人臍血間充質(zhì)干細胞激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用

范金金，丁立，張躍亮，陳俊，張貝，李雪清，佟旭，王云甫，艾志兵

目的 探究人臍血間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）調(diào)控磷脂 肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路對腦缺血再灌注損傷大鼠周細胞表達和神經(jīng)功能變化的影響。

方法 取雄性SD大鼠共72只，隨機分組為假手術(shù)組、模型組、干細胞組、干細胞+抑制劑組，每組18只。除假手術(shù)組外，剩余各組均建立腦缺血再灌注模型。造模成功后，模型組尾靜脈注射0.1 mL的磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS），干細胞組尾靜脈注射0.1 mL含有2×106個hUCBMSCs的PBS，干細胞＋抑制劑組尾靜脈注射0.1 mL含2×106個hUCBMSCs的PBS及腹腔注射PI3K/Akt抑制劑LY294002（0.03 mg/100 g），LY294002每天給藥1次，直至處死。術(shù)后1、3、7、14 d測定改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）。術(shù)后7、14 d，采用2，3，5-氯化三苯基四氮 （2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法檢測大鼠腦梗死面積，尼氏染色檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶正常神經(jīng)元細胞數(shù)，免疫組織化學法檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶血小板衍生生長因子受體-β（platelet derived growth factor receptor-β，PDGFRβ）陽性周細胞的數(shù)量，免疫印跡法檢測大腦皮質(zhì)缺血半暗帶PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白p-Akt及Akt的表達。

結(jié)果 術(shù)后7 d，4組各項指標整體差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（55.42±4.75）個 vs.（8.50±1.64）個，P＜0.001]和p-Akt/Akt（1.00±0.00 vs.0.47±0.06，P=0.002）均降低，腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（1.08±0.29）個 vs.（13.67±2.47）個，P＜0.001]增加；與模型組比較，干細胞組大鼠的mNSS評分[（6.33±0.71）分 vs.（4.78±0.98）分，P＜0.001]和腦梗死率（32.66%±1.76% vs.14.60%±0.52%，P＜0.001）均降低，正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（8.50±1.64）個 vs.（23.17±1.77）個，P＜0.001]、腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（13.67±2.47）個 vs.（28.50±3.19）個，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.47±0.06 vs.0.83±0.18，P=0.017）均增加；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組的大鼠mNSS評分[（4.78±0.98）分 vs.（6.11±0.78）分，P=0.002]和腦梗死率（14.60%±0.52% vs.27.85%±0.59%，P＜0.001）均增加，正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（23.17±1.77）個 vs.（11.83±0.88）個，P=0.003]、腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（28.50±3.19）個 vs.（20.33±1.44）個，P=0.007]和p-Akt/Akt（0.83±0.18 vs.0.36±0.11，P=0.003）均降低。術(shù)后14 d，4組各項指標整體差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（57.08±3.79）個 vs.（11.25±5.52）個，P＜0.001]和p-Akt/Akt（1.00±0.00 vs.0.53±0.12，P=0.002）均降低，腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（2.00±0.25）個 vs.（13.42±1.04）個，P＜0.001]增加；與模型組比較，干細胞組大鼠的mNSS評分[（4.89±0.78）分 vs.（2.33±0.87）分，P＜0.001]和腦梗死率（32.58%±1.96% vs.11.78%±1.92%，P＜0.001）均降低，正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（11.25±5.52）個 vs.（31.00±1.89）個，P＜0.001]、腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（13.42±1.04）個 vs.（31.42±3.66）個，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.53±0.12 vs.0.93±0.12，P=0.004）均增加；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組大鼠的mNSS評分[（2.33±0.87）分 vs.（4.44±0.53）分，P＜0.001]和腦梗死率（11.78%±1.92% vs.25.25%±2.76%，P＜0.001）均增加，正常神經(jīng)元細胞數(shù)[（31.00±1.89）個 vs.（13.83±1.04）個，P=0.002]、腦PDGFRβ+周細胞數(shù)量[（31.42±3.66）個 vs.（20.67±1.42）個，P＜0.001]和p-Akt/Akt（0.93±0.12 vs.0.53±0.09，P=0.005）均降低。

結(jié)論 hUCBMSCs可能通過激活PI3K/Akt通路促進周細胞的存活募集，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用，進而促進腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復。

再灌注治療是缺血性卒中（ischemic stroke，IS）臨床治療最有效的方法，但由于其治療時間窗較短，限制了再灌注治療的廣泛應用[1]。因此，新型治療靶點及方法的研究對于IS的治療具有重要的意義。

周細胞直接與內(nèi)皮細胞相接觸，是包裹、支持和控制微血管的壁細胞，位于神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）的中心[2]。周細胞作為血腦屏障（blood brain bar r ier，BBB）的重要組成部分，對于維持BBB的完整性十分重要[3-4]。周細胞募集至新形成的微血管，促進其成熟、穩(wěn)定，被認為是卒中治療的潛在靶點。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于其多向分化潛能已成為治療IS的一個極具吸引力的候選細胞[5]。既往研究表明，MSCs對IS有神經(jīng)保護作用[6-7]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路是介導細胞存活、分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和新陳代謝的重要信號傳導途徑[8]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs可激活PI3K/Akt通路，改善小鼠脊髓的缺血損傷[9]。更重要的是，該通路的激活通過增強內(nèi)皮細胞之間以及內(nèi)皮細胞和周細胞之間的相互作用來促進周細胞向新生內(nèi)皮管的募集，對促進血管生成起著重要作用[10-11]。本研究旨在觀察人臍血間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）通過PI3K/Akt通路對周細胞存活及募集的作用，以及對腦損傷大鼠的神經(jīng)功能的影響，探討干細胞治療IS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2019-0008。所有大鼠均飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學院動物中心實驗室，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度為50%～60%。將72只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、干細胞組、干細胞+抑制劑組，每組18只。

1.1.2 實驗試劑 hUCBMSCs、完全細胞培養(yǎng)基、Akt抗體、p-Akt抗體、血小板衍生生長因子受體-β（platelet derived growth factor receptor-β，PDGFRβ）抗體、β肌動蛋白、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、LY294002（PI3K/Akt抑制劑）、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 人臍血間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與傳代 完全細胞培養(yǎng)基重懸hUCBMSCs，把細胞放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當培養(yǎng)液的顏色變黃時則予以換液，換液間隔為3 d。當細胞達到80%～90%匯合時，按照1∶2進行傳代，并于顯微鏡下觀察細胞生長情況。用臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)，將第3代細胞磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）重懸后用于后續(xù)的大鼠尾靜脈注射。

1.2.2 模型制作與給藥 由頸外動脈插入栓線制備大腦中動脈閉塞模型，缺血90 min后，抽出栓線實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅做血管鈍性分離，其余3組均制作缺血再灌注模型。待實驗大鼠完全蘇醒后，根據(jù)Longa 5分法進行評估，1～3分為造模成功。造模不成功及術(shù)中出血量過多死亡的大鼠共13只，補足脫漏只數(shù)。造模成功后，模型組于尾靜脈注射0.1 mL無菌PBS；干細胞組尾靜脈注射等體積含有2×106個hUCBMSCs的無菌PBS；干細胞＋抑制劑組尾靜脈注射等體積含2×106個hUCBMSCs的PBS及模型制作前30 min腹腔注射LY294002（0.03 mg/100 g），此后每天給藥1次，直至處死。術(shù)后7、14 d，完成改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）測定后，處死大鼠用于后續(xù)的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色、免疫組化和免疫印跡實驗。1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分 術(shù)后1、3、7、14 d，每組隨機選取9只大鼠，對大鼠進行運動、感覺、反射及不正常運動等方面的評估，滿分18分，評分越高說明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.3.2 TTC染色檢測大鼠腦梗死面積 術(shù)后7、14 d，每組隨機選取3只大鼠，將大鼠麻醉后斷頭取腦，置于腦切片膜具中。-20 ℃冰箱中冷凍，沿冠狀面切成7片，2% TTC中避光顯色。梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，正常腦組織呈現(xiàn)鮮紅色。拍照獲取圖像，Image J軟件分析腦梗死面積。公式為：腦梗死率=腦梗死面積/全腦面積×100%。

1.3.3 尼氏染色檢測神經(jīng)元細胞損傷及正常神經(jīng)元數(shù)量 術(shù)后7、14 d，每組隨機選取3只大鼠，麻醉后斷頭取腦，石蠟包埋，切片機做病理切片，片厚3 μm，脫蠟、脫水，尼氏染色。鏡下觀察大腦皮質(zhì)缺血半暗帶神經(jīng)元細胞損傷變化，計數(shù)4個不同視野的正常神經(jīng)元的數(shù)量，取其平均值。

1.3.4 免疫組化染色檢測PDGFRβ+周細胞數(shù) 術(shù)后7、14 d，每組隨機選取3只大鼠，前述步驟同尼氏染色，石蠟切片脫蠟，抗原修復，3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗3次，10%山羊血清孵育30 min，滴加PDGFRβ抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，37 ℃的濕盒中加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG聚合物孵育30 min；PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺顯色，再蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。計數(shù)大腦皮質(zhì)缺血半暗帶4個非重疊區(qū)域的PDGFRβ抗體標記的陽性細胞數(shù)量，并取其平均值。

1.3.5 免疫印跡檢測p-Akt及Akt蛋白表達水平 術(shù)后7、14 d，每組隨機選取3只大鼠，冰上斷頭取腦，取大腦皮質(zhì)缺血半暗帶（根據(jù)Ashwal等[12]方法確定）腦組織提取總蛋白。腦組織稱重，加入裂解液，勻漿機中迅速勻漿。冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min取上清液。BCA法蛋白定量，100 ℃加熱蛋白變性。SDSPAGE凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上、膜封閉2 h。一抗：Akt抗體（1∶1000）、p-Akt抗體（1∶1000）及β肌動蛋白（1∶5000），4 ℃過夜孵育。TBST洗膜，二抗（1∶4000）室溫孵育90 min，增強型化學發(fā)光試劑顯影。使用Image J軟件分析Akt、p-Akt條帶灰度值，β肌動蛋白用作內(nèi)部對照，Akt作為p-Akt的比值對照，將假手術(shù)組標準化為1。

2 結(jié)果

2.1 改良神經(jīng)功能缺損評分比較 各時間點、各組大鼠mNSS評分的整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術(shù)后1、3、7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細胞組及干細胞+抑制劑組的mNSS評分均增加（P＜0.001）。與模型組比較，干細胞組在術(shù)后1 d的mNSS評分差異無統(tǒng)計學意義（P=0.912），術(shù)后3、7、14 d的mNSS評分均降低（P＜0.001）；術(shù)后1、3、7、14 d，與模型組比較，干細胞+抑制劑組的mNSS評分差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.988，P=0.730，P=0.912，P=0.465）。與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組在術(shù)后1 d的mNSS評分差異無統(tǒng)計學意義（P=0.988），術(shù)后3、7、14 d的mNSS評分均增加（P=0.003，P=0.002，P＜0.001）（表1）。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時段神經(jīng)功能缺損評分Table 1 Neurological deficit scores of rats in different periods after operation

2.2 各組大鼠腦梗死率比較 術(shù)后7、14 d，各組大鼠各時間點的腦梗死率的整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細胞組及干細胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均增大（P＜0.001）；與模型組比較，干細胞組大鼠的腦梗死率均減?。≒＜0.001），干細胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均減?。≒=0.001，P=0.008）；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組大鼠的腦梗死率均增大（P＜0.001）（圖1，表2）。

圖1 各組大鼠TTC染色結(jié)果Figure 1 TTC staining results of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate of rats in each group

2.3 各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量比較 術(shù)后7、14 d，各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量的整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細胞組及干細胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均降低（P＜0.001）；與模型組比較，干細胞組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均增加（P＜0.001），干細胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.474，P=0.806）；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組大鼠的正常神經(jīng)元數(shù)量均降低（P=0.003，P=0.002）（圖2，表3）。

圖2 各組大鼠腦組織尼氏染色結(jié)果Figure 2 Results of Nissl staining in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠正常神經(jīng)元數(shù)量比較Table 3 Comparison of the number of normal neurons in each group

2.4 各組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù) 術(shù)后7、14 d，各組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)的整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組、干細胞組及干細胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)均增加（P＜0.001）；與模型組比較，干細胞組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)均增加（P＜0.001），干細胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)均增加（P=0.022，P=0.01）；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)均降低（P=0.007，P＜0.001）（圖3，表4）。

圖3 各組大鼠PDGFRβ+周細胞Figure 3 PDGFRβ+ pericytes of rats in each group

表4 各組大鼠PDGFRβ+周細胞數(shù)結(jié)果比較Table 4 Comparison of the number of PDGFRβ+ pericytes in each group

2.5 大鼠腦組織PI3K/Akt通路蛋白p-Akt、Akt的表達 術(shù)后7、14 d，各組大鼠腦組織p-Akt/Akt蛋白比值的整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。術(shù)后7、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠p-Akt/Akt均降低（P=0.002，P=0.002），干細胞組大鼠p-Akt/Akt差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.326，P=0.820），干細胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt均降低（P＜0.001，P=0.002）；與模型組比較，干細胞組大鼠p-Akt/Akt均增加（P=0.017，P=0.004），干細胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.592，P＞0.999）；與干細胞組比較，干細胞+抑制劑組大鼠p-Akt/Akt均降低（P=0.003，P=0.005）（圖4，表5）。

圖4 各組大鼠腦組織中p-Akt、Akt蛋白表達Figure 4 Expression of p-Akt and Akt protein in brain tissue of rats in each group

表5 各組大鼠p-Akt/Akt結(jié)果比較Table 5 Comparison of p-Akt/Akt results in each group

3 討論

干細胞移植治療IS的作用機制仍在繼續(xù)研究中，目前認為可能的途徑主要為：①替代受損的神經(jīng)細胞和組織；②旁分泌功能作用，包括免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、神經(jīng)保護及神經(jīng)營養(yǎng)功能等[13-14]。研究表明，通過尾靜脈注射MSCs外泌體，可以促進腦缺血大鼠的神經(jīng)血管重建和神經(jīng)功能恢復[15]。在本研究中，尼氏染色、TTC染色及大鼠mNSS評分結(jié)果顯示造模后，大鼠正常神經(jīng)元細胞數(shù)明顯減少，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評分均明顯增加；進行hUCBMSCs注射治療后，大鼠正常神經(jīng)元細胞數(shù)明顯增加，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低；而相比干細胞組，干細胞+抑制劑組大鼠正常神經(jīng)元細胞數(shù)減少，腦梗死率及神經(jīng)功能缺損評分均明顯增加。由此說明，hUCBMSCs可以有效改善缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)細胞損傷，促進神經(jīng)功能的恢復，但這些保護作用均被PI3K/Akt通路抑制劑LY294002所削弱。

PDGFRβ可以作為“活性周細胞”的標志物，其表達在腦缺血后的周細胞中被顯著誘導。既往研究表明，腦缺血損傷后，梗死周圍區(qū)域的周細胞中PDGFRβ表達隨時間的變化而逐漸上調(diào)[16-17]，腦周細胞中PDGFRβ的上調(diào)參與了周細胞向內(nèi)皮管的遷移和募集，有利于BBB的維持和修復，對腦缺血后的神經(jīng)保護發(fā)揮重要作用[18-19]。PI3K/Akt通路與IS密切相關(guān)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達。研究表明，缺血再灌注損傷大鼠模型中，PI3K/Akt通路的激活可減輕腦組織的損傷，促進神經(jīng)功能恢復[20-21]。還有研究表明MSCs可激活PI3K/Akt通路，改善小鼠脊髓的缺血損傷。更重要的是，該通路的激活增強了內(nèi)皮細胞和周細胞之間的相互作用，促進了周細胞向新生內(nèi)皮管的募集和血管生成[10]。既往研究證明，在慢性下肢缺血模型中，抑制PI3K/Akt通路可減少側(cè)支循環(huán)形成[22]，PI3K抑制劑LY294002也會導致周細胞存活率降低[23]。也有研究證實，在大鼠腦出血模型中，激活PI3K/Akt通路可以促進周細胞的存活、增殖和募集，從而增加內(nèi)皮細胞的周細胞覆蓋，促進了神經(jīng)功能的恢復[24]。本研究發(fā)現(xiàn)：相比模型組，干細胞組大鼠腦組織p-Akt/Akt及PDGFRβ+周細胞數(shù)明顯升高；相比干細胞組，干細胞+抑制劑組大鼠腦組織p-Akt/Akt及PDGFRβ+周細胞數(shù)明顯降低。由此可得，hUCBMSCs治療大鼠腦缺血再灌注損傷過程中，可能通過增強Akt磷酸化，增加大鼠腦PDGFRβ+周細胞的存活及募集，減輕了神經(jīng)元細胞的損傷和腦梗死面積，進而促進了神經(jīng)功能的恢復。然而，這些保護作用被PI3K/Akt抑制劑LY294002所削弱，進一步說明hUCBMSCs通過激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮上述神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究通過建立腦缺血再灌注損傷模型，給予hUCBMSCs治療處理，減輕了神經(jīng)元細胞的損傷和腦梗死面積，進而促進了神經(jīng)功能的恢復，發(fā)揮腦保護作用。上述保護機制可能與激活PI3K/Akt信號通路從而促進周細胞的存活及募集有關(guān)。但本研究存在一定的不足，考慮到實驗周期較長以及參照既往研究的實驗設計，故并沒有單獨設立抑制劑組，這是后續(xù)研究需要關(guān)注的問題，本課題組在后續(xù)的研究中會進一步完善實驗設計。另一方面，hUCBMSCs對腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用是否還有其他通路參與及其具體分子作用機制如何仍有待進一步研究，這也是本研究的局限性之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。