敏旱和抗旱狗牙根葉片對(duì)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)差異分析

李 碩, 李培英,2,3*, 孫宗玖,2,3, 李 雯

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830052; 2. 新疆草地資源與生態(tài)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830052; 3. 西部干旱區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 烏魯木齊 830052)

干旱脅迫因?yàn)橛邢薜乃止┙o,會(huì)顯著降低植物葉片的含水量,并導(dǎo)致其組織脫水;為了適應(yīng)環(huán)境,植物不僅會(huì)在生理生化水平上發(fā)生響應(yīng),在分子和細(xì)胞水平上也會(huì)產(chǎn)生一定變化[1]。植物的抗旱過程是由多基因控制共同協(xié)調(diào),目前在模式植物和一年生作物上,抗性適應(yīng)機(jī)制研究已大量開展,并取得了顯著進(jìn)展[2]。袁岐[3]、胡靖康[4]和高瑩梅等[5]對(duì)番茄(Solanumlycopersicum)GATA,ZF-HD和BES1轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組挖掘發(fā)現(xiàn)了SL-ZH8,SL-ZH10等15個(gè)抗旱基因,且SlGATA17基因的下調(diào)表達(dá),SLB3和SLB9基因沉默均可降低番茄的抗旱能力。朱虹[6]將來自甘薯(Dioscoreaesculenta)的IbWRKY2,IbGATA24,IbSDT基因轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthaliana),發(fā)現(xiàn)均能提高擬南芥的抗旱性。相對(duì)而言,草坪草大多為異花授粉植物,倍性高,基因組信息不清楚,限制了其抗旱分子機(jī)制的揭示和優(yōu)良抗旱基因的挖掘。

Illumina二代測(cè)序技術(shù)不需知道對(duì)應(yīng)物種的全基因組序列,適合研究全基因組庫未構(gòu)建的物種[7]。測(cè)序通量大,成本較為低廉,被廣泛應(yīng)用于研究植物具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值性狀的關(guān)鍵基因,挖掘基因組層面的選擇信號(hào),馴化野生種質(zhì)等方面[8-10]。目前,已在結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[11],黑麥草(Loliumperenne)[12]和草地早熟禾(Poapratensis)[13]等草坪草研究中應(yīng)用。

狗牙根(Cynodondactylon(Linn.) Pers)因其繁殖速度快,成坪時(shí)間短,耐踐踏,在生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用[14]。狗牙根對(duì)干旱具有很強(qiáng)的抗性,不同品種、不同生態(tài)型間抗旱性上存在顯著差異[15]。Shi[16]和Lu等人等人[17]通過研究發(fā)現(xiàn),水分再分配、滲透物質(zhì)積累和抗氧化防御系統(tǒng)的變化可能是狗牙根種質(zhì)間抗旱性差異的原因之一。在分子方面,Zhou等人[18]通過轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建Tifway和C299的cDNA文庫,共鑒定出277個(gè)干旱響應(yīng)基因,認(rèn)為脅迫信號(hào)、角質(zhì)層蠟積累、抗氧化防御和脫水保護(hù)蛋白積累等基因的表達(dá)對(duì)暖季多年生草適應(yīng)長期干旱脅迫至關(guān)重要。CdDHN4的啟動(dòng)子可以通過脫落酸(Abscisic acid,ABA)施用、干旱或冷處理來調(diào)節(jié);且CdDHN4對(duì)ABA敏感,在干旱脅迫誘導(dǎo)下,CdDHN4啟動(dòng)子被激活,通過ABA依賴性信號(hào)阻止氣孔開放,從而提高植株抗旱性[19]。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn),在水稻中過度表達(dá)狗牙根脅迫響應(yīng)核因子Y基因(Cdt-NF-YC1)可使其對(duì)干旱和鹽的耐受性增加。新疆氣候干旱,降雨量少,但狗牙根資源廣泛分布,且已有研究發(fā)現(xiàn)不同生境狗牙根種質(zhì)間抗旱性存在顯著差異[21-22],是研究狗牙根抗旱性的優(yōu)良種質(zhì),其抗旱分子機(jī)制有待研究。

本研究使用Illumina二代測(cè)序技術(shù),以前期篩選獲得的抗旱和敏旱狗牙根為材料,對(duì)其正常水分(土壤相對(duì)含水量為田間持水量的80%～90%),中度干旱(50%～60%)及重度干旱(20%～30%)下的葉片的mRNA進(jìn)行測(cè)序,分別對(duì)得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO,KEGG分析和注釋,探究其關(guān)鍵代謝通路中的差異表達(dá)基因和高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,為狗牙根抗旱相關(guān)基因的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

以抗旱C138和敏旱C32狗牙根為材料[20],選擇高40 cm,直徑10 cm的PVC管作為容器,裝入5.8 kg的混合花土,每管移栽5 cm長的根莖5根,每份種質(zhì)移栽12管,適應(yīng)生長30 d,當(dāng)覆蓋度達(dá)到95%以上時(shí)開始進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)。

以土壤相對(duì)含水量為標(biāo)準(zhǔn),設(shè)置3個(gè)干旱梯度,正常灌溉土壤相對(duì)含水量80%～90%為正常灌溉,土壤相對(duì)含水量50%～60%為中度干旱脅迫,土壤相對(duì)含水量20%～30%為重度干旱脅迫,每個(gè)處理水平4次重復(fù)。對(duì)每管進(jìn)行充分灌溉使其土壤含水量達(dá)到飽和,其后自然蒸發(fā),每天測(cè)量土壤相對(duì)含水量,當(dāng)各處理土壤含水量達(dá)到設(shè)定范圍時(shí),每天稱重補(bǔ)水,維持10 d后對(duì)葉片進(jìn)行取樣,液氮速凍后保存于實(shí)驗(yàn)室—80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 文庫的構(gòu)建及庫檢

由北京百邁克生物科技有限公司對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品(狗牙根C138和C32葉片)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 差異基因的篩選

將材料中各自對(duì)應(yīng)的中度和重度處理分別與對(duì)照兩兩比對(duì),應(yīng)用每千個(gè)堿基每百萬映射讀取的fragments數(shù)(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments,FPKM)方法分析基因表達(dá)水平,以差異倍數(shù)(Fold change,FC)≥4且Pvalue≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)之后得到的DEGs在百邁克云平臺(tái)上進(jìn)行GO和KEGG功能注釋統(tǒng)計(jì),選取Top20富集分析term進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑選6個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,如表1所示,使用上海生物工程有限公司平臺(tái)設(shè)計(jì)引物,3次技術(shù)重復(fù),內(nèi)參基因Actin,擴(kuò)增體系為95℃ 30s;95℃ 10s;60℃ 30s;95℃ 15s;95℃ 1min;60℃ 15s;45個(gè)循環(huán)。

表1 PCR驗(yàn)證引物Table 1 PCR validation primer

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)與評(píng)估

測(cè)序后得到18個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,去除原始數(shù)據(jù)中含有接頭,N的比例大于10%、質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條數(shù)據(jù)的50%以上的低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到過濾后數(shù)據(jù),經(jīng)過濾后共獲得256.12 Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)。由表2可知,各組Q20堿基百分比在98.23%及以上,Q30堿基百分比在94.68%及以上,說明測(cè)序建庫工作質(zhì)量良好。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控Table 2 Summary of the RNA-Seq results

2.2 基因差異性表達(dá)分析

對(duì)于抗旱狗牙根C138而言,與對(duì)照組(土壤相對(duì)含水量90%～100%)相比,干旱下共獲得差異表達(dá)基因1 193個(gè),其中上調(diào)525個(gè),下調(diào)668個(gè);中度脅迫時(shí)差異表達(dá)基因數(shù)量為711個(gè),其中上調(diào)基因227個(gè),下調(diào)基因484個(gè);重度脅迫時(shí)為482個(gè),其中上調(diào)基因298個(gè),下調(diào)基因184個(gè)。

與對(duì)照相比,C32干旱下共有2 031個(gè)差異基因表達(dá),其中上調(diào)1 086個(gè),下調(diào)927個(gè)。中度脅迫時(shí)有810個(gè)差異基因表達(dá),其中上調(diào)基因有436個(gè),下調(diào)基因有374個(gè);重度脅迫時(shí)有1 203個(gè)差異基因表達(dá),其中上調(diào)基因有650個(gè),下調(diào)基因有553個(gè)。

中度脅迫下,兩個(gè)材料共有79個(gè)共表達(dá)基因,其中有20基因共表達(dá)為下調(diào),37個(gè)基因共表達(dá)為上調(diào),22個(gè)基因表達(dá)無變化;C138特異響應(yīng)基因632個(gè),C32特異響應(yīng)基因731個(gè)。重度脅迫下兩材料共有101個(gè)共表達(dá)基因,其中有38基因共表達(dá)為下調(diào),46個(gè)基因共表達(dá)為上調(diào),17個(gè)基因表達(dá)無變化,C138特異響應(yīng)基因381個(gè),C32特異響應(yīng)基因1 102個(gè)。與中度脅迫相比,重度脅迫下材料的上調(diào)基因均增加,但C138下調(diào)基因減少,C32下調(diào)基因增加;各干旱脅迫下特異性表達(dá)基因均大于共表達(dá)基因,說明了不同材料響應(yīng)干旱的特異性,結(jié)果如圖1所示。

2.3 差異表達(dá)基因的GO分析

將篩選閾值定為Pvalue≤0.01,對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋分析,這些DEGs被富集注釋到3個(gè)GO分類,分別是生物過程(Biological process),分子功能(Molecular function)和細(xì)胞組分(Cellular component)。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行TOP20 GO富集分析得到圖2。與對(duì)照相比,C138在中度干旱時(shí),有121個(gè)(50.00%)DEGs注釋到分子功能,其中富集極顯著的為葉綠素合成(chlorophyll binding),鐵離子合成(iron ion binding)和轉(zhuǎn)錄因子活性(DNA-binding transcription factor activity);84個(gè)(34.71%)DEGs注釋到生物過程,其中富集極顯著的為光合作用(photosynthesis,light harvesting),蛋白質(zhì)-發(fā)光團(tuán)連鎖(protein-chromophore linkage)和次級(jí)代謝過程調(diào)控(regulation of secondary metabolic process);37個(gè)(15.28%)DEGs注釋到細(xì)胞組分中的3條極顯著通路,即葉綠體類囊體(chloroplast thylakoid membrane),光合系統(tǒng)I(photosystem I)和光系統(tǒng)II(photosystem II);重度干旱時(shí)有54個(gè)(55.10%)DEGs注釋到分子功能,其中富集極顯著的為水解酶活性與O-糖基化合物的水解(hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds),萜烯合成活性(terpene synthase activity)和硫醇酯水解酶活性(thiolester hydrolase activity);有13個(gè)(13.28%)DEGs注釋到細(xì)胞組分,只富集到胞外區(qū)(extracellular region)和錨定質(zhì)膜組分(anchored component of plasma membrane);有45個(gè)(45.92%)DEGs注釋到生物過程,其中富集極顯著的為次級(jí)代謝過程(regulation of secondary metabolic process),線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)(mitochondrial calcium ion homeostasis)和碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)。

圖2 各材料及處理間差異基因Top 20 GO term富集圖Fig.2 Enrichment map of Top 20 GO term of differential genes between two different materials and treatments注:A為CL138 vs ML138;B為CL138 vs SL138;C為CL32 vs ML32;D為CL32 vs SL32;E為ML138 vs ML32;F為SL138 vs SL32Note:Panel A, CL138 vs ML138;Panel B, CL138 vs SL138;Panel C, CL32 vs ML32;Panel D, CL32 vs SL32;Panel E, ML138 vs ML32. Panel F, SL138 vs SL32

圖3 干旱脅迫下兩份材料代謝通路圖中DEGs變化Fig.3 Changes of DEGs in the metabolic pathway of two material under drought stress注:A為C138中與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖;B為C138中氮代謝途徑相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖;C為C138苯并惡嗪類生物合成途徑DEGs表達(dá)熱圖補(bǔ)充;D為C32中與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖;E為C32中氮代謝途徑相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖;F為C138中苯并惡嗪類生物合成途徑相關(guān)的DEGs表達(dá)熱圖Note:Panel A is heat map of DEGs expression related to Alanine,aspartate and glutamate metabolism in C138; Panel B is heat map of DEGs expression related to nitrogen metabolism in C138; Panel C is heat map of DEGs expression related to benzoxazinoid biosynthesis in C138; Panel D is heat map of DEGs expression related to alanine,aspartate and glutamate metabolism in C32; Panel E is heat map of DEGs expression related to nitrogen metabolism in C32; Panel F is heat map of DEGs expression related to benzoxazinoid biosynthesis in C32

圖4 各材料及處理間樣品差異基因Top 20 KEGG富集圖Fig.4 Enrichment map of Top 20 KEGG differential genes among different materials and treatments注:A為CL138 vs ML138;B為CL138 vs SL138;C為CL32 vs ML32;D為CL32 vs SL32;E為ML138 vs ML32;F為SL138 vs SL32Note:Panel A, CL138 vs ML138; Panel B, CL138 vs SL138; Panel C, CL32 vs ML32; Panel D, CL32 vs SL32; Panel E, ML138 vs ML32; Panel F, SL138 vs SL32

C32中度干旱時(shí),有64個(gè)(43.54%)DEGs注釋到分子功能,其中富集極顯著的為谷氨酸合成酶活性[glutamate synthase (NADH) activity],核酸酶活性(nuclease activity)和鐵離子合成(iron ion binding);有22個(gè)(14.97%)DEGs注釋到細(xì)胞組分,只富集到葉綠體(chloroplast);有61個(gè)(41.49%)DEGs注釋到生物過程,其中富集極顯著的為谷氨酸生物合成過程(glutamate biosynthetic process),對(duì)藍(lán)光的響應(yīng)(response to blue light)和向光性(phototropism)。重度干旱時(shí)有187個(gè)(67.75%)DEGs注釋到生物過程,其中極顯著的為谷氨酸生物合成過程(glutamate biosynthetic process)和向光性(phototropism);有89個(gè)(32.24%)DEGs注釋到分子功能,其中極顯著的為谷氨酸合成酶活性[glutamate synthase (NADH) activity]和ADP結(jié)合(ADP binding)等,在細(xì)胞組分上無富集差異基因。

中度干旱時(shí)期,2個(gè)材料差異基因功能GO分析最顯著的主要集中于谷氨酸生物合成過程(glutamate biosynthetic process),谷氨酸合成酶活性[glutamate synthase (NADH) activity],鐵離子合成(iron ion binding)和半胱氨酸-tRNA氨基?；?cysteinyl-tRNA aminoacylation)等;重度干旱時(shí)期,2個(gè)材料差異基因功能GO分析最顯著的主要集中于傷害反應(yīng)(response to wounding),細(xì)胞對(duì)饑餓的反應(yīng)(cellular response to starvation)和對(duì)饑餓的反應(yīng)(response to starvation)。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG分析

KEGG Top20富集途徑顯示,中度干旱脅迫下C138中差異表達(dá)基因主要富集在光合作用天線蛋白(Photosynthesis-antenna proteins),卟啉與葉綠素代謝(Porphyrin and chlorophyll metabolism)和二萜類生物合成(Diterpenoid biosynthesis);C32中基因主要富集在氮代謝(Nitrogen metabolism),類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)和晝夜節(jié)律-植物(Circadian rhythm-plant);重度干旱脅迫下C138中差異表達(dá)基因主要富集在類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis);C32中基因主要富集在晝夜節(jié)律-植物(Circadian rhythm-plant),氮代謝(Nitrogen metabolism)和苯并惡嗪類生物合成(Benzoxazinoid biosynthesis)。

中度脅迫下,2個(gè)材料差異基因功能KEGG富集通路主要集中在氮代謝(Nitrogen metabolism)和丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism),在重度脅迫下,2個(gè)材料差異基因功能KEGG富集通路主要集中在苯并惡嗪類生物合成(Benzoxazinoid biosynthesis)。

通過對(duì)兩份材料中富集最顯著的3條代謝通路里的差異基因表達(dá)狀況繪制熱圖可以看出,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中(ko00250),C138在谷氨酸和天冬氨酸合成途徑中有差異基因富集,C32則在3個(gè)氨基酸代謝途徑中均有富集,其中,兩份材料的合成谷氨酸過程均由GLT1基因控制,其中TVU00531.1和TVT97435.1在兩份材料中均表達(dá),且表達(dá)模式相同,VAH79012.1在C138中不表達(dá),在C32中表達(dá)顯著,具體功能有待進(jìn)一步研究。兩份材料氮代謝途徑中(ko00910),均有L-谷氨酸的參與;屬于NRT的TVU34107.1基因在C138中參與硝酸鹽合成L-谷氨酸的過程,在輕度干旱下上調(diào)表達(dá),中、重度下調(diào)表達(dá),但在C32中,負(fù)責(zé)合成亞硝酸鹽,且在中度脅迫時(shí)高度表達(dá)。在苯并惡嗪類生物合成途徑中(ko00402),吲哚類物質(zhì)合成的BX1和BX2基因和表達(dá)模式大部分相同,但屬于BX2的OEL15381.1基因在C32中重度干旱下表現(xiàn)為上調(diào),輕度和中度先為下調(diào),在C138中不表達(dá)。VAH79012.1和OEL15381.1都在C138中不表達(dá),在C32中表達(dá)顯著,這些基因可能與狗牙根兩份材料之間的抗旱性差異有關(guān)。

2.5 干旱脅迫下差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的變化

將干旱脅迫下狗牙根葉片的差異表達(dá)基因與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(圖5),C138中鑒定出42個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其中26個(gè)下調(diào),16個(gè)上調(diào),包括轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的家族是AP2/ERF(9),bZIP(5),MYB(5)和WRKY(6)家族,大部分的上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF(5),bZIP(3)和MYB(3)家族,下調(diào)最多的轉(zhuǎn)錄因子屬于WRKY(5)和AP2/ERF(3)家族;C32中鑒定出39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子其中22個(gè)上調(diào),17個(gè)下調(diào),轉(zhuǎn)錄因子最多的家族是MYB(5),AP2/ERF(4)和bHLH(4)家族,大部分的上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子屬于MYB(4)和AP2/ERF(3)家族,下調(diào)最多的轉(zhuǎn)錄因子屬于bHLH(3),GARP-G2(3)和Tify(3)家族。其中有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是兩個(gè)材料所共有的,包括AP2/ERF(3),bZIP(1)和MYB(1)家族。如圖5C所示,除c475644.graph_c0(AP2/ERF)基因在CL138中下調(diào)表達(dá),其他基因均上調(diào)表達(dá),尤其是c474046.graph_c0(MYB)基因在SL32和ML32中上調(diào)表達(dá)明顯。

圖5 干旱脅迫下狗牙根葉片差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的分布Fig.5 The histograms show the number of up- and down-regulated transcription factors注:A為Cd138葉片;B為Cd32葉片;C為共表達(dá)差異基因DEG-TF的分級(jí)聚類Note:Panel A is histogram of C138 leaf transcription factors; Panel B is histogram of C32 leaf transcription factors; Panel C is hierarchical clustering of DEG-TF co-expression genes

2.6 干旱脅迫下差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的變化

為驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性,隨機(jī)挑選6個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。如表1所示,使用上海生物工程有限公司平臺(tái)設(shè)計(jì)引物,3次技術(shù)重復(fù),以Actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。由圖6可知,6個(gè)基因在干旱脅迫下表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致,說明測(cè)序結(jié)果有效。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Fig.6 Results of real-time fluorescent quantitative PCR

3 討論

本研究結(jié)果顯示,受到干旱脅迫后,敏旱型C32干旱脅迫響應(yīng)基因數(shù)為2 031個(gè),大于抗旱型C138干旱脅迫響應(yīng)基因數(shù),尤其是在重度干旱脅迫下。Fracasso等[23]對(duì)兩種不同耐旱程度高粱(Sorghumbicolor)研究發(fā)現(xiàn),敏旱型高粱中有更多的差異基因表達(dá),與本研究結(jié)果一致。Kim等[24]對(duì)狗牙根幼苗進(jìn)行干旱轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)干旱處理3,6,9 d的上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)基因,這與本研究結(jié)果一致。冷暖等[13]對(duì)干旱脅迫15 d草地早熟禾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)有52.25%的差異基因上調(diào)表達(dá);但張然等[25]對(duì)草地早熟禾抗旱材料10-202和敏旱材料09-61進(jìn)行干旱3 d后的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),10-202材料有3 166個(gè)差異基因表達(dá),09-61中有314個(gè)基因表達(dá)。這可能與干旱脅迫的時(shí)間和材料所處的物候期有關(guān),具體原理還需進(jìn)一步分析。本研究中,兩個(gè)材料脅迫時(shí)上調(diào)基因數(shù)目都有所增加,說明干旱脅迫下狗牙根葉片可能是通過基因的正調(diào)控來響應(yīng)干旱的。

光合作用對(duì)植物生長和適應(yīng)干旱脅迫具有重要意義。干旱脅迫通過抑制光合作用,降低植物碳水化合物的產(chǎn)生,減少植物生長和代謝所需的能量供給,使植物無法抵御外界的傷害。嚴(yán)平等[26]研究認(rèn)為干旱脅迫下的小麥光合作用下降主要是由于氣孔導(dǎo)度下降所導(dǎo)致;但Boyer等[27]認(rèn)為,光合器官對(duì)光合作用的影響至關(guān)重要,光合作用下降主要是由于光合器官葉綠素的解體[28]、光系統(tǒng)II活性下降[29],而且葉綠體是植物中產(chǎn)生活性氧的主要場(chǎng)所。本研究顯示中度干旱脅迫下,C138GO功能最富集的為蛋白質(zhì)-發(fā)色團(tuán)連鎖、光合作用和采光,葉綠體類囊體膜、葉綠素合成、光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II,而在C32中則富集較少甚至都沒有富集到這些。張一龍等[30]研究結(jié)果表示,干旱脅迫下C138保持較高的類胡蘿卜素含量來應(yīng)對(duì)干旱,其葉綠素含量也高于C32,說明可能是C138受到干旱脅迫時(shí),在光合作用相關(guān)植物器官上富集了更多的基因,能生成更多的ATP、葉綠素和類胡蘿卜素來抵御干旱。

光合作用抑制主要是由于早期或輕度干旱脅迫期間的氣孔關(guān)閉,而在暖季草坪草中,長時(shí)間干旱后代謝作用的限制可能更為重要。草地早熟禾耐旱品種‘Midnight’在長期干旱(10至15 d)復(fù)水后光合能力迅速恢復(fù)到對(duì)照水平,可能是因?yàn)楣夂献饔霉烫际軗p較少[31];肖烈等[32]發(fā)現(xiàn),白羊草可以通過提高體內(nèi)碳水化合物含量(如淀粉、可溶性糖)來應(yīng)對(duì)不同程度的干旱脅迫。Hu等人[33]表示,與敏旱型狗牙根C299相比,耐旱型狗牙根Tifway光合作用能力要更強(qiáng),這主要是由于Tifway具有更穩(wěn)定的碳同化產(chǎn)物。本研究顯示重度干旱脅迫下,C138大部分顯著富集到了碳水化合物代謝過程、細(xì)胞糖代謝過程、碳水化合物代謝調(diào)控過程等能量代謝過程,C32大部分顯著富集在DNA分解過程、DNA整合、ADP結(jié)合、DNA分解過程等細(xì)胞分裂過程。這與張一龍等[34]研究結(jié)果一致,即C32中度脅迫時(shí)的葉寬與重度脅迫相比變化不顯著,而C138在干旱下比C32有更多的碳水化合物合成。

植物次生代謝產(chǎn)物在其應(yīng)對(duì)極端環(huán)境時(shí)在自身保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)上充當(dāng)著重要角色。Chen等[35]對(duì)5種不同低溫處理下的葉片的轉(zhuǎn)錄組分析表明,光合作用、氮代謝和碳固定途徑在狗牙根對(duì)冷脅迫的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。也有研究表明干旱特別是在長期干旱脅迫下,羊草葉片中氮合成代謝的關(guān)鍵酶活性顯著降低[36]。Brini等[37]在對(duì)擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究中認(rèn)為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)是植物氮分配的主要機(jī)制,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)滲透脅迫有重要作用。王玉斌等人[38]對(duì)不同抗旱型高粱的研究顯示,耐旱型高粱中KEGG途徑顯著富集在苯丙氨酸合成等氨基酸滲透保護(hù)途徑上。李春燕等人[39]對(duì)干旱脅迫下白羊草苗期葉片進(jìn)行基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),類黃酮化合物生物合成在葉片中顯著富集。本研究顯示,C138和C32干旱脅迫響應(yīng)基因在二萜類生物合成、苯并惡嗪類生物合成、類黃酮生物合成、氮代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、組氨酸代謝、氨基酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝通路上有所富集,可見狗牙根的干旱脅迫響應(yīng)通路主要涉及生物合成和生物次級(jí)代謝。C32干旱脅迫基因顯著富集在氮代謝上,所以氮代謝可能是C32應(yīng)對(duì)干旱脅迫的主要途徑之一;C138中,干旱脅迫基因主要富集在光合作用蛋白、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝上。所以,C138可能通過積累可溶性糖和氨基酸(如丙氨酸,谷氨酸)等滲透壓物質(zhì)來應(yīng)對(duì)干旱脅迫。

通過測(cè)序分析,本研究一共獲得了來自18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的81個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中AP2/ERF家族基因數(shù)量最多。Zhu等人[40]對(duì)抗寒和不抗寒兩種狗牙根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),AP2轉(zhuǎn)錄因子高度表達(dá)是狗牙根抗寒的重要因素。Matuskura等[41]發(fā)現(xiàn),在擬南芥中過量表達(dá)水稻(Oryzasativa)OsDREB2B基因,提高了擬南芥對(duì)干旱和熱脅迫的耐受性。吳婧等人[42]研究發(fā)現(xiàn),ERF同源基因在干旱處理的蒙古冰草(Agropyronmongolicum)中表達(dá)差異顯著。本研究中3個(gè)AP2/ERF基因在干旱脅迫下的狗牙根中均高度表達(dá),其中1個(gè)基因在CL138中不表達(dá),在ML138和SL138中均高度表達(dá),但在C32中未見明顯變化。說明AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可能受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),但干旱脅迫下狗牙根AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子未見詳細(xì)研究,此前狗牙根AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大部分集中在抗寒方面,所以AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可能是狗牙根抗旱關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。

4 結(jié)論

狗牙根受到干旱脅迫時(shí)敏旱材料響應(yīng)基因數(shù)量更多,且主要通過基因的正調(diào)控來響應(yīng)干旱。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250),氮代謝(ko00910)和苯并惡嗪類生物合成(ko00402)中的特異性差異表達(dá)基因可能是狗牙根應(yīng)對(duì)干旱脅迫的關(guān)鍵基因。C138受到干旱脅迫時(shí)有更多的光合作用相關(guān)基因響應(yīng),氮代謝可能是C32應(yīng)對(duì)干旱脅迫的主要途徑之一。中度脅迫下狗牙根抗旱可能與光合作用和碳水化合物合成有關(guān),重度脅迫下次生代謝和滲透保護(hù)可能是狗牙根抗旱的重要富集途徑。