含骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的骨修復(fù)水凝膠的研究進(jìn)展

李芷儀，仉建國，王升儒

骨骼是人體重要的組成部分，承載了保護(hù)、運動、代謝等重要生理功能。外傷或某些疾病可能會造成骨缺損，影響骨的正常生理功能。對于較小的骨缺損，機體可以通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stemcells, BMMSCs）分化、成骨細(xì)胞活性增加等方式進(jìn)行膜內(nèi)成骨及軟骨骨化，從而完成骨修復(fù)。但如果骨缺損較大，并達(dá)到了骨修復(fù)的臨界大小，僅依靠機體自身的骨再生能力很難達(dá)到預(yù)期效果，因此需要額外的骨修復(fù)材料。此外，對于需要進(jìn)行骨融合術(shù)（如關(guān)節(jié)融合術(shù)或者脊柱融合術(shù)）的患者，若目標(biāo)關(guān)節(jié)或者脊柱不能在一定時間內(nèi)達(dá)到骨融合，內(nèi)固定物將受到過大的應(yīng)力載荷而面臨內(nèi)固定失敗的風(fēng)險。在上述情況下，多需要使用促骨修復(fù)材料以達(dá)到更好的骨修復(fù)效果。

臨床上現(xiàn)有的骨修復(fù)材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”為自體骨移植，多選用髂骨或肋骨。自體骨移植因取材量受限，并給患者帶來二次創(chuàng)傷[1]，臨床應(yīng)用受限。其他的骨修復(fù)材料包括同種異體骨、異種骨及人工合成骨：同種異體骨主要來源于尸體骨，雖然避免了移植物部位疼痛、傷口不愈合等并發(fā)癥問題，但其來源較為有限，促骨修復(fù)效應(yīng)也較差，并存在排異、感染等風(fēng)險；異種骨主要為去細(xì)胞去蛋白的小牛骨，但其促骨修復(fù)效應(yīng)較差；人工合成骨主要包括生物陶瓷、磷酸鈣/硫酸鈣骨水泥等，但其脆性較大，促骨修復(fù)效應(yīng)較差。此外，在臨床應(yīng)用中，骨移植物需要固定于移植部位，而上述4種骨修復(fù)材料均為塊狀或粉末狀，常因周圍血流沖刷而移位，降低骨修復(fù)效應(yīng)，甚至導(dǎo)致異位骨化。為了解決上述問題，新型骨修復(fù)材料的研發(fā)具有重要的意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic protein, BMP）在骨修復(fù)過程中起重要作用，而某些種類的水凝膠具有高生物相容性、固定活性物質(zhì)、填充骨缺損的優(yōu)勢，其作為活性因子載體具有一定的臨床應(yīng)用前景。目前，已有多項研究針對含BMP-2的骨修復(fù)水凝膠開展研發(fā)工作，本文將對其研究現(xiàn)狀及存在的問題進(jìn)行綜述。

1 BMP-2在骨修復(fù)中的應(yīng)用

BMP蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族中最大的亞類，共分為18類，在機體內(nèi)參與不同的信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中，很多研究均已表明BMP-2具有很強的骨誘導(dǎo)能力[2]和促血管生成能力[3]，可以誘導(dǎo)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，加速骨缺損等修復(fù)。

研究者已開發(fā)了用基因重組方法制備重組人BMP-2（recombinant human BMP-2, rhBMP-2）[4]。臨床上也已有一些產(chǎn)品將BMP-2作為促骨修復(fù)的活性材料使用，例如美敦力公司2002年開發(fā)的INFUSE@骨移植物就是將rhBMP-2與可吸收的膠原蛋白海綿進(jìn)行復(fù)合，在骨缺損原位釋放BMP-2達(dá)到促骨修復(fù)效應(yīng)，美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)INFUSE@產(chǎn)品用于脊柱椎體融合、新鮮脛骨骨折、口腔頜面骨移植等領(lǐng)域。值得注意的是，局部BMP-2濃度過高可能會引發(fā)炎癥反應(yīng)、血腫、感染等并發(fā)癥，且如果BMP-2到達(dá)除骨缺損的其他部位，也會造成異位骨化等并發(fā)癥[5]。INFUSE@產(chǎn)品中，由于BMP-2與膠原蛋白海綿僅為物理吸附，植入后會在短時間內(nèi)大量釋放BMP-2，導(dǎo)致局部BMP-2濃度過高，可能引發(fā)炎癥反應(yīng)和異位骨化等并發(fā)癥；此外，由于骨修復(fù)通常需要6個月左右的時間，短時間內(nèi)釋放大量活性物質(zhì)，而后續(xù)骨缺損部位缺少活性物質(zhì)刺激，成骨性能將極大降低；最后，由于膠原蛋白海綿容易受血流沖刷而移位，并且不能精準(zhǔn)適配骨缺損部位形態(tài)，增加了臨床中使用該骨修復(fù)材料的困難。因此，需要尋找一個更好的BMP-2載體，在固定BMP-2于骨缺損部位的同時減少因局部BMP-2濃度過高帶來的副作用，以滿足臨床中對促骨修復(fù)材料的需求。

2 用于骨修復(fù)材料的水凝膠基質(zhì)

近年來，水凝膠材料作為生物活性物質(zhì)載體材料受到較大關(guān)注。它是一種主要由親水高分子聚合物長鏈構(gòu)成的3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)材料，水含量很高，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)十分相似，因此具有很高的生物相容性能，并被證實具有很好的可降解性能和骨傳導(dǎo)性能[6]。已有一些研究開始應(yīng)用水凝膠骨修復(fù)材料，由于水凝膠是一種高生物相容性的載體材料，研究表明其不僅可以負(fù)載促骨生成藥物或活性蛋白，還可以作為干細(xì)胞生長黏附基質(zhì)。骨修復(fù)材料中常用水凝膠基質(zhì)材料種類見表1。

表1 骨修復(fù)材料常用水凝膠基質(zhì)種類

大多數(shù)原始天然水凝膠的生物相容性較高，具有很好的信號傳導(dǎo)能力，其本身就有一定的促骨修復(fù)能力，但機械強度較差，降解過程與速率多不可控，需要通過氧化或復(fù)合等方法進(jìn)行改性。透明質(zhì)酸是較為常用的水凝膠基質(zhì)材料之一，作為人體真皮結(jié)締組織、關(guān)節(jié)液和牙髓等的組成部分之一，透明質(zhì)酸維持了細(xì)胞外基質(zhì)的黏彈性[24]。細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸通過與BMMSCs表面的CD44標(biāo)記作用，促進(jìn)了BMMSCs的遷移，能在一定程度上促進(jìn)骨再生[25]。此外，透明質(zhì)酸可以做成可注射水凝膠形態(tài)，能夠較好填充于骨缺損部位進(jìn)行修復(fù)[26]。人工水凝膠可通過人工合成或?qū)⒍嚯母男缘玫綑C械強度更高、降級速率可控且生物相容性相對降低的水凝膠基質(zhì)。RADA16水凝膠由16個親水或疏水氨基酸組成，具有較高的生物相容性和可降解性能，其降解過程不會引起炎癥反應(yīng)，因此已經(jīng)被應(yīng)用于神經(jīng)修復(fù)、韌帶修復(fù)、骨修復(fù)等多個領(lǐng)域[27]。此外，RADA16水凝膠的多肽結(jié)構(gòu)可以通過生物化學(xué)反應(yīng)將各種活性蛋白或生物因子錨定在RADA16水凝膠的C端[27]。

水凝膠作為BMP-2在體內(nèi)原位釋放的載體，可將BMP-2固定于骨缺損部位、填充骨缺損部位，并且可以制成可注射水凝膠載體注射到骨缺損部位并原位成型，可完美適配骨缺損部位不規(guī)則的形態(tài)，使活性物質(zhì)BMP-2與松質(zhì)骨表面緊密接觸，誘導(dǎo)BMMSCs分化和成骨細(xì)胞活性功能最大化[28]。但選用上述單一水凝膠充當(dāng)載體很難達(dá)到生物相容性和力學(xué)性質(zhì)都優(yōu)良的理想狀態(tài)。因此，現(xiàn)有研究多集中于材料復(fù)合改善水凝膠基質(zhì)的性能，包括將不同水凝膠進(jìn)行復(fù)合以提升水凝膠的綜合性能，或?qū)⑺z與其他硬材料支架進(jìn)行結(jié)合，在提升支架生物相容性的同時彌補了水凝膠材料力學(xué)性能較差的天然劣勢。例如海藻酸鹽雖然具有弱細(xì)胞毒性、低成本、易于凝膠化、良好兼容性等優(yōu)點，但其缺乏生物結(jié)合位點，使其負(fù)載活性物質(zhì)的能力不足；而膠原蛋白的生物相容性高、細(xì)胞黏附性好，但機械性能稍差。有研究將海藻酸鹽與膠原蛋白進(jìn)行復(fù)合，綜合二者優(yōu)點，形成具有高生物相容性、低細(xì)胞毒性、可控力學(xué)性能的新型凝膠，負(fù)載BMP-2后形成的活性復(fù)合水凝膠可進(jìn)行原位BMP-2釋放，以達(dá)到促骨修復(fù)的作用；該研究還將活性復(fù)合水凝膠與可降解聚乳酸支架進(jìn)行復(fù)合，形成活性復(fù)合支架，能夠在骨修復(fù)尚未完成的早期為骨缺損部位提供力學(xué)支撐，保留缺損骨的力學(xué)支撐功能[14]。也有研究將含rhBMP-2和磷酸三鈣（tricalcium phosphate, TCP）的去細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)凝膠與可降解的聚己內(nèi)酯硬材料支架進(jìn)行復(fù)合，形成具有高促骨再生能力的支架，將有望應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)。雖然使用水凝膠材料作為載體材料可以將BMP-2固定在骨缺損部位，但單純物理混合仍然不能規(guī)避BMP-2因局部濃度過高可能導(dǎo)致的副作用[19]。

3 含BMP-2的骨修復(fù)水凝膠的常用添加物

為減少水凝膠中BMP-2的總量以規(guī)避局部濃度過高所帶來的副作用，同時達(dá)到相近的促骨再生效應(yīng)，常需要在水凝膠中加入其他促骨再生的物質(zhì)。常用添加物見表2。

表2 含BMP-2的骨修復(fù)水凝膠的常用添加物

由于BMP-2釋放時間較短，而骨修復(fù)至少需要6個月左右的時間，當(dāng)骨修復(fù)材料中的BMP-2釋放完的后續(xù)骨修復(fù)缺乏活性物質(zhì)引導(dǎo)，因此考慮加入其他持續(xù)時間較長的促骨再生的物質(zhì)，以補充BMP-2的骨修復(fù)能力，同時降低BMP-2的使用量。局部較高的鈣濃度有助于促骨形成[37-38]，而且無機物通常不易被血液沖刷到別處，可有效提高局部組織鈣濃度，可以在BMP-2釋放完的后續(xù)較長時間內(nèi)有效促進(jìn)骨再生。雙膦酸鹽是抗骨吸收的一類新藥，已有研究報道在骨缺損部位應(yīng)用雙膦酸鹽可促進(jìn)骨再生[39]。還有研究表明，氧化石墨烯可以誘導(dǎo)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化[33]，具有一定的促骨再生能力。除增加其他促骨再生物質(zhì)外，也有增加促血管再生物質(zhì)（如去鐵胺和VEGF）以保證骨缺損部位血供充足，進(jìn)而提高促骨再生的速率。而SDF-1可以將BMMSCs和造血干細(xì)胞誘導(dǎo)至骨缺損部位[40]，再結(jié)合BMP-2的骨誘導(dǎo)能力，能夠更好地發(fā)揮材料的促骨再生能力。

4 水凝膠控制BMP-2釋放速率策略

在控制水凝膠基質(zhì)中BMP-2釋放速率方面，主要有兩種策略：①通過物理/化學(xué)作用力將BMP-2與載體結(jié)合，包括化學(xué)鍵結(jié)合、物理吸附、微球（mineral-coated microspheres, MCMs）包裹；②基因工程改性法。

4.1 化學(xué)鍵結(jié)合

相關(guān)報道主要將BMP-2用化學(xué)鍵連接至水凝膠的高分子上，例如可以通過膠原蛋白連接域[41]、多巴胺[8]、BMP-2的N端轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物結(jié)構(gòu)域[42]等結(jié)構(gòu)進(jìn)行連接，使BMP-2局部富集，以減少擴(kuò)散至周圍組織造成異位骨化，減少材料中整體BMP-2的含量。本方法可以使BMP-2的釋放速度與水凝膠基質(zhì)的降解速率呈正比，以降低BMP-2的釋放速率，使促骨再生效應(yīng)得以持續(xù)。除了直接將BMP-2連接到水凝膠基質(zhì)上，也有研究將BMP-2連接在肝素[15]或通過肝素連接至碳酸鈣微球表面，可以通過改變肝素含量對BMP-2的釋放進(jìn)行控制。

4.2 物理吸附

氧化石墨烯具有較大的比表面積和低生物毒性，可通過靜電吸附、氫鍵、π-π堆疊等物理作用力吸附藥物，已作為藥物輸送和功能生物材料的納米載體被廣泛報道[43]。有研究將氧化石墨烯作為BMP-2載體，實現(xiàn)BMP-2的可控釋放，預(yù)計在植入材料后8周均有持續(xù)的促骨再生能力及抗炎能力[8,33]。

4.3 MCMs包裹

Gong等[31]使用肝素將BMP-2封裝于碳酸鈣MCMs上，并將其與纖維蛋白水凝膠進(jìn)行混合。研究表明，此類新型水凝膠可局部控制BMP-2釋放的速度，從而延長活性材料的促骨再生效應(yīng)。Xu等[44]通過靜電吸附作用將BMP-2錨定于負(fù)載無機鹽的MCMs，并與殼聚糖-聚乙二醇水凝膠進(jìn)行交聯(lián)形成殼聚糖/聚乙二醇-負(fù)載礦物質(zhì)的微球@BMP-2水凝膠（chitosan/polyethylene glycol-MCM@BMP-2 gel,CS/PEG-MCM@BMP-2 gel），由于MCMs具有較好的蛋白結(jié)合能力及可控降解性能，體外試驗結(jié)果顯示第75日的CS/PEG-MCM@BMP-2 gel僅釋放30.5%±3.6%，可用于BMP-2的運送與局部緩釋。

4.4 基因工程改性法

基因工程改性法主要指基于基因轉(zhuǎn)移的基因工程。通過將BMP-2基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，可獲得BMP-2的持續(xù)釋放、保證BMP-2的生物活性，同時可以減少BMP-2的初始負(fù)載量，從而規(guī)避可能的副作用[45]。Lin等[46]利用慢病毒在體外將BMP-2基因轉(zhuǎn)染至人BMMSCs，并利用可見光投影立體光刻技術(shù)將其與水凝膠支架進(jìn)行混合，可達(dá)到長時間（56 d）釋放BMP-2，在體內(nèi)/體外試驗中表現(xiàn)出高效的促骨再生性能。

綜上，含BMP-2的活性水凝膠材料還存在以下問題：①材料降解及BMP-2釋放速率與骨再生速率不匹配；②材料促骨再生能力有限；③BMP-2因局部濃度過高或滲透到別的組織中可能導(dǎo)致的副作用；④BMP-2釋放速率不能達(dá)到持續(xù)小劑量釋放的理想狀態(tài)。

5 小結(jié)與展望

BMP-2有很強的骨誘導(dǎo)能力和促血管生成能力，很適合作為促骨再生的活性物質(zhì)。而水凝膠材料因其良好的生物相容性被廣泛應(yīng)用于生物材料基質(zhì)中。本文總結(jié)了研究中常用的水凝膠基質(zhì)種類，以及為降低BMP-2可能副作用的材料改性方法。

現(xiàn)有活性水凝膠機械強度差，無法承載應(yīng)力，且控制BMP-2釋放時間的能力仍需提升。除了文中提到的材料改性方法，結(jié)合其他領(lǐng)域材料制備加工方法，可以考慮用納米材料對水凝膠進(jìn)行改性。納米材料比表面積大，具有較好的吸附性能，可采用納米材料（如碳納米管、石墨烯、MXene等）包覆BMP-2蛋白，實現(xiàn)BMP-2的可控釋放。此外，可結(jié)合靜電紡絲或3D打印等方法制備管狀結(jié)構(gòu)、內(nèi)填水凝膠，結(jié)合外層材料的機械性能和活性水凝膠的促骨再生活性，有望更好地進(jìn)行骨缺損修復(fù)。若提升相關(guān)材料性能，含BMP-2的骨修復(fù)水凝膠可用于椎間融合、棘突間融合、關(guān)節(jié)間融合、較大部位骨缺損、骨質(zhì)疏松部位修復(fù)等，為骨缺損修復(fù)臨床工作提供更優(yōu)方法。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突