達(dá)會(huì)促進(jìn)水和電解質(zhì)的吸收[66]。

POT家族成員的其他成員在機(jī)體發(fā)生炎癥后也會(huì)出現(xiàn)變化,先前的研究發(fā)現(xiàn),IBD患者的SLC15A4(PhT1)的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)[67]。Sun等[52]用TNF-α和IFN-γ處理前列腺癌癥細(xì)胞系PC-3時(shí),PepT2的水平顯著升高。

4 小結(jié)與展望

近些年,對(duì)POT家族成員的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能及其在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用進(jìn)行了初步了解。研究結(jié)果檢測(cè)到PepT1和PepT2在人類和動(dòng)物的許多器官和組織中均有所表達(dá),深入探討PepT1和PepT2的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、影響因素及其調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制,并且發(fā)現(xiàn)其在腸道炎癥中通過調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)通路及與腸道微生物互作,在調(diào)控腸道健康中發(fā)揮著重要的作用,闡明其在小肽營養(yǎng)的深入研究及在生理藥理上有重大意義。

研究發(fā)現(xiàn),PhT1與PhT2在多種組織類型中表達(dá),比如大腦、腸段、眼、脾臟、胸腺,然而對(duì)其結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及影響其轉(zhuǎn)運(yùn)活性的因素方面的研究仍然很少,因此有必要進(jìn)一步對(duì)這2種肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行深入研究,探究其在動(dòng)物和人類疾病與健康中的功能。許多研究已經(jīng)證明,PepT1在腸道炎癥中發(fā)揮作用總伴隨著腸道微生物群的改變,這種改變可能是由于PepT1的缺失或過表達(dá)影響腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的差異,導(dǎo)致微生物群的消化底物發(fā)生改變,從而改變其功能和組成。未來需要更深入地研究PepT1與腸道微生物群的關(guān)系,有助于鑒定宿主與微生物群之間的新的特異性相互作用,更好地理解PepT1調(diào)控腸道穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制。